Fördelarna med akteosid - behandla glioblastom

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

TAE WOONG HWANG;DONG HUN KIM; DA BI KIM1;TAE WON JANG;GUN‑HWA KIM;MINHO MOON;KYUNG AH YOON;DAE EUN CHO;JAE HO PARK;JWA-JIN KIM

1. Introduktion

Glioblastomär den vanligaste typen av maligna primär hjärntumör och den mest invasiva och förödande primära hjärntumören (1,2), med en medianöverlevnadsfrekvens på ~18 månader med aggressiv multimodalitetsterapi. Aktuella behandlingsbeslut är begränsade och inkluderar strålning, kemoterapi och kirurgi i kombination med alkyleringsmedlet temozolomid (TMZ) (3,4). Trots tillgången på aggressiva terapier, patienter medglioblastomhar generellt dålig prognos (5). TMZ är det viktigaste kemoterapeutiska läkemedlet som används vid klinisk behandling av malignaglioblastom(6-8); som ett alkyleringsmedel i serien kan det penetrera blod-hjärnbarriären (9-11). Under malignt glioblastomprogression och omfattande invasion i hela hjärnan, minskar stadigt ökad läkemedelsresistens mot TMZ dess terapeutiska effekt (12,13). Följaktligen nya terapeutiska läkemedel att motverkaglioblastomsökes omedelbart.

Tidigare studier har rapporterat att gliomceller genomgår celldöd via autofagi, eller typ II programmerad celldöd, som svar på TMZ (14,15). Autofagi kan hämmas av 3-metyladenin (3-MA) ​​genom omvandlingen av mikrotubuli-associerat protein 1 lätt kedja 3 (LC3)-I till LC3-II, vilket reducerarglioblastomcelldöd (16,17); autofagins roll är dock beroende av det cellulära sammanhanget. Med undantag för en cytotoxisk roll under TMZ-verkan, är induktionen av autofagi av cellulär stress en cytoprotektiv process som eliminerar stressinducerade cytoplasmatiska aggregat, organeller och makromolekyler i däggdjursceller genom det lysosomala systemet. I sin tur får celler som är involverade i att upprätthålla homeostas energi genom dessa kataboliska processer (18,19). Autofagins komplexa roller tyder på att en autofagiaktivator kan ha anticancereffekter i kombination med TMZ-behandling genom att induceraglioblastomcellautofagi utan att utöva skadliga effekter eller ge fördelar för normala vävnader. Notera att TMZ har uppvisat synergistiska terapeutiska effekter i kombination med vitamin D, inklusive undertryckt cellviabilitet och förbättrad autofagi iglioblastomceller. Dessutom har kombinationen av TMZ och vitamin D visat sig ha anticancereffekter in vivo, inklusive minskad tumörstorlek och förlängd överlevnad. Dessa studier tyder på att kombinationsbehandling kan ha synergistiska anticancereffekter via autofagiska mekanismer i TMZ-baseradeglioblastomterapi (15).

Akteosidär en fenyletanoidglykosid som är allmänt spridd i flera tonifierande traditionella kinesiska örtmediciner (20,21). Ett antal farmakologiska effekter, inklusive antioxidanter, anticancer, antiinflammatoriska, antinefritiska och antimetastatiska effekter, har associerats medakteosid(22–24). Tidigare studier har visat detakteosidhar skyddande effekter mot koltetraklorid- och D-galaktosamin-inducerad leverskada. De mekanismer som ligger bakom de skyddande effekterna av akteosid är sannolikt relaterade till dess förmåga att hämma P450-medierad bioaktivering och fria radikaler inducerade av exponering för koltetraklorid (25,26).

