Hur cellmembranreparationsproteiner reglerar transkriptionsfaktorsignaltransduktion för att kontrollera njurfibros

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Haichang Li

Njurefibros är förknippat med progressionen av akutnjureskada på kronisk njursjukdom. MG53, ett cellmembranreparationsprotein, har visat sig skydda mot skador på njurepitelceller och akut njurskada. Här utvärderade vi MG53:s roll i moduleringen avnjurefibros hos åldrande möss och hos möss med unilateral ureteral obstruktion (UUO) en känd modell av progressiv njurfibros. Möss med ablation av MG53 utvecklade mer interstitiell fibros med åldern än MG53-intakta möss i samma ålder. På samma sätt, i frånvaro av MG53,njurefibros var överdriven jämfört med möss med intakt MG53 i den obstruerade njuren jämfört med den kontralaterala fria njuren eller njurarna hos skenopererade möss. Urinröret blockeratnjurarfrån MG53-deficienta möss visade också signifikant mer inflammation än ureteral obstruerade njurar från MG53 intakta möss. In vitro-experiment visade att MG53 kunde komma in i kärnorna i proximala tubulära epitelceller och direkt interagera med p65-komponenten i transkriptionsfaktorn NF-kB, vilket ger en möjlig förklaring av ökad inflammation i frånvaro av MG53. För att testa detta gavs förstärkt MG53-uttryck genom konstruerade celler eller direkt rekombinant proteintillförsel till möss som utsattes för UUO. Detta minskade NF-kB-aktivering och inflammation och försvagade njurfibros. Således kan MG53 ha en terapeutisk roll vid behandling av kronisk njurinflammation och därigenom ge skydd motfibrossom leder till fenotypen av kronisk njursjukdom.

Cistanche tubulosa förebygger njursjukdom, klicka här för att få provet

Translationellt uttalande Kronisk inflammation leder till fibrotisk ombyggnad som också kan ligga bakom övergången från akut njurskada till kronisk njursjukdom. Aktivering av den proteininflammatoriska transkriptionsfaktorn nukleär faktor-kB (NF-kB) är involverad i patogenesen av njurinflammation. Här ger vi bevis för att MG53, ett tidigare identifierat cellmembranreparationsprotein, interagerar direkt med NF-kB och minskar dess transkriptionsaktivitet. Samtidigt kan exogent administrerat MG53 minska fibrotisk ombyggnad av den inflammerade njuren. Dessa fynd pekar på ett skyddande samspel mellan MG53 och NF-kB för att dämpa utvecklingen av inflammationsmedierad njurfibros. Farmakologisk administrering av MG53 kan vara ett lovande tillvägagångssätt för behandling av progressiv njurfibros.

Njurdysfunktion, som kan klassificeras som akut njurskada (AKI) eller kronisk njursjukdom (CKD), har vuxit till en epidemi i äldre populationer. Under 2017 nådde prevalensen av CKD 14,5 procent av personer i åldern 65 år och äldre, vilket resulterade i Medicare-utgifter på över 84 miljarder dollar för behandling.^1,2AKI och CKD är vanligare hos äldre individer, främst på grund av ökad känslighet för skador plus en minskad förmåga att reparera den åldrande njuren. Kliniska studier har visat att CKD är en viktig riskfaktor för AKI, och omvänt kan episoder av AKI påskynda utvecklingen av CKD mot njursjukdom i slutstadiet. För närvarande är behandlingen av AKI huvudsakligen stödjande, och behandlingen av etablerad CKD är fokuserad på att bromsa progressionen genom hämning av renin-angiotensin-aldosteronsystemet och nu möjligen genom hämning av natrium-glukossamtransportör-2.^3,4

Beroende på skadans svårighetsgrad kan proximala tubulära celler, huvudmålet för akut skada, genomgå förändringar i cellcykelprogression, 5,6 metabolism,7 utsöndring av proteininflammatoriska och profibrotiska cytokiner, eller partiell epitel-mesenkymal övergång,8 som kommer att avgöra om ombyggnad/reparation kommer att vara framgångsrik eller maladaptiv och resultera i njurfibros, ett kännetecken för CKD.9,10 Denna ombyggnad sker vanligtvis på en bakgrund av njurinflammation,

minskat kärltillförsel och produktion av extracellulära matrisproteiner (ECM) och inkluderar förlust av epitelceller och ackumulering av kollagener, a-slätmuskelaktin och fibronektin; den har också en hög korrelation med försämring av njurfunktionen.

