Inriktning mot laktatdehydrogenas A med katekin gör SNU620/5FU magcancerceller på nytt mot 5-fluorouracil del 1

Vänligen kontaktaoscar.xiao@wecistanche.comför mer information

Abstrakt:Resistens mot cancerläkemedel förekommer i praktiskt taget alla typer av cancer och blir en stor svårighet vid cancerbehandling. Även om 5-fluorouracil (5FU) är förstahandsvalet av anticancerterapi för magcancer, är dess effektivitet begränsad på grund av läkemedelsresistens. Nyligen har förändrad cancermetabolism, inklusive Warburg-effekten, en preferens för glykolys snarare än oxidativ fosforylering för energiproduktion, accepterats som en central mekanism som reglerar resistens mot kemoterapi. Således undersökte vi den detaljerade mekanismen och möjliga användbarheten av antiglykolytiska medel för att förbättra 5FU-resistens med hjälp av etablerade magcancercellinjer, SNU620 och SNU620/5FU. SNU620/5FU, en magcancercell som har resistens mot 5FU, visade mycket högre laktatproduktion och uttryck avglykolysrelaterade enzymer, såsom laktatdehydrogenas A(LDHA), än de hos moder-SNU620-cellerna. För att begränsa glykolysen undersökte vi katekin och dess derivat, som är kändaantiinflammatoriskoch anticancer naturliga produkter eftersom epigallokatechingallat tidigare har rapporterats som en suppressor av LDHA-uttryck. Katekin, den enklaste föreningen bland dem, hade den högsta hämmande effekten på laktatproduktion och LDHA-aktivitet. Dessutom visade kombinationen av 5FU och katekin ytterligare cytotoxicitet och inducerade reaktiva syrearter (ROS)-medierad apoptos i SNU620/5FU-celler. Baserat på dessa resultat föreslår vi således katekin som en kandidat för utveckling av ett nytt adjuvansläkemedel som minskar kemoresistens till 5FU genom att begränsa LDHA.

Nyckelord:5-fluorouracil;kemoresistent; glykolys; laktatdehydrogenas; katekin

Klicka här för att veta mer

1. Introduktion

Anmärkningsvärda framsteg har uppnåtts i behandlingen av magcancer med kirurgisk resektion av primärtumören och 5-fluorouracil (5FU)-baserad kombinationskemoterapi, såsom epirubicin, cisplatin och fluorouracil och docetaxel, oxaliplatin och 5FU[1 ,21 Hittills är 5FU, en analog av uracil som blockerar DNA-syntes genom att hämma tymidylatsyntas [3], fortfarande ett vanligt använt kemoterapiläkemedel för behandling av magcancer [1, A4]. Den kliniska effekten av kemoterapi har dock varit otillfredsställande på grund av återfallet av primär eller metastaserande cancer relaterad till läkemedelsresistens [1,5].

Cistanche kan förbättra immuniteten

Flera cellulära processer betraktas som nyckelmekanismer bakom kemoresistens, inklusive läkemedelsaktivering eller -inaktivering, reparationsmaskineri av DNA-skador, modifieringar av läkemedelsmål, inaktivering av apoptotiska vägar och ökad autofagi [6,7]. Cancer är heterogen och olika cancerformer använder både glykolys och oxidativ fosforylering för energiomsättning [8]. Men metabolisk omprogrammering, särskilt onormal aerob glykolys, har rapporterats som en nyckelspelare i utvecklingen av resistens mot kemoterapeutiska läkemedel, inklusive 5FU, vid magcancer [9]. Laktatdehydrogenas A (LDHA) och pyruvatdehydrogenaskinaser (PDK) är kända som nyckelregulatorer för aerob glykolys som producerar laktat från pyruvat[10,11]. Kombinationen av dikloracetat, en etablerad hämmare av PDK, återställer känsligheten mot 5FU [12]. Dessutom har LDHA, ett nyckelenzym som katalyserar omvandlingen av pyruvat till laktat, rapporterats som ett potentiellt mål för behandling av magcancer [13,14]. Nedbrytning av LDHA-uttryck i cancerceller hämmar tumörframkallande egenskaper genom att öka mitokondriell andning och minska cellviabiliteten [15]. Flera LDHA-hämmare, såsom FX11, PSTMB och GSK 2837808A, minskar ATP-nivåer och genererar oxidativ stress och orsakar slutligen apoptotisk celldöd [16-18]. Även om en studie visade att hämningen av LDHA genom mikroRNA-34a återställde resistensen mot 5FU i tjocktarmscancer [19], har ingen tidigare studie rapporterat effekterna av genetiska eller farmakologiska LDHA-hämmare på kemoresistens.