Därför tyder bevis på att bådaakteosidoch TMZ inducerar anticancereffekter genom celldöd. Men deras association och anticancereffekter i samband medglioblastomåterstår att belysa. Därför var syftet med denna studie att verifiera de synergistiska anticancereffekterna avakteosidkombinerat med TMZ inglioblastomterapi. En cellviabilitetsanalys utfördes för att analysera anticancereffekterna av kombinationsbehandlingen i C6glioblastomceller (en råttaglioblastomcellinje), och resultaten jämfördes med de efter behandling med enbart TMZ. För att ytterligare undersöka mekanismen för celldöd orsakad av sambehandling medakteosidoch TMZ, apoptos och autofagirelaterade gener i C6-celler undersöktes.

akteosid antitumör

2. Material och metoder

Cell kultur:

C6-råttanglioblastomcellinje köptes från American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Cellerna odlades under sterila förhållanden vid 37˚C i en fuktig miljö med 5 procent CO2 i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10 procent fetalt bovint serum (FBS) och 1 procent antibiotika och antimykotika (alla Welgene, Daegu) , Korea).

Växtmaterial:

Abeliophyllum distichum Nakai [kupong nr. Park1001(ANH)] samlades in i Misun-hyang Theme Park, Seongbul-Mountain Recreation Forest, Korea.

Kallusinduktion:

För att inducera kallusbildning (27) isolerades 1-cm2 bladexplantat från de färska plantorna. Explantatet odlades på Murachige- och Skoog-medium (4 procent sackaros, 0,9 procent agar kompletterat med 1 mg/l naftalenättiksyra och 1 mg/l 2,4-diklorfenoxiättiksyra, pH 5,7) vid 25˚C. Kallusen inducerades 20 dagar senare. En tillräcklig mängdakteosiderhölls genom subkultur för att separera och renaakteosidfrån kallus (fig. 1). Olika partier av renadeakteosidanvändes i varje experiment. Varje experiment utfördes tre gånger med användning av en annan sats.

Isolering och rening:

Etylacetatfraktionerna koncentrerades i vakuum och användes som ett prov för rening av akteosid.Akteosidisolerades och renades med Accelerated Chromatography Isolation-systemet (Isolera™ Spektra, Biotage, Uppsala, Sverige) med användning av SNAP KPHOSPHO-SIL och SNAP Ultra Cartridges (Biotage). Deakteosidrenad från kallus analyserades kvantitativt med användning av standardakteosiden genom HPLC-PDA-analys. Slutligen erhölls akteosid av större än eller lika med 95 procent renhet från kallus och användes som ett prov för kemoterapi av temozolomidbaseradglioblastom.

3-(4,5-dimetyltiazol-2-l)-,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analys:

För att identifiera den halvmaximala hämmande koncentrationen av TMZ (IC50-värde) mot C6-celler, såddes 1x104 celler i encellssuspensioner i individuella brunnar på 96-brunnars plattor och inkuberades i 24 timmar vid 37˚C före TMZ-behandling vid den angivna koncentrationer (1, 5, 10 och 20 mM) vid 37˚C i 24 timmar. Efter bestämning av TMZ IC50-värdet som 5 mm, behandlades cellerna i 24 timmar med 5 mM TMZ, 50 µMakteosideller en kombination av de två (5 mM TMZ och 50 µMakteosid). MTT-lösning (5 mg/ml) sattes till varje brunn (10 µl) och odlades vid 37˚C i 2 timmar. Därefter avlägsnades mediet och DMSO tillsattes i en volym av 200 ul vardera och reagerade vid rumstemperatur under 30 min. Absorbansen vid 595 nm mättes för att bestämma cellviabilitet.

Sårläkningsanalys:

En C6-cellsuspension i 1 ml odlades i en 12-brunnars platta och odlades till konfluens. Cellerna behandlades med TMZ,akteosid, eller TMZ plusakteosidoch repade sedan med en steril 10‑µl pipettspets för att skapa ett konstgjort sår. Vid 0 och 24 timmar efter sårtagningen togs digitala bilder av sårläkningsprocessen med ett inverterat mikroskop. Cellmigrering kvantifierades genom att mäta storleken på ärret vid 0 och 24 timmar med hjälp av programvaran för bildanalys, ImageJ 1.43u/Java1.6.0_22 programvara (NIH, Bethesda, Maryland, USA). Varje experiment utfördes tre gånger och mätningarna utfördes i tre exemplar.

