Anti-aging-effekten av sammetshornspolypeptid är beroende av modulering av tarmmikrobiotan och reglering av PPAR/APOE4-vägen DEL 1

Vi undersökte anti-aging effekterna av sammetshornspolypeptid på D-galaktos (D-gal)-inducerade åldrande möss. D-gal-inducerade åldrande möss etablerades och delades slumpmässigt in i fem grupper, kontroll-, modell-, vitamin E (VE), sammetshornspolypeptid lågdos och sammetshornspolypeptid högdosgrupper. Morris vattenlabyrinttest användes för att utvärdera inlärnings- och minnesförmågan hos åldrande möss. Hippocampusneuroner observerades via hematoxylin-eosinfärgning och transmissionselektronmikroskopi. Biokemiska metoder användes för att detektera aktiviteterna av superoxiddismutas, malonaldehyd och andra enzymer och utvärdera inverkan av sammetshornspolypeptid på antioxidantkapaciteten hos åldrande möss. Med hjälp av 16S rRNA-gensekvensering och meristemteknologi utvärderade vi effekten av sammetshornspolypeptid på åldrande mösss tarmflora och fettsyrametabolism. De experimentella resultaten visade att sammetshornspolypeptid avsevärt kunde förbättra åldrande möss inlärnings- och kognitiva förmågor och öka aktiviteterna av superoxiddismutas, glutationperoxidas och katalas i serumet för att minska malonaldehydhalten. Intestinal mikroekologisk analys visade att sammetshornspolypeptid avsevärt kunde öka det nyttiga bakteriesläktet lactobacillus överflöd. Western blot-analys visade vidare att sammetshornspolypeptid kunde främja fettsyrametabolism genom att aktivera peroxisomproliferatoraktiverad receptor (PPAR) och uppreglera uttrycket av nedströms enzymerna karnitin-palmitoyltransferas-1 A och acyl-CoA-oxidas 1 samtidigt som de nedreglerar det för apolipoprotein E4 (APOE4), vilket minskar fettsyraackumuleringen och ökar produktionen av adenosintrifosfat (ATP). Därför förbättrar sammetshornspolypeptid den intestinala mikroekologin och aktiverar PPAR/APOE4-vägen för att reglera fettsyrametabolismen.

Glykosid av cistanche kan också öka aktiviteten av SOD i hjärt- och levervävnader och avsevärt minska innehållet av lipofuscin och MDA i varje vävnad, effektivt rensa upp olika reaktiva syreradikaler (OH-, H₂O₂, etc.) och skydda mot DNA-skador orsakade av OH-radikaler. Cistanche-fenyletanoidglykosider har en stark rensande förmåga av fria radikaler, en högre reducerande förmåga än vitamin C, förbättrar aktiviteten av SOD i spermiesuspension, minskar innehållet av MDA och har en viss skyddande effekt på spermiemembranets funktion. Cistanche-polysackarider kan öka aktiviteten av SOD och GSH-Px i erytrocyter och lungvävnader hos experimentellt åldrande möss orsakade av D-galaktos, samt minska innehållet av MDA och kollagen i lungor och plasma, och öka innehållet av elastin, har en god renande effekt på DPPH, förlänger hypoxitiden hos åldrande möss, förbättrar aktiviteten av SOD i serum och fördröjer den fysiologiska degenerationen av lungor hos experimentellt åldrande möss. Med cellulär morfologisk degeneration har experiment visat att Cistanche har den goda antioxidantförmågan och har potential att vara ett läkemedel för att förebygga och behandla åldrande hudsjukdomar. Samtidigt har echinacoside i Cistanche en betydande förmåga att avlägsna DPPH-fria radikaler och har förmågan att avlägsna reaktiva syrearter och förhindra friradikal-inducerad kollagennedbrytning, och har även en god reparationseffekt på anjonskada av tymin-fria radikaler.