Polyfenoler från grönt te, inklusive katekin (CA), epikatekin (EC), gallokatekin (GC), epigallokatekin (EGC), epikatekin-3-gallat (EKG) och epigallokatekin-3-gallat (EGCG), främjar människor hälsa genom att förebygga och behandla flera sjukdomar, inklusive inflammation, diabetes, hjärt-kärlsjukdomar och malign cancer [20,21]. Bland polyfenoler ökar EGCG 5FU kemosensitivitet i kolorektal cancer och hepatocellulära karcinomceller genom att aktivera AMPK-vägar och begränsa cancerstamheten [22,23]. Dessutom har EGCG rapporterats hämma LDHA genom att undertrycka dess uttryck i bröst- och pankreascancerceller [24,25].

I denna studie antog vi att CA kan vara en kandidat för ett adjuvantläkemedel för att minska resistensen mot 5FU i magcancerceller. Det undersöktes att den hämmande effekten av CA, och/eller dess kombination med 5FU, på LDHA-aktiviteten därigenom inducerade mitokondriella reaktiva syrearter (ROS) och apoptotisk celldöd i 5FU-resistenta celler.

2. Resultat

2.1. Glykolytiska egenskaper hos 5FU-resistenta celler

Förbättrad proliferation är ett kännetecken för kemoresistens inklusive 5FU-resistenta cancerceller [26,27]. Först bekräftade vi resistensen mot 5FU och långsiktiga tillväxthastigheter för SNU620- och SNU620/5FU-celler. När dessa celler odlades med de angivna koncentrationerna av 5FU under 48 timmar, var den uppskattade dosen som orsakade 50 procents tillväxthämning (Gl50) i SNU620/5FU-celler (100,63 uM) mycket högre än den som orsakade GIso i dess parentala SNU620-celler (μ88 μM. ）（Figur 1A och tilläggsbild S1）. Dessutom var tillväxthastigheterna för SNU620/5FU-celler snabbare än för SNU620-celler (Figur 1B och kompletterande figur S2). Eftersom kemoresistens och snabbväxande egenskaper kan relateras till förhöjda glykolytiska egenskaper i magcancerceller [28], mättes extracellulära försurningshastigheter (ECAR) och syreförbrukningshastigheter (OCR) i båda cellerna i närvaro av oxamat, en välkänd glykolyshämmare eller inte. Resultaten visade att SNU620/5FU-celler signifikant utsöndrade mer laktat än det som utsöndrades av SNU620-celler och därefter surgjorde odlingsmediet (Figur 1C och kompletterande Figur S3). Men ingen signifikant förändring i OCR observerades mellan dessa celler (Figur 1D). mRNA- och proteinexpressionsnivåerna för LDHA mättes. LDHA-uttryck var högre i SNU620/5FU-celler än i SNU620-celler (Figur 1E, F). Vidare undersökte vi mRNA- och proteinuttrycksnivåerna för PDK-isotyper och fann att de för PDK2 och PDK3 var högre i SNU620/5FU-celler än i SNU620-celler (kompletterande figur S4A, B). Fosforyleringen av E1-subenheten av pyruvatdehydrogenas (PDHA1), som ökades av PDK, utvärderades också, och den visade sig vara högre i SNU620/5FU-celler än i SNU620-celler (kompletterande figur S4C). Dessutom använde vi oxamat som en LDHA-hämmare för att övervinna 5FU-resistens i SNU620/5FU-celler. Denna förening hämmade celltillväxt i både SNU620- och SNU620/5FU-celler (kompletterande figur S5). Vidare undertryckte sambehandling med oxamat och 5FU celltillväxt, jämfört med individuell behandling med oxamat eller 5FUin SNU620/5FU-celler (Figur 1G). Dessa data tyder på att SNU620/5FU-celler uttrycker LDHA i hög grad, och hämning av LDHA-aktivitet kan övervinna motståndet hos SNU/5FU-celler mot 5FU.