Immunblotting:

C6-cellerna behandlades med TMZ,akteosid, eller TMZ plusakteosidi 24 timmar. Celler lyserades på is av RIPA (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 procent Nonidet P-40, 1 procent natriumdeoxicholat, 0,1 procent SDS) lysbuffert kompletterat med proteas och fosfatashämmare cocktail (Roche, Basel, Schweiz) i 30 min. Efter centrifugering vid 18 341 xg under 15 minuter vid 4°C erhölls supernatanten. Proteinkoncentrationen bestämdes med hjälp av Bradford Protein Assays (Bio-rad, Hercules, CA, USA). Lika mängder av totala proteiner (30 µg) laddades i enstaka brunnar och fraktionerades via elektrofores via en 10-15 procent SDS-PAGE. Proteinerna elektrotransfererades till polyvinylidendifluoridmembran (EMD Millipore, Bedford, MA, USA). Efter inkubation i blockerande lösning innehållande 5 procent fettfri mjölk i Tween/Tris-buffertsaltlösning i 30 minuter vid rumstemperatur. Blotterna undersöktes med 1:1,000-utspädda primära antikroppar (kat.nr. 9662, kaspas 3; Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA), B0-cellslymfom 2 (sc-cellslymfom 2) 7382, Bcl-2), Bcl-2-associerat X-protein (kat. nr. 2772, Bax), fosforylerat (p-)p53 (sc-101762), totalt-p53 (sc-6243), -aktin (kat. nr 4970; alla; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA), LC‑3 (L8918, Sigma; Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland), Rab7 (kat.nr 9367, Cell Signaling Technology, Inc. ), p62 (kat. nr. 114), p-p38 (kat. nr. 9211), total-p38 (kat. nr. 9212), p-c-Jun N-terminalt kinas (kat. nr. 9251, s. ‑JNK), total-JNK (kat.nr 9252), p‑extracellulärt signalreglerat kinas (kat.nr 9101, p‑ERK), total-ERK (kat.nr 9102; all Cell Signaling Technology, Inc. .) över natten vid 4˚C. Detta följdes av inkubation med pepparrotsperoxidas-konjugerade sekundära antikroppar (1:2,000; LF-SA8001A, Goat Anti-Mouse IgG-HRP) eller LF-SA8002A (Goat Anti-Rabbit IgG), AB-HRP Frontier, Seoul, Korea.) i 2 timmar vid rumstemperatur. Proteinerna visualiserades sedan genom exponering för Chemi‑Doc (Bio‑Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA).

Immunfluorescensfärgning:

Lysosomalassocierat membranprotein 1 (LAMP1) och LC3 är markörer för lysosomal och autofagi. Cellerna (1x105 celler/brunn) preparerades på steriliserade täckglas (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) i tre exemplar. Efter behandling med TMZ,akteosid, eller TMZ plusakteosidunder 24 timmar fixerades cellerna i 4 procent paraformaldehyd i 30 min, blockerade med 5 procent normalt kycklingserum (S-3000; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA), 0,1 procent Triton X ‑100 och inkuberades sedan 1 timme för permeabilisering och för att blockera icke-specifika protein-proteininteraktioner. Cellerna inkuberades sedan med anti-LAMP1 (1:200; sc-19992, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) och anti-LC3 (1:400; PM036, MBL International, Woburn, MA, USA) över natten vid 4˚ C. Cellerna tvättades sedan två gånger med PBS och inkuberades i ytterligare 2 timmar i mörker med en blandning av Alexa Fluor 488 och 594 sekundära antikroppar (1:200; Alexa Fluor 488 (A-11008) och 594 (A-11007), Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) och tvättades igen med PBS. Kärnorna färgades med 4,6-diamidino-2-fenylindol (Sigma; Merck KGaA) och tvättades sedan två gånger med PBS. Objektglasen monterades sedan och bilderna togs under ett LSM-700 laserkonfokalmikroskop.

