Terahertz högupplöst spektroskopi av termisk nedbrytningsgasprodukter av diabetes- och icke-diabetesblodplasma och njurvävnadspellets
Mar 28, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Abstrakt
Betydelse:En av de moderna trenderna inom medicinsk diagnostik är baserad på metabolomik, ett tillvägagångssätt som möjliggör bestämning av metaboliter som kan vara de specifika egenskaperna hos sjukdomen. Högupplöst gasspektroskopi möjliggör undersökning av gasmetabolitinnehållet i prover av biologiskt ursprung. Vi presenterar utarbetandet av en metod för att studera biologiska prover från diabetiker och icke-diabetiker, framställda som pellets, genom terahertz (THz) högupplöst spektroskopi.
Syfte:Huvudtanken med arbetet är att studera innehållet av termiska nedbrytningsgasprodukter av diabetiker och icke-diabetiker torkadeblodplasmaochnjurvävnaderför att avslöja uppsättningen gasmarkörer som karakteriserade diabetes genom THz-högupplösta spektroskopimetoden.
Närma sig:Vi presenterar ett tillvägagångssätt för att studera diabetiker och icke-diabetikerblodplasma(människor och råttor) ochnjurvävnader(råttor), med högupplöst spektroskopi baserad på den icke-stationära effekten av THz-frekvensområdet. Metoderna för att bereda blod- och njurvävnadsprover som pellets och för att förånga proverna utvecklades.
Resultat:Mätningarna av rotationsabsorptionsspektra av ångor vid uppvärmning av pellets framställda av blod ochnjurvävnadutfördes i frekvensområdet 118 till 178 GHz. Absorptionslinjerna som uppträdde i spektra av provångorna detekterades och identifierades. Molekylinnehållet i termiska nedbrytningsprodukter skilde sig för prover från icke-diabetiker och diabetiker; t.ex. är huvudmarkören aceton som förekommer i diabetikerblodet (människor och råttor) och hos diabetikernjurvävnad.
Slutsatser: Vår uppsats illustrerar den potentiella förmågan att bestämma metabolitinnehållet i biologiska prover för diagnostik och prognosen för sjukdomar för klinisk medicin. © Författarna. Publicerad av SPIE under en Creative Commons Attribution 4.0 Unported License. Distribution eller reproduktion av detta verk helt eller delvis kräver fullständig tillskrivning av originalpublikationen, inklusive dess DOI. [DOI: 10.1117/1.JBO.26.4.043008] Nyckelord: högupplöst terahertzspektroskopi; termisk sönderdelning; vävnad;blodplasma; diabetes; lyofilisering.
Nyckelord:högupplöst terahertz-spektroskopi; termisk sönderdelning; blodplasma; diabetes; lyofilisering, njurvävnad.
1. Introduktion
Nuförtiden lockar problemet med diagnostik av socialt viktiga sjukdomar (diabetes, cancersjukdomar, etc.), inklusive det tidiga stadiet, stor uppmärksamhet från vetenskapliga grupper i världen.Ett av de nya tillvägagångssätten som öppnar nya möjligheter inom diagnostik och behandling av olika sjukdomar är metabolomik. Metabolomics är ett vetenskapsområde som undersöker de slutliga och mellanliggande metaboliska produkterna av ett biologiskt system (cell, organ eller hela organismer). Metabolomiken kan avslöja metaboliterna som kan vara de specifika egenskaperna hos sjukdomen och kan spela en stor roll vid diagnos och prognos för en sjukdom. Medierna, som innehåller de slutliga och mellanliggande metaboliska produkterna i den mänskliga organismen och som är användbara för att avslöja metaboliter associerade med sjukdomar och patologier, är utandningsandning, blod, urin, saliv, etc.
En av de socialt viktiga sjukdomar som hotar människors livskvalitet är diabetes. Diabetes mellitus typ 2 var tidigare en medelålderssjukdom, men nu diagnostiseras den hos vuxna, ungdomar och barn. Resultaten av metabolomiska undersökningar av blod- och urinprover från diabetespatienter från 18 år samt barn från 1 till 13 år presenteras i Human Metabolome Database (HMDB).1 Främst blod (21 kemiska substanser inklusive isomerer), urin ( 30 kemiska substanser inklusive isomerer) och cerebrospinalvätska (1 kemisk substans) undersöktes. Till exempel detekterades (R)-3-hydroxismörsyra i alla tre typerna av vätskor. Vissa ämnen (acetoättiksyra, D-fruktos och D-glukos) upptäcktes i båda vätskorna (blod och urin). Det mer karakteristiska kännetecknet för diabetes (aceton, CH3COCH3) fanns endast för urin. Vätskeproverna, resultaten av undersökningarna som presenteras i HMDB, har undersökts med olika metoder - gaskromatografi; 2 gaskromatografi med masspektrometri; 3,4 gas-vätskekromatografi med masspektrometri; 5 högupplöst spektroskopi av kärnkraft. protonmagnetisk resonans;6 och metoder som använder speciella anordningar för diabetespatienters tillståndsövervakning, det kontinuerliga glukosövervakningssystemet.7
Utvecklingen av kronisk njursjukdom är en stor komplikation av diabetes mellitus. Även om bestämning av glykerat albumin är den vanliga metoden för screening, kan njurskador börja långt innan kliniskt signifikanta förändringar i urinalbumin uppträder. Med tanke på den multifaktoriella patogenesen av kronisk njursjukdom har olika markörer övervägts för dess screening.8,9 Men deras diagnostiska värde utan njurbiopsi verkade vara tveksamt.