Kronisk inflammation leder till fibrotisk ombyggnad som också kan ligga till grund för övergången från AKI till CKD.11–13 Kumulativ forskning tyder på involveringen av nukleär faktor-kB (NF-kB) transkriptionsfaktor i patogenesen av njurinflammation orsakad av infektion, skada, eller transplantation.11,12,14 Aktivering av den kanoniska NF-kB-vägen börjar med aktivering av hämmaren av NF-kB (IkB)-kinas, vilket leder till fosforylering och nedbrytning av IkBa och nukleär translokation av NF-kB-heterodimerer.15 Aktivering av NF-kB-signalering i njurepitelceller och infiltrerande immunceller kan framkallas av patofysiologiska triggers som exponering för lipopolysackarider (LPS) eller ischemi-reperfusionsskada.16 Molekylära profileringsstudier visar att nfkb1 är en viktig drivkraft för njurfibros.¹⁷Förutom tubulära njurceller bidrar medfödda immunceller som makrofager och dendritiska celler också till njurskada, inflammation och fibrotisk ombyggnad.^13,18–20

cistanche är effektivt för att behandla njurdysfunktion

Växande bevis tyder på att muskelhärledda sekretoriska faktorer (dvs myokiner) modulerar systemisk fysiologi via vävnadsöverhörning för att påverka utvecklingen av njursjukdomar.²¹MG53 (även kallat TRIM72) är ett muskelberikat tredelat motiv (TRIM) protein med en kritisk funktion i cellmembranreparation.22,23 TRIM-familjens proteiner har olika funktioner, allt från reglering av immunsignalering till vävnadsreparation.²⁴MG53-medierad membranreparation är involverad i att lindra akuta skador på skelettmuskulaturen,²⁵njurar,²⁶hjärta,²⁷ lungor, 28 hjärnor,^29,30och hud.³¹Våra tidigare studier identifierade en låg nivå av MG53-uttryck i njuren, vilket är en nyckelkomponent i AKI-skydd, och möss med brist på MG53 (mg53 / ) var mer mottagliga för stressinducerad AKI.²⁶Vi har också nyligen visat att ihållande höjning av MG53 i cirkulationen förbättrar reparation och regenerering av vävnadsskada.32 Den relativa rollen för njurspecifik och yttre cirkulerande MG53 för att modulera njurfibros under progressiv CKD är fortfarande okända.

Nyligen har en framväxande roll för MG53 för att modulera vävnadsskydd genom hämning av inflammation, särskilt via modulering av NF-kB-signalering, utvecklats. Till exempel dämpar MG53 LPS-inducerad neurotoxicitet och neuroinflammation genom att hämma TLR4/NF-kB-vägen33 och hjärt-MG53 reglerar KChIP2-uttryck för att kontrollera elektrofysiologisk ombyggnad under kardiohypertrofi.34 Dessutom visade vi en dubbel funktion av MG53 i förhindrar en maladaptiv hyperinflammatorisk respons under en subletal influensa A-virusinfektion, kännetecknad av överdriven interferon-b-produktion, via undertryckande av IRF3/NF-kB-aktivering och hämning av avvikande intracellulär Ca2þ-signalering i makrofager.35 Vidare, vid en dödlig dos av influensa A virusinfektion, visades MG53 förhindra dödlighet och lungskador, inte genom att direkt påverka virustitrar i sig utan genom att mildra cytokinstorm (interferon-b, interleukin-6 och interleukin-1b) genom negativ reglering av NLRP3-inflammasomen och förebyggande av pyroptos i lungan.36 Dessutom var högdos kronisk behandling av exogent MG53 kopplat till suppression av NF-kB – medierad inflammation i det åldrade hjärtat.37 Dessa studier tyder på att MG53 kan modulera avvikande NF-kB-signalering under inflammation men om detta inträffar i samband med njurinflammation har inte studerats.

Vi postulerade att MG53 reglerar njurinflammation genom att modulera transkriptionsaktiviteten av NF-kB och på så sätt kan dämpa njurfibros som uppstår som en konsekvens av kronisk inflammation. Denna studie genomfördes för att ta itu med denna hypotes.

cistanche är effektivt vid behandling av njursjukdomar

METODER

Djurstudier

Alla experiment med djur följde National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals och följde protokoll som godkänts av Ohio State University Institutional Animal Care and Use Committee. Åldersmatchad vildtyp (WT) eller mg53^-/-icke-kullskamrater av 129S1/SvImJ-stammen användes22 för att fastställa rollen av MG53 i moduleringen av åldersberoende och unilateral ureterobstruktion (UUO)-inducerad njurfibros. C57B6/J-möss (9–10 veckor) köptes från Jackson Labs.