Figur 1. Akteosids kemiska struktur.

Flödescytometri.

Cellerna analyserades med avseende på Mitotracker Green och MitoSOX genom flödescytometri med användning av en FACSCanto II flödescytometer, enligt tillverkaren (BD Biosciences). Efter två tvättar med PBS fixerades cellerna i 4 procent paraformaldehyd under 3 0 minuter vid rumstemperatur och permeabiliserades med 0,25 procent Triton X-100 i PBS under 20 minuter. Cellerna färgades med primära antikroppar över natten vid 4˚C (1:200) och sedan med sekundära antikroppar under 1 timme på is. Efter två tvättar med PBS fixerades cellerna i 4 procent paraformaldehyd och analyserades omedelbart. Flödescytometridata samlades in med hjälp av 10,000 celler och analyserades med FlowJo 7.6.1-programvara (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA).

Statistisk analys:

Alla data analyserades med GraphPad Prism 5.0 och presenteras som medelvärde ± standardfel för medelvärdet. Data analyserades med en enkelriktad variansanalys med Tukeys multipla jämförelser post hoc-test för jämförelse av medelvärden mellan flera grupper. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Cistanche Echinacoside: Anti-apoptos

3. Resultat

3.1 Samtidig behandling med TMZ och akteosidhämmareglioblastomcellproliferation och migration.

Kombinerad behandling med TMZ ochakteosidhämmade livskraften hos C6-celler. TMZ minskade cellviabiliteten på ett dosberoende sätt (Fig. 2A), medan enbart acteosid inte hade någon signifikant effekt på någon behandlingsnivå (Fig. 2B). Efter inkubation i ett odlingsmedium innehållande TMZ med eller utan akteosid i 24 timmar, utfördes en MTT-analys för att jämföra cytotoxiciteterna för olika behandlingsnivåer. TMZ undertryckte cellviabiliteten signifikant, medan acteosid inte signifikant undertryckte celltillväxt. Kombinerad behandling med TMZ och akteosid minskade markant cellviabiliteten (Fig. 2C). Behandling med TMZ eller akteosid applicerad ensamt minskade sårläkningsförmågan (Fig. 3A). Såravståndet (procent) mättes med hjälp av resultaten som visas i Fig. 3A med ImageJ-mjukvaran. Såravståndet ökade signifikant efter kombinationsbehandling (Fig. 3B), jämfört med endera individuell behandling. Dessa resultat indikerar att samtidig behandling med TMZ och akteosid var en effektiv hämmare avglioblastomcellproliferation och migration.