Det spektroskopiska tillvägagångssättet kan ge information om innehållet i de biologiska proverna som kan användas för medicinsk diagnostik. Terahertz (THz) frekvensområdet är mycket viktigt för att studera gaser, vätskor och vävnader hos levande organismer. Det finns några recensioner som ägnas åt tillämpningar av metoder för THz-frekvensområdet, inklusive THz-tidsdomänspektroskopi, THz-reflektometri och THz-avbildning för biologi och medicin.10
THz-tidsdomänspektroskopi gör det möjligt att detektera spektra, där absorptionskoefficienten eller refraktionsindexet har vissa spektrala egenskaper som motsvarar närvaron av vissa biomolekyler (proteiner, sockerarter, etc.) i proverna eller deras olika koncentrationer.11
Molekylär absorptionsspektroskopi och i synnerhet THz-gasspektroskopi är ett mycket lovande tillvägagångssätt för undersökningar av flerkomponentgasblandningar av olika ursprung.12 Proverna i flytande och fast tillstånd kan undersökas genom förångning eller termisk sönderdelning. Metaboliter-markörerna för socialt viktiga sjukdomar (diabetes, cancer, etc.) kan avslöjas av dess spektrallinjer i absorptionsspektra som utförs vid överföring av strålning genom gasprover.
Nivån av aceton i prover av utandningsluft och urin som tagits från diabetespatienter (12 personer) mättes med en terahertz-spektrometer med fasförskjutning av den verkande strålningen. Experiment gjordes i samarbete med Almazov National Medical Research Centre. Mätningarna utfördes vid acetonabsorptionslinjerna med centrala frekvenser på 150,537 och 151,647 GHz. Mätningarna utfördes utan uppvärmning. Samtidig analys av prover av utandningsandning och urin från diabetespatienter visade att acetonnivån i urinen var mycket högre än i utandningsandningen, i vissa fall en storleksordning högre.13,14
Resultaten av THz högupplösta gasspektroskopiundersökningar avblodplasmaav patienter och råttor (villkorligt friska och med diabetes) samt råttansnjurvävnad(frisk och med diabetes) torkade och pressade till pellets presenteras. Vävnaderna ellerblodplasmaav levande organismer, utan några förberedelser, måste undersökas omedelbart efter provtagning. Beredning som pellets möjliggör undersökning efter tillräckligt lång tid efter blodprovstagning eller njurbiopsi.
2 Experiment och metodik
2.1 Metod för beredning av blodplasmapellets och njurpellets
Venöst blod från patienter med typ 2-diabetes mellitus och villkorligt friska deltagare samlades in vid endokrinologiska avdelningen vid Almazov National Medical Research Centre; centret tillhandahåller medicinsk vård för diabetespatienter. Tre patienter och två deltagare var män, åldersmatchade (39 till 43 år gamla). Alla experimentella protokoll som användes i denna undersökning granskades och godkändes av patienterna och deltagarna och användningskommissionen vid Medical Center. Venöst blod samlades på morgonen efter 8 till 12 timmars fasta i ett rör med antikoagulantia K3EDTA (Vacutest Kima, Italien). Plasma erhölls för analys av biokemiska parametrar genom centrifugering av helblod vid 3000 rpm under 15 minuter i en laboratoriecentrifug (Eppendorf 5702R, Tyskland) vid en temperatur av þ4 grader. Värden av biokemiska parametrar förblodplasmaprover och referensintervall presenteras i tabell 1 (nivån av glykerat hemoglobin erhölls i helblodet). Tabell 1 visar att koncentrationen av glukos, triglycerider och glykerat hemoglobin i proverna från en patient med diabetes ökar 1,5, 2 respektive 2,3 gånger.