För njurskadestudier utsattes möss (9–12 veckor) för UUO för att inducera njurfibros. Möss bedövades via isofluran (1,5 procent –2,0 procent) för att säkerställa ett djupt anestesiplan. UUO-proceduren utfördes genom att ligera den vänstra urinledaren med 5-0 kirurgiskt silke två gånger enligt publicerade protokoll.38 Shammöss hade bara ett bukhudsnitt. För att utvärdera effekten av rhMG53 på obstruktiv njurskada fick 1 grupp UUO-möss rhMG53 (2 mg/kg) via svansvensinjektion med början omedelbart efter UUO-operation (dag 0) och sedan dagligen i 7 dagar, med 2 ytterligare doser dag 9 och 11. En kontrollgrupp av UUO-möss fick saltlösningsinjektioner enligt samma schema. Möss dödades på dag 12 efter UUO-kirurgi, njurarna perfunderades in situ med fosfatbuffrad saltlösning och vävnadsprover från UUO-njuren och den kontralaterala njuren samlades in för histologi och Western blot-analys.

I separata studier, WT och mg53^-/-möss genomgick UUO eller skenoperation och avlivades dag 7 efter operationen. MG53 gavs till möss med en cellbaserad terapimetod.39 RAW 264.7-makrofager infekterades med doxycyklin (DOX)-beroende Ad tPA-MG53-körsbärsviruspartiklar under 24 timmar. De infekterade cellerna (vid en koncentration av {{10}} /100 ml saltlösning per mus) injicerades i svansvenen i möss omedelbart efter operationen (dag 0 injektion). Möss fick 4 injektioner av Ad-tPA-MG53-transducerade RAW-celler dag 0, 1, 3 och 6. Omedelbart efter cellinjektion dag 0 randomiserades mössen till en grupp som fick och en grupp som inte fick DOX (2 mg/ml i 5-procentig sackaroslösning) i sitt dricksvatten i 7 dagar och sedan avlivas. Vävnadsprover från UUO-njuren och kontralaterala njurarna samlades in för histologi-, RNA- och proteinanalyser.

Statistiska analyser Data uttrycks som medelvärde -SD. En jämförelse inom grupper gjordes med hjälp av Students t-test vid jämförelse av två experimentella grundforskningar H Li et al.: MG53 modulerar NF-kB i njurfibros 2 Kidney International (2021) -, ---grupper och 1-vägsanalys av varians för mer än 2 grupper (Graphpad Prism 8.2; GraphPad) följt av antingen Bonferroni eller Holm-Sidak multipla jämförelsetest ad hoc. Ett värde på P < 0,05="" ansågs="" vara="" statistiskt="">

Kompletterande metoder Fullständiga metoder inklusive histologisk utvärdering, serumkreatininmätningar, plasmidkonstruktioner, cellodling och primär tubulär epitelcellisolering, adenovirusberedning och cellinfektion, NF kB p65 nukleär translokationsanalys, immunhistokemi och konfokala bilder, NF-kB-analys av luciferaser, cytokinrapport enzymkopplad immunosorbentanalys, vävnadsfraktionering, immunblotting, coimmunoprecipitation, kvantitativ realtidspolymeraskedjereaktion (kompletterande tabell S1) och rhMG53-produktion finns i de kompletterande metoderna.

cistanche tubulosa extrakt: behandling av njursjukdom

RESULTAT

Möss med ablation av MG53 utvecklar åldersberoende njurfibros

Vi jämförde effekten av åldrande på njurfunktion och fibros i mg53^-/-och WT-möss. Vi bekräftade vår tidigare observation att även om serumkreatininnivåerna hos unga möss (2 månader) med och utan MG53 inte var signifikant olika, så var äldre (16–20 månader) mg53-/-möss uppvisade ett signifikant högre serumkreatinin än åldersmatchade WT-kontroller (Figur 1a). Baserat på trikromfärgning fann vi att mg53-/-möss hade mer njurfibros jämfört med WT-möss, med början vid 5 månaders ålder och fortsatte genom 20 månaders ålder (Figur 1b och c). Immunhistokemisk färgning användes för att utvärdera effekten av MG53-ablation på infiltrationen av leukocyter, monocyter och makrofager i 2-månader och 5-månader gamla musnjurar (Figur 1d och e). Njurar från unga WT- och mg53-/- möss hade liknande nivåer av intrarenala leukocyter, men signifikant fler inflammatoriska celler hittades i mg53/njurar än WT-njurar hos 5-månadsgamla möss.