3.2 Akteosid och TMZ påverkar apoptos synergistiskt i C6-celler.

Resultaten av western blot-analysen visade att nivåerna av klyvd kaspas-3, Bax och fosforylerad p53 var högre och nivåerna av Bcl-2 var lägre efter kombinationsbehandling med TMZ ochakteosidän efter behandling med enbart TMZ (Fig. 4A).Akteosid-medierad mitokondriell funktion och generering av reaktiva syrearter (ROS), som är nyckelmediatorer för apoptotisk signalering, observerades sedan i de TMZ-behandlade C6-cellerna. För att verifiera mitokondriell massa utfördes fluorescensaktiverad cellsorteringsanalys med MitoTracker Green. Sambehandling med TMZ ochakteosidresulterade i en högre mitokondriell massa än behandling med enbart TMZ (Fig. 4B). ROS-genereringen var signifikant högre efter samtidig behandling med TMZ och acteosid än behandling med enbart TMZ (Fig. 4C). Dessa resultat tyder på att ROS-generering och mitokondriell funktion är viktiga vid apoptos inducerad av behandling med TMZ plus akteosid. Samtidig behandling med TMZ och acteosid inducerar autofagi i C6-celler. TMZ har rapporterats inducera autofagi (28,29); därför undersökte denna studie i vilken utsträckning autofagi inducerades av TMZ plus akteosidbehandling. C6-cellerna behandlades med TMZ med eller utan akteosid; efter 24 timmar, och cellerna färgades för immunfluorescens för att detektera LAMP1 och LC3 som markörer för autofagi. Högre expressionsnivåer av LAMP1 och LC3 observerades efter kombinationsbehandlingen (Fig. 5A). Autofagi-relaterat proteinuttryck undersöktes också, och det visade sig att TMZ inducerade omvandlingen av LC3-I till LC3-II, vilket är en signatur för generering av autofagosomer. En högre omvandlingshastighet av LC3‑I till LC3‑II observerades efter samtidig behandling med TMZ och akteosid än behandling med enbart TMZ. Expressionsnivåerna för Rab7 och p62 indikerade autofaginduktion i de TMZ-behandlade cellerna (Fig. 5B). Dessa fynd tyder på att samtidig behandling med TMZ och akteosid förstärkte den autofagiska processen iglioblastomceller.

3.3 Akteosid inducerar MAPK-genuttryck i TMZ-baserad behandling.

Tidigare studier har visat att TMZ reglerar MAPK-vägen, inklusive p38, JNK och ERK (30). Därför undersökte föreliggande studie omakteosidpåverkar TMZ-relaterat MAPK-genuttryck. C6-cellerna behandlades med TMZ med eller utanakteosid. Efter 24 timmar resulterade TMZ-behandling i högre uttrycksnivåer av p‑p38, p‑JNK och p‑ERK. Uttrycket av TMZ-reglerade gener var signifikant högre efter behandling med TMZ plus akteosid än behandling med enbart TMZ (Fig. 6). Dessa observationer tyder på detakteosidpåverkar TMZ-baserade terapeutiska mekanismer via MAPK-vägen.

Acteosid anti-glioblastom

Diskussion

Resultaten av föreliggande studie visar att den kombinerade behandlingen med TMZ medakteosiderbjuder terapeutisk potential förglioblastombehandling, och ge bevis för att kemosensibilisering till en kombination av TMZ ochakteosidkan uppstå genom förstärkning av autofagi. Som mutationen avglioblastomceller kan leda till inaktivering av apoptotisk väg, induktion av autofagi av TMZ plusakteosidsambehandling kan representera en alternativ metod förglioblastomterapi. Men om autofagi är den enda mekanismen förglioblastomterapi med TMZ plusakteosidsambehandling återstår att belysa.

Autofagi är en viktig cellulär mekanism för nedbrytning av proteiner och cytoplasmatiska organeller. Den kataboliska fördelen med inducerad autofagi kan vara viktig under stressiga förhållanden; därför kan induktionen av autofagi vara en adaptiv mekanism för förebyggande av celldöd (31-33). Tidigare studier har rapporterat att minskad autofagi är korrelerad med cancer (34-36). Dessutom avregleras flera proteiner och signalvägar associerade med autofagi under malign transformation, vilket resulterar i en minskning av autofagisk aktivitet. Höga uttrycksnivåer av LC3 har också associerats med ökad överlevnad hos patienter medglioblastommed dåliga prestationspoäng (37,38). På liknande sätt indikerar resultaten av den föreliggande studien att återställandet av normal autofagi kan vara en latent strategi förglioblastomterapi och kan tjäna som en mekanism för begränsning av onormal tumörcelltillväxt.