Studien utfördes också med Wistar-hanråttor vid en ålder av 8 veckor och vikten 180 till 200 g, enligt protokollet för experimentella studier som godkänts av Animal Care and Use Commission vid Institutet för experimentell medicin Almazov National Medical Research Centre. Glukosnivån hos djur i försöksgruppen var 21 mmol ∕ l efter 120 min efter glukosladdning. Intakta råttor användes som kontrollgrupp. Venöst blod samlades in från den nedre hålvenen innan djuren avlivades. Dessutom skördades njuren. Blodprover samlades i rör innehållande ett antikoagulant.
Testprover frystes vid en temperatur av -80 grader (lågtemperaturkylskåp DW-86L388A, Haier, Kina). Därefter lyofiliserades den genom att frystorka Vaco 2 (ZirBus, Tyskland) vid en temperatur på -50 grader och ett tryck på 3 Pa. Frysning utförs före frystorkning eftersom biologiska komponenter under frystorkning under inverkan av högt inre tryck kan förstöras. Torkade prover var en svamp bestående av biologiska kristaller. Svampen förstördes av en metallspatel och krossades till kristaller med en storlek på flera tiotals mikrometer. Användningen av mortel och mortelstöt var omöjlig, eftersom malning av proteinerna i provernas sammansättning skulle leda till deras oönskade vidhäftning och bildandet av runda granuler.
Det lyofiliserade provpulvret vägdes (analytisk balans OHAUS Discovery, Schweiz) och placerades sedan i en stålpressform. Genom att använda laboratoriepressar (Angkor, Ryssland och Specac, Storbritannien) vid ett visst formtryck,blodplasmapellets och njurpellets erhölls. Varje kristall av pellets innehåller en viss procentandel av fetter (triglycerider), proteiner (albumin) och fibrinogen - alla normala eller glykerade (i diabetikerfallet). Pelletsen av prover från kontrollgruppen benämns nedan "icke-diabetiska pellets" och pelletsen av prover fråndiabetisk grupp hänvisas härefter till som "diabetisk pellet".
2,2 THz högupplöst spektroskopi Experimentell inställning
Högupplöst THz-spektroskopi baserad på icke-stationära effekter gör det möjligt att analysera komponentsammansättningen av gas- och ångaflerkomponentgasblandningar. Spektrometrar ger känslighet nära den teoretiska gränsen med en upplösning som endast begränsas av Dopplereffekten och kan registrera snabba processer. Känsligheten bevaras även med en avsevärd minskning av gastrycket och är ungefär 0.2 ppb i avsökningsläget för vissa gaser (t.ex. ammoniak vid mätningarna av absorptionslinjen nära frekvensen 572 GHz). Dessutom möjliggör den bestämning av komponentsammansättningen i en gasblandning med hög tillförlitlighet.12 En studie av de termiska sönderfallsprodukterna från pellets genomfördes med metoden THz icke-stationär gasspektroskopi i intervallet 118 till 178 GHz. Spektrometern använder en faslåst slinga för automatisk styrning av frekvensen för bakåtvågslampan och fasförskjutning, registrering i tidsdomänen, medelvärdesberäkning och bearbetning av den spektroskopiska övergångssignalen. Enheten registrerar en signal i tidsdomänen. Provernas ånga analyserades med användning av följande procedur. Pellets placerades i ett provrör, med hjälp av vakuumpumpade, gradvis värmde ett provrör (upp till 240 grader) och den resulterande blandningen av termiska sönderdelningsprodukter från provet släpptes in i mätcellen. En datafil innehåller vanligtvis inspelningar av ett valt eller av spektrometerns totala arbetsområde. Därför kan ämnen identifieras genom absorptionslinjer som förekommer i provets totala spektrum och dynamiken för koncentrationer i en blandning kan spåras genom att jämföra flera datafiler. Ämnen identifierades genom att söka efter dem i MW, mmw och THz-databaser med öppen källkod.15,16
Analys av 3 blodplasmaångor och njurångor med högupplöst Terahertz-spektrometer
Med våra THz-TDS-system mätte vi pelletstransmission i spektralområdet 0,2 till 1,4 THz,17 men vi vet att biomolekyler och i synnerhet dess nedbrytningsprodukter i gastillståndet har ett informativt svar (rotationsabsorption) spektra) vid dessa frekvenser och lägre också, så vi utförde en ytterligare studie på THz högupplöst gasspektrometer. De detekterade absorptionslinjerna av substanser hos diabetikerblodplasmasammanfaller med substanser från icke-diabetikerblodplasmaförutom aceton. Det finns många absorptionslinjer av aceton som ligger i spektrometerns arbetsfrekvensområde (118 till 178 GHz). Vanligtvis är det mer än tillräckligt att detektera någon absorptionslinje för ett ämne för entydig bestämning av förekomsten av ämnet i flerkomponentgasblandningen. Ett exempel på att registrera delar av absorptionsspektra med absorptionslinjen för aceton visas i Fig. 1. Aceton kan uppträda i blodet vid en störning av kolhydratmetabolismen. Som noterats i litteraturen innehöll blodet från patienter med diabetes -OH-butyrat och acetoacetat, men senare sönderdelade dessa ämnen till aceton och koldioxid.18 Koldioxid har inget dipolmoment; därför har den inga rotationsövergångar. Dess ökade innehåll kan endast detekteras genom att studera provets vibrationsspektrum i IR-området.