Klicka på Cong Rong Cistanche

【För mer information:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Nyckelord

Sammetshornspolypeptid; D-galaktos; Åldrande; Intestinal mikroekologi; Inlärning; Kognitiv försämring; PPAR/APOE4-väg; Mikrobiota

1. Introduktion

Sammetshornspolypeptid (VAP) står för 50–60 procent av sammetshornets våta vikt och är en av dess primära aktiva ingredienser [1]. VAP är rikt på proteiner, aminosyror, fosfolipider, kolesterol och kalciumjoner och utövar olika hälsofrämjande effekter, med antioxidanter [2], osteoporosresistens [3] och immunregleringseffekter [4] som har rapporterats. För att bättre förstå VAP:s roll i förebyggande och behandling av neurodegenerativa sjukdomar, bekräftade tidigare forskning från vår forskargrupp också att VAP kunde minska nivåerna av glukokortikoidreceptorn, mineralokortikoidreceptorn och kortikotropinfrisättande hormon. Effekterna av VAP på thalamus-hypofys-binjureaxeln och dess förmåga att hämma neuronal apoptos har också observerats [5].

Hjärnans åldrande är en naturlig fysiologisk process som kännetecknas av oxidativ stress (OS), ackumulering av oxidativa skademolekyler och förändringar i strukturen och funktionen hos neuroner, vilket i slutändan leder till kognitiv försämring och minnesförlust [6]. Bland dessa faktorer anses OS vara den primära orsaken till åldrande associerade neurodegenerativa sjukdomar [7]. När kroppen utsätts för skadliga stimuli uppstår en obalans mellan generering och avlägsnande av fria radikaler, vilket resulterar i en ökning av fria radikaler till en nivå som överstiger kroppens antioxidantkapacitet. Noterbart är att överdriven mängd fria radikaler är cytotoxiska och orsakar direkt skada på det centrala nervsystemet [8, 9]. Den mänskliga hjärnan står för endast 2–3 procent av den mänskliga kroppsvikten. Ändå står det centrala nervsystemet (CNS) för 20 procent av den totala syretillförseln i människokroppen. Därför är innehållet av neuronala fria radikaler i CNS betydande, vilket innebär en hög risk för OS [10].

Den mänskliga tarmmikrobiotan, som omfattar mer än 100 arter, omfattar ungefär 10-faldigt fler bakterier än mänskliga celler [11]. Firmicutes är den vanligaste arten inom människans tarmmikrobiota och står för 60 procent av det totala antalet bakterier, följt av Bacteroidetes (15 procent) och andra komponenter som står för en liten andel. Tarmmikrobiotan är i ett tillstånd av dynamisk balans med människokroppen, och tarmmikrober har en viktig roll i människans metabolism, endokrina funktioner och immunreglering. När tarmens mikrobiota struktur rubbas, kan därför neurodegenerativa sjukdomar, hjärt-kärlsjukdomar och fetma uppstå [12]. Förändringar i mängden och mångfalden av tarmmikroorganismer kan också påverka tarmsystemet och det centrala nervsystemet. Dessa interaktioner är kända som mikrobiota-tarm-hjärnans axel, vilket är viktigt för kroppsfunktionen [13, 14]. Även om förändringar i tarmmikrobiotaprofiler inte nödvändigtvis påverkar hälsan, är förlusten av mångfald i kärnmikrobiotan associerad med minskad kognitiv funktion och minne [15]. Med stigande ålder kännetecknas förändringarna i bakteriefloran i första hand av minskad mångfald, probiotika, fakultativa anaerober och totala kortkedjiga fettsyror [16].

Även om många studier har bekräftat att VAP-associerade antioxidanter och anti-aging effekter dämpar åldrandet, har den exakta mekanismen bakom denna aktivitet förblivit oklar. I det föreliggande arbetet utvärderades därför anti-aging-effekten av VAP in vivo i möss via Morris water maze (MWM) test, biokemisk analys, hematoxylin-eosin (H&E) färgning och transmissionselektronmikroskopi (TEM). Dessutom utvärderade vi förändringarna i tarmmikroekologin i åldrande musmodeller behandlade med VAP med hjälp av 16S ribosomalt RNA (rRNA) gensekvenseringsteknologi. Vårt mål var att belysa mekanismen för VAP-aktivitet i samband med åldrande och tillhandahålla en teoretisk grund för utvecklingen av nya anti-aging terapeutiska metoder.