Figur 1. Enligt resultaten har 5-fluorouracil (5FU)-resistenta celler en förhöjd glykolytisk egenskap: (A)SNU620- och SNU620/5FU-celler behandlades med de angivna koncentrationerna av 5FU i 48 timmar. Livsdugligheten för dessa celler utvärderades via MTT-analys; (B) tillväxtnivåer av SNU620- och SNU620/5FU-celler mättes varje dag under 4 dagar med MTT-analys; (C,D)SNU620- och SNU620/5FU-celler behandlades med oxamat ( 5mM) eller inte under 24 timmar, och ECAR- och OCR-värden utvärderades med Seahorse XF-analysator; (E, F) uttrycken av LDHA i SNU620- och SNU620/5FU-celler detekterades via qRT-PCR och Western blot-analys; (G) SNU620- och SNU620/5FU-celler behandlades med oxamat (25 mM) och/eller 5FU (10 μM) i 48 timmar. Resultaten visas som medelvärde ± SEM.**p<0.01><><><0.01,and ##=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" ecar,="" extracellular="" acidification="" rates;="" ocr,="" oxygen="" consumption="" rates;="" ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

2.2. CA undertrycker LDHA-aktivitet

Laktatproduktion analyserades med CA och dess derivat, inklusive EC, GC, EGC och EGCG, i SNU620/5FU-celler. Jämfört med dessa derivat minskade CA laktatproduktionen mer effektivt (Figur 2A). Vidare, in vitro, bekräftades LDHA-aktiviteten som sagt, och CA visade en starkare hämmande effekt på LDHA-aktiviteten än de av dess derivat (Figur 2B). De hämmande effekterna av CA på LDHA- och LDHB-aktiviteter in vitro mättes på ett dosberoende sätt. CA hämmade LDHA-aktivitet utan att påverka LDHB-aktivitet (Figur 2C, D). Dessutom mättes LDHA- och LDHB-aktiviteter med EGCG, som är känt för att hämma LDHA-aktivitet, och visade sig ha minskat dosberoende (kompletterande figur S6A, B). Dessutom utvärderades intracellulära LDHA- och LDHB-aktiviteter med de angivna koncentrationerna av CA i SNU620/5FU-celler. CA hämmade LDHA-aktivitet på ett dosberoende sätt in vitro-resultat men inte LDHB-aktivitet (Figur 2E, F). Proteinuttrycksnivåer av p-PDHA1, PDK2, PDK3 och LDHA mättes också i SNU620/5FU-celler efter CA-behandling (kompletterande figur S7), och vi observerade att de inte påverkades av denna behandling. Dessa resultat tyder på att CA reglerar LDHA-aktivitet utan att påverka dess uttryck.

2.3. Verkningssätt för LDHA-inhibering av CA

För att analysera hämningsmekanismen för LDHA-aktiviteten på CA och dess derivat, genomförde vi molekylär modellering av bindningsinteraktionen mellan human rekombinant LDHA och CA (Figur 3A, B). Resultaten visade att CA kan interagera med resterna av T94, A95, Q99, R105, S136, R168, H192 och T247 av LDHA. Bland dem är R105, S136 och R168 kritiska för bindning av substrat (pyruvat). Således antog vi att CA kan störa de substratbindande platserna. Tvärtom är EGCG bundet till LDHA via en annan plats. För att ytterligare verifiera verkningssättet för LDHA-hämning av CA, bekräftades Michaelis-Menten- och Lineweaver-Burk-plotterna med olika koncentrationer av pyruvat och CA. LDHA-aktiviteten ökade på ett pyruvatdosberoende sätt. Det vändes dock av ökningen av CA. Således visade resultaten av Michaelis-Menten och Lineweaver-Burk plots att CA är en icke-kompetitiv hämmare av LDHA (Figur 3C, D). Dessutom visade isotermisk titreringskalorimetri (ITC) data att CA fysiskt binder till LDHA med en Kd värde på 197 uM (tilläggsbild S8). Dessa resultat ger insikter om att CA undertrycker LDHA-aktivitet genom att binda det substratbindande stället för LDHA.