Plasmaångsubstanser, såsom karbonylsulfid (OCS), svaveldioxid (SO2), myrsyra (HCOOH), isocyansyra (HNCO) och ammoniak (NH3), upptäcktes i både humana diabetiker och humana icke-diabetikerprover. I vissa fall finns det en experimentlinje detekterad i spektra av provet som motsvarar fler linjer än en för ett ämne (t.ex. isocyansyra) i katalogdata (se tabell 2).15,16
Detta förklaras av det faktum att katalogerna innehåller data om de hyperfina strukturerna hos ämnen som inte löses upp i detta experiment eftersom linjerna har en ändlig bredd i storleksordningen flera hundra kHz. De erhållna absorptionslinjerna för de studerade ämnena sammanfaller med absorptionsspektra för ångor av kapillärblod ochblodplasmaav patienter med diabetes och villkorligt friska deltagare som publicerades i vårt tidigare arbete.19 De påvisade gasformiga substanserna kunde ha bildats under provberedningen som produkter av den kemiska omvandlingen av aminosyror. Frågan om dessa föreningar är av diagnostiskt värde kräver utredning. I klinisk praxis inom diabetologi används analysen av innehållet av dessa substanser ännu inte.
Ångorna frånblodplasmaav friska råttor innehöll karbonylsulfid (OCS), metantiol (CH3SH), butyronitril (C3H7CN), acetaldehyd (CH3CHO) och myrsyra (HCOOH). Provet avblodplasmaav diabetiska råttor skilde sig åt genom närvaron av aceton. Förutom absorptionslinjerna för propionitril (C2H5CN) detekterades metylformiat (CH3OCHO).
Ångproverna av torkade pellets från friska och diabetesråttornjurvävnaderstuderades. Ångorna avnjurvävnadav friska råttor innehåller karbonylsulfid (OCS), svaveldioxid (SO2), myrsyra (HCOOH), isocyansyra (HNCO), etylformiat (C2H5OCHO) och propylenglykol (CH2ðOHÞCHðOHÞCH3). Ånghalten hos diabetisk råttanjurvävnadskiljde sig från den friska råttan genom närvaron av inte bara karbonylsulfid (OCS) utan också dess isotopolog OCS-34. Acetaldehyd (CH3CHO), metantiol (CH3SH), etylensulfid (C2H4S), metanol (CH3OH) och glykolaldehyd (CH2ðOHÞCHO) detekterades också i ångorna från en pellet av diabetisk råttanjurvävnad(se fig. 2 och fig. 3).
Närvaron av svavelföreningar, såsom metantiol, kan specificeras av den termiska nedbrytningen av svavelaminosyror (metionin, cystein och cystin) i blodproteinkompositionen. Metionin är en essentiell aminosyra som inte syntetiseras i mänskliga organismer. Det erhålls från mat och är en svavelkälla för cysteinbiosyntes. När svavelaminosyror värmdes upp till temperaturer på cirka 240 grader detekterades metantiol och etylensulfid (metioninnedbrytning) i masspektrumet av dessa ämnen.20
4. Slutsats
Det molekylära innehållet hos människa och råttablodplasmaoch råttanjurvävnadunder termisk sönderdelning av proverna studerades med THz högupplösta spektrometer. Metoden för att bereda de biologiska proverna som pellets presenterades. Denna metod ger möjlighet att lagra och transportera prover. Den högupplösta gasspektroskopin gör det möjligt att bestämma innehållet av flerkomponentgasblandningar av vilket ursprung som helst, inklusive biologiska med spårkoncentrationer av gaskomponenter. Aceton upptäcktes hos diabetikerblodplasmaprover. Information om skillnaden i innehåll av diabetiker och friskablodplasmaav män och råttor och diabetiker och friska råttornjurvävnadererhölls från absorptionsrotationsspektra för ångor. Användningen av THz högupplöst spektroskopi ger en kvalitativ analys av komponentinnehållet i prover av blodångor ochnjurvävnaderpellets. Möjligheten att utföra den kvantitativa uppskattningen av koncentrationer av viktiga diabetesgasmarkörer beroende på patientens tillståndbör studeras i vidare utredningar.
