Nuvarande status för neuroskydd vid medfödd hjärtsjukdom del 3

3.2. Semi-kvantitativ utvärdering av ektopiskt mitokondrie-DNA

Bilder av Hsp60-färgning (mitokondriell matris) och histon-H2B-färgning (den nukleära markören) subtraherades från bilder av dsDNA-färgning. Sedan, med hjälp av funktionen "AdjustThreshold" i programvaran lmage] (National Institutes of Health), binariserades bilder.

Mitokondrier är energifabrikerna i celler, ansvariga för att syntetisera ATP för att tillhandahålla den energi som cellerna behöver. Den mitokondriella matrisen är den inre vätskan i mitokondrierna, som innehåller en mängd olika enzymer och joner och är en nyckelplats för olika biokemiska reaktioner av mitokondrier. Minnet är en av de viktigaste kognitiva förmågorna hos människor. Även om de två kan verka orelaterade, är de nära släkt.

Forskning visar en interaktion mellan mitokondriella matrisen och minnet. Enzymer och joner i mitokondriella matrisen kan direkt påverka nervcellers excitabilitet genom att reglera energimetabolism och jonkanalstatus i neuronala celler, vilket påverkar minnet. Dessutom finns det en mängd olika signalmolekyler i mitokondriella matrisen, som kan överföras till neuroner nedströms genom neuronernas axoner och synapser, vilket påverkar neuronernas signalöverföringseffektivitet, vilket påverkar bildandet och konsolideringen av minnet.

Samtidigt påverkar minnesaktiviteten också direkt tillståndet i den mitokondriella matrisen. Minnesaktiviteter kommer att öka energiförbrukningen av neuroner och främja redoxreaktionen i mitokondriella matrisen, vilket påverkar den metaboliska nivån av mitokondrier och intracellulär jonbalans, vilket ytterligare påverkar nervcellers excitabilitet och signaltransduktionseffektivitet.

Att upprätthålla god mitokondriell hälsa är därför avgörande för att upprätthålla en god minnesfunktion. Genom att upprätthålla goda levnadsvanor, såsom regelbunden kost, måttlig motion, tillräcklig sömn, etc., kan du hjälpa till att upprätthålla hälsan hos mitokondriematrisen. Dessutom kan minnesfunktionen också förbättras genom lämplig farmaceutisk intervention för att främja biokemiska reaktioner och signalering i mitokondriella matrisen.

I det dagliga livet kan vi träna minnet på många sätt, som att läsa, studera, tänka, spel etc. Samtidigt bör vi också vara uppmärksamma på att upprätthålla en god hälsa för att bättre upprätthålla hälsan i mitokondriematrisen. Jag tror att vi genom dessa ansträngningar säkerligen kommer att få bättre minne och bättre klara olika utmaningar i livet och arbetet. Det kan ses att vi behöver förbättra minnet, och Cistanche deserticola kan förbättra minnet avsevärt, eftersom Cistanche deserticola också kan reglera balansen av signalsubstanser, som att öka nivåerna av acetylkolin och tillväxtfaktorer. Dessa ämnen är mycket viktiga för minne och inlärning. Dessutom kan Cistanche deserticola också förbättra blodflödet och främja syretillförseln, vilket kan säkerställa att hjärnan får tillräckligt med näringsämnen och energi, och därigenom förbättra hjärnans vitalitet och uthållighet.

Klicka på vet kosttillskott för att öka minnet

Vi valde dsDNA-punktor som sträcker sig i storlek från 2 till 20 um' (cirkuläritet 0.1-1.0) med funktionen "Analysera-analysera partiklar". vid behov undersöktes originalbilderna för den slutliga räkningen. Om signalen från histon H2B var liten. sedan visade de subtraherade bilderna munkliknande strukturer.

Dessa representerar cytosoliskt dsDNA av nukleärt ursprung och bör elimineras från mängden cytosoliskt dsDNA av mitokondriellt ursprung. Storleksintervallet kan modifieras i enlighet med celltypen eller ursprunget för histologiska prover. Figur lE visar ett exempel på räkning av ektopiskt mitokondrie-DNA

prickar med 1B D.

Alternativt subtraherades bilder av Hsp60-färgning från bilder av dsDNA-färgning. Sedan räknades antalet dsDNA puncta med hjälp av funktionerna "Adjust-Threshold "Analyze-Analyze Particles". Därefter räknades dsDNA puncta utan histon-H2B-signalen genom direkt observation. Den senare metoden är lämplig när histon-H2B-bilderna visar ett lågt signal-brusförhållande.

Sammantaget kan denna metod tydligt visa ektopiskt mitokondriellt DNA som läcker in i cytoplasman och möjliggör en objektiv och statistisk utvärdering av sådant ektopiskt mitokondriellt DNA i celler.