2.4. CA återsensibiliserar 5FU-resistens genom att minska LDHA-aktiviteten

Vi utvärderade de cytotoxiska effekterna av CA på SNU620- och SNU620/5FU-celler och fann att CA undertryckte tillväxten i båda grupperna av celler (Figur 4A). För att verifiera att tillväxthämningen var relaterad till undertryckandet av LDHA-aktivitet avskaffades uttrycket av LDHA genom kort hårnålsribonukleinsyra (shRNA) för LDHA (shLDHA) och dess uttryck återvanns genom transfektion av LDHA-uttryckande plasmid (kompletterande figur S9A, B ).I shLDHA-transfekterade SNU620/5FU-celler förändrades inte laktatproduktionen och cellviabiliteten markant av CA-behandling, jämfört med dessa för skentransfekterade celler (Figur 4B, C). Dessutom var den tillväxthämmande effekten av CA. ökad genom återhämtningen av LDHA-uttryck i LDHA-knockdown SNU620/5FU-celler (Figur 4D). Vidare undersöktes SNU620- och SNU620/5FU-celler efter behandling av CA och 5FU individuellt eller kombinationen av båda. Samtidig behandling med CA och 5FU hämmade signifikant tillväxten av SNU620/5FU-celler (Figur 4E). Dessutom undersöktes kombinationseffekter av CA och 5FU i flera andra cellinjer, såsom human gastrisk cancer AGS, pankreascancer Panic-1, MIA PaCa-2 och koloncancer LS174T och RKO-celler, jämfört med SNU620 och SNU620/5FU-celler. Laktatproduktionen och LDHA-uttrycket visade en god korrelation med varandra, och dessa glykolytiska egenskaper är relativt höga i SNU620/5FU, AGS och RKO (kompletterande figur S10A, B). Dessutom reducerade kombinationsbehandlingen av CA och 5FU avsevärt cellernas livsduglighet, jämfört med en enda behandling av 5FU i glykolytiska celler inklusive AGS och RKO (Supplerande figur S10C). Samtidigt behandling med CA och 5FU hämmade dock inte signifikant tillväxt i SNU620-, Panic-1-, MIA PaCa-2- och LS174T-celler, som visade låga LDHA-uttryck. Dessa resultat antydde att den sensibiliserande effekten av CA mot 5FU-resistenta celler kan vara relaterad till dess hämmande effekt på LDHA-aktivitet.

Figur 2. Katekin(CA) hämmar LDHA-aktivitet men inte dess uttryck: (A)laktatproduktion av SNU620/5FU mättes efter behandling med CA-derivat (10 μM) under 24 timmar; (B) LDHA-aktivitet in vitro utvärderades vid behandling med CA-derivat (10 uM) och oxamat (20 mM); (C, D) in vitro, LDHA- och LDHB-aktiviteter uppskattades med de angivna koncentrationerna av CA; (E, F) cellerna behandlades med indikerade koncentrationer av CA under 24 timmar. Intracellulära LDHA- och LDHB-aktiviteter mättes med användning av cellysat som en enzymkälla. Resultaten visas som medelvärde ± SEM. **sid<0.01><0.001, compared="" to="" the="" control="" (1st=""><><0.01,and><0.001,compared to="" the="" negative="" control="" (second="" column).ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a;="" ldhb,="" lactate="" dehydrogenase="" b.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Figur 4. Cellviabiliteten hämmades genom samtidig behandling med katekin (CA) och 5-fluorouracil (5FU) i 5FU-resistenta celler: (A) livsdugligheten hos SNU620- och SNU620/5FU-celler utvärderades efter behandling med de angivna koncentrationerna av CA i 48 timmar; (B) SNU620/5FU-pLKO.1- och SNU620/5FU-shLDHA-celler behandlades med CA (10 μM) i 24 timmar. Laktatproduktion mättes i odlingsmediet av SNU620/5FU-pLKO.1- och SNU620/5FU-shLDHA-celler; (C, D)SNU620/5FU-pLKO.1, SNU620/5FU-shLDHA, SNU620/5FU-shLDHA plus EV , och SNU620/5FU-shLDHA plus LDHA#2-celler behandlades med de angivna koncentrationerna av CA i 48 timmar. Cellviabiliteten mättes med en MTT-analys; (E) SNU620- och SNU620/5FU-celler behandlades med CA (10 μM) och/eller 5FU (10μM) i 48 timmar. Viabiliteten hos dessa celler mättes via MTT-analys. Resultaten visas som medelvärde±SEM.*s<><0.01,and**><><0.05, ##=""><0.01, and="" ##t=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Denna artikel är extraherad från Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 5406. https://doi.org/10.3390/ijms22105406 https://www.mdpi.com/journal/ijms