Dessutom visade immunhistokemi för a-slätmuskelaktin och fibronektin, 2 extracellulära matrisproteiner som vanligtvis finns i områden med njurfibros, förbättrad (3- till 8-faldig) färgning i glomeruli och tubulointerstitium i njurarna från { {4}}månadsgamla mg53-/- möss jämfört med 10-månadsgamla WT-möss (kompletterande figur S1).

UUO inducerar förvärrad njurinflammation och fibros hos mg53-/- möss Njure MG53-nivåer som detekteras genom immunblotting ökade signifikant 7 dagar efter UUO (Figur 2a). Njurarna i mg53-/- UUO visade överdriven fibros, med ytterligare 30 procent trikromfärgad yta, än WT UUO-njurarna (Figur 2b).

MG53 modulerar NF-kB-aktivering och p65 nukleär lokalisering

Aktiviteten hos NF-kB (p65) bedömdes i UUO-modellen. Antalet totalt p65 (t-p65) ökade signifikant i UUO-njurar från WT och mg53/möss, men NF-kB-aktivering, bedömd som fosforylering av p65, var större (16-faldigt) i mg53/UUO njure än WT UUO-njuren (2-faldigt) jämfört med skenopererade djur (Figur 3a). Vi analyserade de relativa RNA-nivåerna av transformerande tillväxtfaktor b1 (TGF-b1), plasminogenaktivatorinhibitor-1 (PAI-1) och kollagen typ I alfa 1 (Col1a1) i den obstruerade njuren.40 Vi upptäckt låga nivåer av genuttryck i skendjur och liknande induktion (TGF-b1, w10 gånger; PAI-1, w40 gånger; Col1a1, w40 gånger) i UUO-njuren från WT och mg53 / (Figur 3b). För att undersöka den rumsliga fördelningen av MG53 i njurbarken under normala förhållanden analyserades njurvävnadsfraktioner. Vi fick regelbundet 10-faldigt mer totalt cytosolprotein än det totala extraherade nukleära proteinet. t-p65-nivåerna var jämförbara i den cytosoliska fraktionen mellan WT och mg53-/- möss men var högre i kärnfraktionen av mg53-/- möss (Figur 3c). MG53 detekterades i cytosolfraktionen (med tubulin som cytosolmarkör). Oväntat upptäcktes en betydande mängd MG53 vid kärnfraktionen (med histon H3 som en kärnfraktionsmarkör).

För att bekräfta detta fynd undersökte vi också MG53-lokalisering i skelettmuskelfraktioner (kompletterande figur S2). Vi reproducerade våra tidigare studier där MG53 lokaliserades till cytosolen och det sarkolemmala membranet (natrium-kaliumadenosintrifosfatas som en markör för membranfraktion) 22,23,25 men också detekterade berikad nukleär MG53 från skelettmuskulaturen.

MG53 interagerar med p65 för att kontrollera tumörnekrosfaktor-a-inducerad transkriptionsaktivitet För att bekräfta våra vävnadsfraktioneringsresultat genomförde vi följande immunhistokemiska studier. I odlade WT proximala tubulära epitelceller hittades p65 huvudsakligen i cytosolen men lokaliserad till kärnor i frånvaro av MG53 (Figur 4a). När dessa celler behandlades med LPS (5 mg) i 8 timmar var pro-inflammatorisk cytokinutsöndring signifikant större i mg53/celler än WT-celler (Figur 4b).

Eftersom dessa data antydde att MG53 kan interagera med p65 för att reglera inflammatoriskt cytokinuttryck, utvärderades en direkt interaktion mellan p65 och MG53 genom samimmunoprecipitationsanalyser med användning av HEK293-celler samtransfekterade med Flag-p65 och HA-MG53. Vi visade en svag interaktion (Figur 4c). Samtransfektion av GFP-p65- och RFP-MG53-plasmider och konfokal analys bekräftade kolokalisering av p65 och MG53 (Figur 4d). Vi kvantifierade sedan huruvida MG53 påverkar NF-kB (p65) transkriptionell aktivitet efter TNF-stimulering genom att mäta luciferasaktiviteten från en stabil NF-kB/293-GFP-Luc transkriptionell reportercellinje som transient transfekterats med någon av pHM6-vektorerna eller HA-MG53. Reportercellerna innehåller en transducerad lentivirusuttrycks-luciferasreporter för eldfluga som drivs av en minimal cytomegaloviruspromotor i kombination med 4 kopior av konsensus-NF-kB-transkriptionssvarselement (kB-ställe) uppströms. I frånvaro av TNF-a detekterades mycket låg inre luciferasaktivitet i reportercellerna som uttryckte MG53-proteiner. MG53 undertryckte TNF-a-framkallad NF-kB (p65) transkriptionsaktivitet med cirka 40 procent (Figur 4e).