2. Material och metoder

2.1 Experimentmaterial

VAP was provided by the Molecular Pharmacology Laboratory, Changchun University of Chinese Medicine. Dgalactose (D-gal) and VE (purity >90 procent) köptes från Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, Kina). Kommersiellt superoxiddismutas (SOD), malonaldehyd (MDA), katalas (CAT) och glutationperoxidas (GSH-Px) kit köptes från Nanjing Jiancheng Technology Co., Ltd. (Nanjing, Kina). Alla kemikalier och reagens var av analytisk kvalitet.

Morris vattenlabyrint (MWM) videospårning och analyssystem köptes från Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd. (Chengdu, Kina). Ett transmissionselektronmikroskop köptes från Tecnai Corporation (Hillsboro, OR, USA). Högkapacitetssekvenseringsplattformen (MiSeq PE300) tillhandahålls av Illumina (San Diego, CA, USA).

2.2 Djurförsök

Sextio friska ICR-möss (SPF-klass, hälften hane och hälften hona, vägande 22–26 g) köptes från Changchun Yisi Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (certifikat nr. SCXK(Ji) -2018-0007). Mössen växte upp i separata burar under 12 timmars ljus/mörker-cykler och en standardtemperatur (22 ± 2 ◦C), med mat och vatten tillhandahållet ad libitum. Alla möss anpassades till dessa förhållanden under minst en vecka innan experimenten började. Alla möss delades in i fem grupper, kontroll-, modell-, vitamin E (VE), VAP lågdos (VAP1) och VAP högdos (VAP2) grupper. VE-, VAP1- och VAP2-grupperna administrerades VE (100 mg/kg), VAP (200 mg/kg) respektive VAP (400 mg/kg) under 10 dagar, medan kontroll- och modellgrupperna fick destillerat vatten (samma volym och via samma intragastriska väg). Från och med den 11:e dagen injicerades kontrollgruppen subkutant med normal koksaltlösning. D-gal (1000 mg/kg) injicerades subkutant i nacken på mössen i de andra grupperna, och modelladministrationen fortsatte i 60 dagar.

2.3 Morris vattenlabyrint

MWM-testet utfördes 1 timme efter D-gal-administrering på dag 57. Kortfattat placerades en plattform i mitten av vattenlabyrinten. Vatten sattes till plattformen tills den översteg 1 cm och hölls vid ungefär 25 ◦C. Mössen tränades kontinuerligt i 1 vecka, och MWM-testet utfördes formellt enligt standardförfarandet för vattenlabyrinten. Innan experimentets officiella start sattes titandioxid till vattnet så att mössen inte kunde uppfatta plattformens specifika position. Mössens huvuden färgades gula för att spåra och samla in data. Morris vattenlabyrint videospårningsanalysmjukvara registrerade mössens simbana, procentandelen av uppehållstid i mittringen och procentandelen av mittringens rörelseavstånd.

2.4 H&E-färgning

Hela hjärnan hos möss fixerades i en 4-procentig paraformaldehydlösning och bäddades in i paraffin. Efter 24 timmar sektionerades hjärnvävnaderna, avparaffinerades, rehydrerades och färgades med H&E. Sektionerna observerades sedan under ett optiskt mikroskop för att registrera de patologiska förändringarna.

2.5 ARTIKEL

Efter perfusion skars hippocampusvävnaderna av, fixerades med 2 procent paraformaldehyd och 2,5 procent glutaraldehydfosfatbuffertlösning, dehydrerades med en alkoholgradient, rengjordes med etoxipropan, bäddades in, skars i skivor och färgades med uranylacetat och blycitrat. Ultrastrukturen av hippocampala neuroner observerades under ett transmissionselektronmikroskop.

2.6 Biokemiska analyser

Musblodprover samlades in och centrifugerades vid 3000 rpm under 15 minuter vid 4 ◦C, varefter supernatanten samlades upp. Serum-MDA-innehållet och SOD-, GSH-Px- och CAT-aktivitetsbestämningen utfördes alla av kitinstruktionerna.