I normal autofagi isoleras särskilda cytoplasmatiska komponenter i autofagosomer som sedan smälter samman med en lysosom för att brytas ned och återvinnas (39,40). När autofagi uppregleras överstiger bildningshastigheten för autofagosomer lysosomala nedbrytningshastigheter; detta tillstånd kallas autofagisk stress. Om stress eller onormal autofagi fortsätter kan celldöd inträffa via energiutarmning eller förändringar i balansen beclin-1/Bcl-2. Apoptos kan också utlösas av autofagosomes hyperaktivitet, som uppslukar cytoplasmatiska organeller inklusive mitokondrierna eller endoplasmatiskt retikulum (41). Det har föreslagits att allmän autofagi kan inducera celldöd under normal cytoplasmatisk och organellomsättning i friska celler. I denna process "kannibaliserar" cellen sig själv från insidan, en nyckelegenskap för typ II programmerad celldöd. Även om de mekanismer genom vilkaakteosidförstärker den terapeutiska effekten av TMZ-baseradglioblastombehandling återstår att helt klarlägga, kan de anticancereffekter som uppvisas av kombinationsbehandlingen som undersökts i denna studie vara associerade med dessa autofagiska mekanismer.

Akteosidär en fenyletanoidglykosid som härrör från växter (22,26). Tidigare studier har rapporterat om akteosids olika biologiska aktiviteter. Förändringarna i uttrycksnivåerna av klyvd kaspas-3 och LC3 i denna studie visar att behandling med en kombination av TMZ ochakteosidinducerad apoptos och autofagi i C6-celler (fig. 4 och 5). Kombinationsbehandlingen visade sig ha en synergistisk effekt påglioblastomceller. Även om andra möjliga mekanismer för dessa synergistiska effekter återstår att belysa, identifierade den aktuella studien induktionen av autofagi som en avgörande tumördödande mekanism förakteosidkemosensibilisering under TMZ-baseradglioblastomterapi.

Acteosid behandlar glioblastom

Referenser

1. Friedman HS, Kerby T och Calvert H: Temozolomide och behandling av malignt gliom. Clin Cancer Res 6: 2585-2597, 2000.

2. Mrugala MM och Chamberlain MC: Sjukdomsmekanismer: Temozolomid ochglioblastom– se in i framtiden. Nat Clin Pract Oncol 5: 476-486, 2008.

3. Agarwala SS och Kirkwood JM: Temozolomide, ett nytt alkyleringsmedel med aktivitet i det centrala nervsystemet, kan förbättra behandlingen av avancerade metastaserande melanom. Onkolog 5: 144-151, 2000.

4. Stevens MF, Hickman JA, Stone R, Gibson NW, Baig GU, Lunt E och Newton cG: Antitumörimidazotetraziner. 1. Syntes och kemi av 8-karbamoyl-3-(2-kloretyl)imidazo[5,1-d]-1,2,3, 5-tetrazin-4(3 H)-on, en ny bredspektrumantitumör ombud. J Med Chem 27: 196-201, 1984.

5. Fulda S: Celldödsbaserad behandling avglioblastom. Cell Death dis 9: 121, 2018.

6. Chen PH, Shen WL, Shih CM, Ho KH, Cheng CH, Lin CW, Lee CC, Liu AJ och Chen KC: Den CHAC1-hämmade Notch3-vägen är involverad i temozolomid-inducerad gliomcytotoxicitet. Neuropharmacology 116: 300-314, 2017.

7. Oshiro S, Tsugu H, Komatsu F, Ohmura T, Ohta M, Sakamoto S, Fukushima T och Inoue T: Effekten av temozolomidbehandling hos patienter med höggradigt gliom. Anticancer Res 29: 911-917, 2009.

8. Van den Bent MJ: Adjuvansbehandling av höggradiga gliom. Ann Oncol 17 (Suppl 10): x186-x190, 2006.

9. Shen W, Hu JA och Zheng JS: Mekanism av temozolomid-inducerade antitumöreffekter på gliomceller. J Int Med Res 42: 164-172, 2014.

10. Barciszewska AM, Gurda D, Głodowicz P, Nowak S och Naskręt-Barciszewska MZ: En ny epigenetisk mekanism för temozolomidverkan i gliomceller. PLoS One 10: e0136669, 2015.