Överuttryck av MG53 förhindrade NF-kB p65 nukleär translokation vid TNF-a behandling NF-kB p65 translokerad till kärnan vid TNF-a behandling i njurens proximala tubuli epitel.41 Att undersöka om behandling med MG53 skulle kunna dämpa NF-kB p65 nukleär translokation vid TNF-a-stimulering överuttryckte vi MG53 i HKC-8-celler antingen via DOX-beroende Ad-tPA-MG53 viral transduktion eller genom behandling med rekombinant humant MG53 (rhMG53). Med hjälp av en MG53-specifik monoklonal antikropp, efter DOX-beroende induktion, upptäcktes MG53 genom immunblotting. MG53 var närvarande på en mycket hög nivå i Ad-tPA-MG53-transducerade HKC-8-celler,

motsvarande 1 ng rhMG53/mg cellulärt lysat. Däremot tog HKC-8 upp och uttryckte en mycket mindre mängd rhMG53 (Figur 5a). Upptaget av FL fluorescensmärkt rhMG53 av HKC -8 bekräftades med konfokalmikroskopi (kompletterande figur S3). Efter TNF-a-behandling var tiden till maximal p65-aktivering 15 till 30 minuter (Figur 5b). Under basala förhållanden fanns NF-kB p65 huvudsakligen i cytosolen, och överuttryck av MG53 ändrade inte detta (Figur 5c och d). Efter TNF-a-stimulering translokerades emellertid p65 till kärnorna i HKC-8-celler som inte överuttrycker MG53. Som jämförelse föll nukleär translokation av p65 med 33 procent (celler som gavs rhMG53) till 50 procent (transducerade celler som gavs DOX) i celler som överuttrycker MG53 (Figur 5c och d).

Adoptiv överföring av konstruerade RAW-celler till UUOmouse-modellen utfördes med 1 - 106-celler administrerade genom svansvensinjektion omedelbart efter UUO-kirurgi. Möss delades slumpmässigt in i en grupp som fick normalt dricksvatten (-DOX) och en grupp som fick DOX (2 mg/ml) i dricksvatten. UUO möss fick RAW varannan dag för totalt 4 injektioner. Njurar skördades 7 dagar efter operationen.

Möss infunderade med konstruerad RAW följt av DOX-induktion visade signifikant reducerad (med 30 procent) njurfifibros jämfört med de som inte fick några celler eller de som infunderades med konstruerade RAW-celler men utan Dox-induktion (66 procent fibrotisk yta; figur 6a och b).

Endast en liten RAW/Ad-tPA-MG53-population överlevde övervakningen av det retikuloendoteliala systemet vid slutet av experimenten. Immunhistokemifärgning bekräftade att DOX-behandling inducerade RAW-medierat MG53-uttryck i njuren (Figur 6c). Intressant nog uppvisade UUO-njurar från RAW-infunderade möss och DOX-inducerad MG53 ett lägre p-65/t-p65-förhållande (med cirka 40 procent) än de som antingen inte fick RAW eller de som fick RAW utan DOX (figur 6d och e). Den reducerade p-p65-nivån bekräftades med p-p65 (S536) immunhistokemifärgning av UUO-njurar (Figur 6f). Vi tror att cirkulerande MG53 levererat av Raw/Ad-tPA-MG53/þDOX och upptag av njurens proximala tubuliceller kan bidra till att minska p-p65 (S536) och minska UUO-njurinflammation. Jämfört med UUO-njurar, ökade uttrycket TGF-b1, PAI- 1 och Col1a1 signifikant i UUO-njurar från möss infunderade med RAW utan DOX (ingen MG53-induktion). Förhöjning av dessa profibrotiska gener kan tillskrivas induktionen av en stark allotransplantatreaktion från infunderade celler till immunkompetenta möss. UUO-njurar från möss som infunderats med RAW och fått DOX (MG53-induktion) uttryckte emellertid signifikant lägre (60 procent –72 procent minskning) PAI-1 och relativt lägre nivåer av TGF-b1 och Col1a1 än möss utan DOX-behandling (Figur 6 g).