2.7 Mikrobiotaprofilering av fekala prover

Totalt DNA extraherades från fekala prover och användes som en mall för att PCR förstärka V3–V4-regionen av den bakteriella 16S rRNA-genen. Den råa datamängden deponeras i NCBI BioProject PRJNA731623 under BioSample-accessionsnumren SAMN19291644 till SAMN19291668. PCR-produkterna analyserades kvantitativt och 16S rRNA-gensekvensering utfördes med användning av en Illumina MiSeq-plattform (Illumina, San Diego, USA). Rådata baseras på den minsta överlappningslängden på 10 bp, med ett maximalt tillåtet missmatchningsförhållande i överlappningsområdet på 0,2 (standard). Avläsningarna av varje prov skarvades och taggar med längder mindre än 75 procent av taggens längd efter kvalitetskontroll filtrerades. Chimärerna (det vill säga om de två föräldrarna har en sekvens som är mer än 80 procent lik frågesekvensen, då bedöms frågan vara en chimär) togs bort för att få tag-sekvenser av hög kvalitet. Forskningsprogramvara (Sonoma, USA) [17] användes för att gruppera taggar på en 97-procentig likhetsnivå, klassificera operationella taxonomiska enheter (OTU), erhålla artklassificering baserad på OTU-sekvenssammansättning och plotta provspädning [18] och Shannon-indexkurvor . PICRUST (Halifax, CAN) [19] användes för att bestämma den funktionella gensammansättningen för varje prov genom jämförelse av artsammansättningsinformationen enligt 16S rRNA-gensekvenseringsresultat. På så sätt kunde funktionella skillnader mellan olika prover eller grupper bestämmas. Överflöd, vägar, EG-information och OTU-överflöd i samband med varje funktionell kategori erhölls med hjälp av Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes [20] databasen.

2.8 Väst blotting

Totalt protein extraherades från hjärnvävnad och Coomassie brilliant blue-metoden användes för att bedöma proteinkoncentrationen. Sedan, efter SDS-PAGE-elektrofores, har proteinerna överförts till membranet, som sedan inkuberades med primära antikroppar mot målproteiner apolipoprotein E (APOE4), acyl-CoA-oxidas 1 (ACOX1), peroxisomproliferatoraktiverad receptor (PPAR ), karnitin-palmitoyltransferas-1 A (CPT1A) och glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH) över natten vid 4 ◦C. Därefter tvättades membranet och inkuberades sedan med en sekundär antikropp vid rumstemperatur under 1 timme. Efter tvättning av membranet med Tris-buffrad saltlösning och Tween 20 (TBST), tillsattes en förstärkt kemiluminescerande (ECL) lösning. Ett helautomatiskt gelbildsystem (Aplegen, Pleasanton, USA) används för skanningsfotografering.

2.9 Detektering av nivåer av fria fettsyror (FFA) i hjärnvävnad

Hjärnvävnader från mus samlades upp och en lämplig mängd normal saltlösning tillsattes. Därefter centrifugerades proverna vid 4 ◦C vid 3000 rpm under 10 minuter och supernatanterna samlades upp. FFA-nivåerna i hjärnvävnader bestämdes av kitinstruktionerna.

2.10 Detektion av ATP-innehåll i hjärnvävnad

Hjärnvävnader från mus samlades upp och lyserades vid ett förhållande mellan hjärnvävnad:lysbuffert av 1:5. Därefter centrifugerades proverna vid 12,000x g vid 4 ◦C under 5 minuter, och supernatanterna samlades in. ATP-innehållet i hjärnvävnader bestämdes av kitinstruktionerna.

2.11 Statistisk analys

SPSS 19.0 (Chicago, IL, USA) användes för dataanalys. Resultaten uttrycks som medel ± standardavvikelse (x ± s). Elevens t-test användes för att jämföra grupper, och skillnaderna ansågs signifikanta vid P < 0.05 eller P < 0,01.

3. Resultat

3.1 Förbättring av kognition, inlärning och minne hos åldrande möss som behandlats med VAP

MWM-testet förlitar sig på djurens överlevnadsinstinkt för att hitta flyktplattformen och involverar sökning efter en minnesrelaterad rumslig position. Fig. 1 visar representativa spår av möss som administrerades MWM-testet den sista dagen. Musbeteendets bana för modellgruppen var mer komplicerad och oregelbunden, och mössen hittade inte plattformen. Notera att beteendebanan för mössen i VAP1- och VAP2-grupperna var enkel, och en plattform hittades. Jämfört med kontrollgruppen minskade procentandelen retentionstid i mittringen och procentandelen av avståndet som flyttades av mittringen i modellgruppen signifikant (P < 0.01). Jämfört med modellgruppen ökade procentandelen retentionstid i mittringen och procentandelen av avståndet som förflyttades av mittringen signifikant i grupperna VE, VAP1 och VAP2 (P < 0.05, P < 0,01). Dessa fynd tyder på att administreringen av VAP förbättrade den kognitiva förmågan hos D-gal-inducerade åldrande möss.