Systemisk administrering av rhMG53 mildrar NF-kB-aktivering och fibrosutveckling hos möss som utsätts för UUO

Vi testade om rhMG53 visade en liknande antifibrotisk effekt som den konstruerade RAW-cellterapin som beskrivits tidigare. Våra tidigare farmakokinetiska data indikerade den korta, cirkulerande halveringstiden (ca 90 minuter hos gnagare) för rhMG53.42 Möss tolererade kronisk administrering av 2 till 6 mg/kg

rhMG5326,37 väl, så administrationsstrategin som visas i figur 7a användes. UUO möss gavs slumpmässigt antingen vehikel (saltlösning) eller rhMG53 (2 mg/kg) dagligen under de första 7 dagarna efter operationen och sedan varannan dag tills de avlivades på dag 12. Skum och kontralaterala njurar uppvisade ungefär ekvivalent t-p65 och fibronektinuttrycksnivåer, med p-p65-nivåerna något ökade i kontralaterala njurar jämfört med skennjurar. Efter UUO ökade njurens t-p65. Jämfört med saltlösningsbehandlade djur minskade p-65/t-p65-förhållandet i UUO-njurarna hos rhMG53-behandlade djur med cirka 37 procent, medan IkBa ökade med cirka 27 procent (Figur 7b och c). Dessutom minskade fibronektin med cirka 33 procent (Figur 7b och c). Immunhistokemi bekräftade att rhMG53 var närvarande i UUO-njurar efter behandling (Figur 7d). Total fibros reducerades i rhMG53-behandlade UUO-njurar (Figur 7e). Emellertid var RNA-uttryck av TGF-b1, PAI-1 och Col1a1 liknande i möss som behandlats med antingen saltlösning eller rhMG53 (Figur 7f).

cistanche är effektivt för att behandla njurdysfunktion

DISKUSSION

MG53 är ett muskelberikat TRIM-protein som ursprungligen identifierades som en framträdande komponent i plasmamembranreparationsmaskineri.22,26,42,43. Verkningarna av MG53 är dock inte begränsade till skelettmuskulaturen, och MG53 kan frisättas i cirkulationen som en myokine.32 Vi har tidigare visat att MG53 kan kontrollera inflammation vid vävnadsskada i avlägsna organ.27,29,33,35–37 Den föreliggande undersökningen utvidgar omfattningen av MG53-förmedlat organskydd till njuren. Vi drar slutsatsen att MG53 kan dämpa intrarenal inflammation och njurfibros genom att blockera cytokininducerad aktivering av den proinflammatoriska och profibrotiska transkriptionsfaktorn NF-kB. Denna slutsats är baserad på följande observationer: (i) genetisk deletion av MG53 i normala möss.

resulterade i en nedgång i njurfunktionen när mössen åldrades, vilket åtföljdes av en ökning av njurfibros och infiltration av njuren av leukocyter och makrofager; (ii) i en murin UUO-njurskadamodell uppvisade de blockerade njurarna hos möss med MG53-brist mer fibros och inflammation än MG53-möss; (iii) TNF-a och interleukin-6produktion av LPS-behandlade proximala tubulära epitelceller försvagades i närvaro av MG53; (iv) behandling med eller överuttryck av MG53 i en proximal tubulär epitelcellinje minskade TNFa-inducerad NF-kB-aktivering genom att blockera den nukleära translokationen av p65-komponenten av-kB (MG53 visade sig binda direkt till p65, om än svagt); och (v) fosforylering av p65, ett nödvändigt steg i aktiveringen av NF-kB, minskade i de obstruerade njurarna hos UUO-möss behandlade med rekombinant MG53 inducerad att överuttrycka MG53 i makrofager. Dessutom ökade hämmaren av NF-kB-aktivering, IkBa, i de obstruerade njurarna hos UUO-möss injicerade med rekombinant MG53.