3.2 Skyddande effekt av VAP på hippocampala neuroner i åldrande möss

H&E-färgning användes för att observera den patologiska morfologin hos hjärnvävnader i åldrande möss för att undersöka om VAP kunde förbättra D-gal-inducerad neuronal patologisk skada (Fig. 2A). CA1-cellerna i hippocampi från kontrollgruppen var rikliga, med normal cellstruktur, fullständig morfologi och uppenbara kärnor. Däremot minskade antalet CA1-celler i hippocampi från modellgruppen och visade oregelbunden morfologi, utan några uppenbara nukleoler observerade under mikroskopet. Neuronerna i CA1-området i hippocampi var relativt normala, och kärnkrympningen minskade i VE-gruppen jämfört med modellgruppen. Anmärkningsvärt var att CA1-området i hippocampi från VAP1- och VAP2-grupperna skilde sig signifikant från det som observerades i modellgruppen och liknade det för kontrollgruppen. Strukturen var relativt normal, cellerna var tätt arrangerade och regelbundna, och morfologin var komplett.

TEM användes vidare för att observera ultrastrukturen av hippocampusneuroner i åldrande möss och för att förstå om VAP:s vändande effekt på nedgången i inlärning och minne var associerad med reglering av neuronmikrostruktur i hjärnan (Fig. 2B). Hippocampusneuronerna visade en intakt morfologi, enhetlig kromatinfördelning och rikliga organeller i cytoplasman i kontrollgruppen. Vid hög förstoring var mitokondrierna elliptiska, med ett klart dubbelt yttre membran och intakta cristae. Däremot var neuronerna i hippocampusregionen i modellgruppen onormala; tidiga apoptotiska förändringar såsom kromatinkondensation observerades; lipofuscinkroppar var vanligare; den synaptiska strukturen var oklar; lipiddroppar spreds och vesikelliknande expansion av Golgi-komplexet och reducerat grovt endoplasmatiskt retikulum detekterades. Anmärkningsvärt nog, jämfört med modellgruppen, hade VAP1- och VAP2-grupperna hippocampala neuroner som tenderade att vara normala i struktur och morfologi, med släta kärnmembran, normala nukleoler och rikliga organeller. Noterbart observerades fler synapser, de synaptiska vesiklarna i det främre membranet hade inte onormal aggregering, morfologin hos den intracytoplasmatiska Golgi-kroppen och mitokondrierna var normal och lipofuscin var sällsynt.

3.3 Effekter av VAP på oxidativ skada-relaterade enzymer

En negativ effekt av OS är produktionen av fria radikaler i kroppen, en av de primära orsakerna till åldrande och sjukdom (Fig. 3). Jämfört med kontrollgruppen minskade aktiviteterna av SOD, CAT och GSH-Px i serum från D-galadministrerade modellmöss signifikant (P < 0.01, P < {{7 }}.{{10}}5), och MDA-innehållet ökades avsevärt (P < 0.05), vilket indikerar framgångsrik modellering. Jämfört med modellgruppen ökade aktiviteterna för SOD, CAT och GSH-Px i VE-gruppen signifikant (P < 0.01, P < 0.05) . Jämfört med modellgruppen ökade aktiviteterna för SOD och GSH-Px i VAP1-gruppen signifikant (P <0,05, P <0,01). Däremot ökade CAT något men var inte signifikant annorlunda. Jämfört med modellgruppen ökade aktiviteterna för SOD, CAT och GSH-Px i VAP2-gruppen signifikant (P < 0,05, P < 0,01). Jämfört med modellgruppen reducerades serum-MDA-innehållet hos möss i VAP1- och VAP2-grupperna signifikant (P < 0,05). Ovanstående resultat indikerar att anti-aging-effekten av VAP är relaterad till att förbättra aktiviteten av serumantioxidantenzymer i åldrande möss och minska lipidperoxidation.