Genetisk deletion av MG53 hos normala möss var tillåtande för de negativa effekterna av åldrande på njurarna. Detta tyder på att närvaron av endogent MG53 ger en baslinjenivå av skydd under åldrande. På samma sätt gjorde förlusten av endogent MG53 AKI på grund av obstruktion värre. UUO-njuren ackumulerade MG53, vilket möjligen återspeglar avlägsen myokinaktivitet från skelettmuskulaturen. Det är fortfarande oklart hur muskel MG53 kan rekryteras till njuren under skada; Men en skadad njure utvecklar ofta hypoxi och utsätts för oxidativ stress,^44,45signaler som skulle kunna tjäna till att rekrytera MG53. Om så är fallet skulle denna "muskel-njure-immuncell"-axel kunna utnyttjas för att dämpa njurskador.46 Alternativt uttrycker njurceller låga nivåer av MG53 vid baslinjen,²⁶och under akut eller kronisk skada kan MG53-produktionen uppregleras.

NF-kB är en framträdande transkriptionell drivkraft för inflammation och fifibros vid njurskador och åldrande.^14,17,47,48Vi uppmanades att undersöka om effekterna av MG53 kunde förmedlas via NF-kB eftersom närvaron av MG53 i det nukleära utrymmet av njurhomogenat antydde potentialen för transkriptionsinterferens. Nukleär lokalisering av MG53 är inte utan prejudikat. I en transgen modell som överuttrycker myokardial MG53, reglerade nukleär MG53 uttrycket av peroxisomproliferatoraktiverad receptor-alfa på transkriptionsnivå och påverkade hjärtlipidmetabolismen.49 Dessutom visade vi nyligen rhMG53 undertryckt NF-kB-aktivering för att lindra åldersrelaterad hjärtsvikt. genom att minska pro-inflammatoriska cytokiner, apoptos och oxidativ stress i åldrade kardiomyocyter.³⁷

Den molekylära mekanismen för hur MG53 modulerar p65 nukleär/cytoplasmatisk mobilisering är fortfarande oklar. MG53 innehåller ingen nukleär lokaliseringssignal, men den innehåller 3 förmodade N-terminala leucinrika kärnexportsignaler, ett motiv som känns igen av nukleärt exportproteinexportin.⁵⁰Den direkta interaktionen mellan MG53 och p65 var ganska svag som den enda eller huvudsakliga störande effekten av MG53 på NF-kB-aktivering. Även om MG53 verkar påverka den dynamiska nukleocytoplasmatiska överföringen av NF-kB-kritiska komponenter, återstår de exakta mekanismerna att bestämmas.

Det kritiska resultatet av MG53-förmedlad renoskydd verkar vara att minska fibrotisk ombyggnad genom attenueringen av NF-kB-medierad inflammation. Njurfifibros är en komplex process som involverar patologisk avsättning av olika ECM-proteiner.51 MG53 verkade ha tydliga effekter på ECM-proteinet fibronektin. Fibronektin ökade i UUO-njurar med brist på MG53 och minskade i UUO-möss behandlade med MG53. Uttrycket av andra ECM-proteiner i närvaro och frånvaro av MG53 är svårare att förstå. Vi har tidigare visat att rhMG53 negativt reglerar TGF-b1/Smad-signalering och undertrycker syntesen av ECM-proteiner i en in vitro-studie.31 In vivo, TGF b1, PAI-1 och Col1a1-transkript ökade inte i UUO-njurar från mg53 / djur med brist. Dessa transkript minskade i UUO-djur som inducerades att överuttrycka MG53 genom administrering av viralt inducerade mus

makrofager, men när rekombinant MG53 gavs sågs ingen effekt. Detta kan helt enkelt vara ett fall av tillräcklig dosering eftersom de intrarenala MG53-nivåerna som uppnåddes var mycket högre hos djur som fick makrofagvektorn i motsats till rekombinant MG53. Dessutom mättes inte proteinnivåer, och post-transkriptionella händelser kunde modifiera ECM i UUO. Ytterligare forskning behövs för att klargöra den framväxande rollen av MG53 vid modulering av specifika ECM-proteiner. Sammanfattningsvis har denna studie visat att en myokin kan hjälpa till att reglera baslinjeinflammation i ett avlägset organ som njuren och, i samband med njurskada, kan hjälpa till att dämpa och kontrollera inflammation. Figur 8 visar en arbetsmodell av MG53:s roll vid renoskydd. Under skadeassocierade molekylära mönster (DAMP, såsom TNF-a) och patogenassocierade molekylära mönster (PAMP, såsom LPS) stimulering och ischemisk stress, aktiveras NF-kB-signalosomen i njuren. MG53 skyddar njuren genom att hämma fosforyleringen och aktiveringen av NF-kB-signalering, stabilisera IkBa och minska p65-kärnmobiliseringen, vilket blockerar aktiveringen av pro-inflammatoriska program. Även om endogen MG53 kan förmedla dessa effekter, föreslår vi att mer robust skydd kan ges med MG53 terapeutiskt, vilket är möjligt baserat på förmågan hos exogen MG53 att minska skadan i UUO. Ytterligare undersökning är motiverad för att förstå hur detta myokin kan utnyttjas kliniskt.

fördel med cistanche: skydda levern och anti-fibros

AVSLÖJANDE

JM har ett aktieinnehav i TRIM-edicine, Inc., som utvecklar rhMG53 för behandling av mänskliga sjukdomar. Patent på användningen av MG53 innehas av Rutgers University och Ohio State University. Alla de andra författarna deklarerade inga konkurrerande intressen.

TACK

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) R01-DK106394 (JM, BHR och P-HL) och NIH R01-AG062896 (P-HL och BHR). Detta projekt stöddes också delvis av en intramural Lockwood-fond från Ohio State University (P-HL) och en utmärkelse från National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS; P-HL, prisnummer UL1TR002733). Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från NCATS eller NIH.

FÖRFATTARBIDRAG HL,

PD, P-HL, JM och BHR utformade och/eller utformade studierna; HL, PD, P-HL, ZL och XZ utförde experimenten, insamlade data och utförde dataanalys; PD, P-HL och BHR tolkade resultaten; och P-HL och BHR utarbetade, reviderade och godkände manuskriptet. Alla författare läste och godkände den slutliga versionen.

EXTRAMATERIAL

Kompletterande fil (PDF) Kompletterande metoder.

Tabell S1.Primersekvenser. Figur S1. mg53-/- möss visar förbättrad ECM-proteinavsättning. Åldersmatchade (10 månader gammal) vildtyp (WT) och mg53-/- njurvävnader färgades med 40 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI; blå, vänster paneler), a- glattmuskelaktin (SMA; grön, andra paneler), fibronektin (röd, tredje paneler) och sammanslagna (höger paneler). Stång ¼ 25 mm. Kvantifiering av njurfibrosarea (n ¼ 3 per grupp). Data presenteras som medelvärde -SD. Elevens t-test. ***P <>

Figur S2.Fördelning av skelettmuskel MG53 mellan kärna och cytoplasma. Skelettmuskulatur härrörande från vildtyp (WT) ormg53-/- möss fraktionerades och immunoblottedes med en skräddarsydd anti-MG53-antikropp (3 mg lysat) och cellkompartmentmarkörer (20 mg lysat). Natrium-kaliumadenosintrifosfataser används som en cellmembranmarkör, histon H3 som en nukleär markör och tubulin som en cytosolmarkör.

Bild S3.HKC-8 njurproximala tubuliceller tar specifikt upp AlexaFluor 647-märkt rhMG53. rhMG53 (Trimedicine) och bovint serumalbumin (BSA; ThermoFisher Scientific) märktes med Alexa Fluor(AF) Antibody Labeling-kit (Life Technologies) enligt tillverkarens protokoll. HKC-8-celler odlades på Delta TPG-glasbottenskål (Bioptechs Inc.) i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med 10 procent fetalt bovint serum (FBS) i närvaro av märkta proteiner, BSA-AF647 (vänster) ) och rhMG53-AF647 (höger), i 24 timmar. Z-stackbilder togs från ett LSM780 konfokalmikroskop (Zeiss). Bilder visar celler längst ner på faten. Stång ¼ 25 mm.

Bild S4.Konstruera RAW-celler för att förmedla inducerbar MG53-sekretion. (A) RAW-celler infekterades med Ad-tPA-MG53 i 24 timmar och behandlades utan (doxycyklin [Dox]) eller med Dox (þDox, 1 mg/ml) i ytterligare 24 timmar för att inducera tPA-MG53-uttryck. Konfokala bilder visade induktionen av MG53-uttryck (skräddarsydd anti-MG53-antikropp, röda, nedre paneler) från makrofagliknande RAW-celler (F4/80-färgning, gröna, övre paneler). Stavar ¼ 25 mm. (B, C) Western blot-analys av cellysat (i mängden 0.6, 3 och 6 mg) för inducerat uttryck av tPA-MG53 och MG53 från infekterade RAW-celler (B) och motsvarande kultur mediakoncentrat (i volymer av 2, 5 och 10ml) (C). Olika kvantiteter av rhMG53 (i mängden 0.2, 1, 0.05 och 0.025 ng) laddades som standarder. Mw, molekylviktsmarkörer.