3.4 Effekter av VAP på sammansättningen och mångfalden av tarmmikrobiotan hos möss

16S rRNA-gensekvenseringsresultaten gav 1 999,46 0 PE-läsningar, och efter filtrering och borttagning av chimärer erhölls 1 776 708 effektiva taggar. De genomsnittliga sekvenslängderna för proverna i kontroll-, modell-, VE-, VAP1- och VAP2-grupperna var 417,2, 416,2, 418,2, 421,0 respektive 420,4 bp. Förhållandet av läsningar med ett Phred-kvalitetspoäng över 30 (Q30) varierade från 94,15 till 95,71 procent.

Därefter bestämde vi tarmmikrobiotasammansättningen med hjälp av 16S rRNA-genen. Taggarna som erhölls genom sekvensering med hög genomströmning klustrades vid en likhetsnivå på 97 procent, och ett Venn-diagram genererades (Fig. 4A). Varje grupp hade 490 OTU:er, och det fanns i princip inga specifika OTU:er per grupp. För att verifiera om sekvenseringsdjupet uppfyllde kraven på artidentifiering, ritade vi Shannon- och sällsyntskurvor för alla prover (Fig. 4B, C). Båda kurvorna i alla prover var nära mättnadsplatån, vilket avslöjade en hög täckning (99 procent). Dessa data tyder på att den stora majoriteten av den mikrobiella mångfaldsinformationen i proverna extraherades och att bakteriesamhällets struktur och mångfald kunde bestämmas exakt.

Alfa-mångfald speglar artöverflöd (rikedom) och artmångfald. Shannon- och Simpson-index används för att mäta arternas mångfald och påverkas av förekomsten av arter i provsamhället och arternas jämnhet (gemenskapens jämnhet). Ju större Shannon-indexvärde, desto mindre Simpson-indexvärde, vilket indikerar att artdiversiteten i provet är högre [21]. Resultaten som presenteras i Fig. 4D visar inga signifikanta skillnader i Shannon-indexvärdena för musfloran mellan grupperna.

Jämfört med kontrollgruppen har Simpson-indexvärdet för modellgruppen ingen signifikant skillnad. Ingen signifikant skillnad observerades mellan modellgruppen och varje behandlingsgrupp. Dessa resultat visar ingen signifikant skillnad i mångfalden av tarmfloran hos möss mellan grupperna.

PCA utfördes på musens tarmflora (Fig. 4E), där PC1 och PC2 är de två karakteristiska värden som orsakar den största skillnaden mellan proverna. Resultaten visade att 32,94 och 19,74 procent av graden av påverkan stod för PC1 respektive PC2. Ju längre poängen är desto större är skillnaden. De fem grupperna av prover är grupperade i tre kategorier, med modellgruppsproven fördelade i det övre vänstra hörnet av figuren, långt borta från de andra grupperna. Kontroll-, VE- och VAP2-grupperna visade fler överlappningar, och de tre grupperna av prover låg nära varandra. Den övre mitten av fig. 4E visar att efter VAP-intervention förbättrades likheten mellan tarmfloran hos VAP2-gruppen av möss och kontrollmössen.

Skillnaderna i mängden bakterier i kontrollmodellen, VE-, VAP1- och VAP2-grupperna utvärderades för de 20 bästa släktena (Fig. 4F). Förekomsten av Lachnospiraceae_NK4A136_gruppen och Lactobacillus var olika mellan kontroll- och modelldjuren, där förekomsten av Lactobacillus i modellgruppen minskade signifikant. Däremot ökade mängden av de återstående släktena avsevärt. Noterbart är att Lactobacillus-medlemmar är probiotika med anti-aging och antiinflammatoriska effekter [22, 23]. Därför var dessa resultat inte överraskande. Anmärkningsvärt nog ökade förekomsten av Lactobacillus signifikant i VAP1- och VAP2-grupperna jämfört med modellgruppen, vilket tyder på att VAP kan öka innehållet av nyttiga bakterier i tarmen, vilket förhindrar åldrande.

【För mer information:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】