4. Diskussion

I vår studie utvecklade vi en metod som möjliggör räkning av cytoplasmatisk mitokondrie-DNA. Detektion av cytoplasmatisk mitokondrie-DNA har rapporterats genom att använda immunfluorescenstekniker, men metoderna var inte kvantitativa för utvärdering av cytoplasmatisk mitokondriell DNA i de flesta fall [15,25]. I en annan studie utfördes dropp-PCR för att kvantifiera cirkulerande mitokondrie-DNA [9].

nyligen har Sato et al. [26,27] publicerade ett utmärkt protokoll för att utvärdera cytoplasmatiskt DNA genom immunfluorescensmikroskopi med användning av Lamin B1 (LMNB1) antikroppar som en nukleär strukturmarkör och cytokrom c oxidas subenhet 4 (COX4) som en mitokondriell strukturmarkör. Detta protokoll verkar mycket användbart för att kvantifiera cytoplasmatiskt dsDNA av nukleärt ursprung.

Men när vi provade COX4 eller andra mitokondriella membranmarkörer, inklusive både inre och yttre markörer, var det mycket svårt att exakt särskilja cytoplasman från mitokondrierna.

Till exempel, om vi observerade cirkulära signaler med hjälp av en mitokondriell membranmarkör och observerade dsDNA-signaler inom, då skulle detta dsDNA kunna representera antingen mitokondriellt DNA inuti de cirkulära mitokondrierna (normalt) eller cytoplasmatiskt mitokondriellt DNA utanför munkliknande mitokondrierna (ektopiskt). Vi använde alltså Hsp60 som en markör som märkte den mitokondriska matrisen för att utvärdera det ektopiska mitokondriella DNA:t i cytoplasman.

Som beskrivits i en nyligen genomförd recension [23] finns det många olika typer av cytoplasmicdsDNA av nukleärt ursprung, och de flesta av dem är positiva för histonmarkörer. På grund av begränsningen av kombinationen av antikroppar som används för trippelfärgning, använde vi histon H2Bas en histonmarkör.

Men om denna begränsning löses kan H2AX vara en bättre markör för cytoplasmatiskt dsDNA av nukleärt ursprung. Histon-H2B-negativt cytoplasmatiskt dsDNA observerades sällan i kontroll-HeLa-cellerna som användes i denna studie, men sådant dsDNA av nuklearursprung kan vara närvarande om andra cellinjer eller tillstånd används.

In situ hybridisering av mitokondriellt DNA som används i vår senaste artikel är lämplig för kvalitativ utvärdering, men det kan vara svårt att använda in situ hybridisering för kvantitativ utvärdering [8].

In situ hybridisering utsätter provet för höga temperaturer, vilket kan resultera i deformation eller brus i vissa delar av provet. Å andra sidan kan den immunocytokemiska metoden som presenteras i denna artikel erhålla signaler med lågt bakgrundsljud. I vår senaste artikel, i mänskliga celler och zebrafiskar som används som modeller för Parkinsons sjukdom, visade vi att mitokondriellt DNA läckte ut i cytoplasman, vilket är giftigt för celler. Vi observerade också att mängden cytosoliskt mitokondrie-DNA ökade i hjärnvävnaden efter döden hos patienter med Parkinsons sjukdom [8].

Dessa bevis tyder på att en ökad mängd ektopiskt mitokondrie-DNA som läcker ut från mitokondrierna kan inducera akut och kronisk inflammation som resulterar i olika sjukdomar, inklusive Parkinsons sjukdom och hjärtsvikt; sålunda kan uppreglering av cytosolisk-DNA-nedbrytning eller hämning av dess sensorer vara ett potentiellt terapeutiskt mål för dessa sjukdomar [8,28].

Metoden som introduceras i detta dokument för kvantitativ utvärdering av ektopiskt mitokondrie-DNA fungerar som ett viktigt verktyg för vidare forskning inom detta område.

Författarbidrag: HM och MTH formulerade hypoteserna, designade majoriteten av experimenten, utförde experimenten, analyserade data och skrev manuskriptet. NM utförde experimenten relaterade till odlade celler. Alla författare har läst och samtyckt till den publicerade versionen av manuskriptet.

Finansiering: Detta arbete stöddes av anslag från AMED (anslagsnummer JP21gm6110028 ochJP19dm0107154 (HM)), Takeda Science Foundation (HM), JSPS KAKENHI (bidragsnummer JP14516799 (HM), JP 16690735 (7HM) och J5690735 (2HM) ), JST (Moonshot R&D; bidragsnummerJPMJMS2024 (HM)) och Grants-in-Aid från TBRF (anslagsnummer TBRF-RF 21-135 (HM)).

Datatillgänglighet: De data och verktyg som beskrivs i detta manuskript är tillgängliga på begäran.

Tack: Vi tackar Shinano Kobayashi för att ha deltagit i användbara diskussioner och tillhandahållit kontinuerligt stöd. Vi erkänner Tokyo Biochemical Research Foundation (TBRF) för att ha tillhandahållit ett TBRF-postdoktoralt stipendium för utländska forskare till MH (TBRF-RF 21-135).

Intressekonflikter: Författarna förklarar ingen intressekonflikt.

Referenser

1. Li, XD; Wu, J.; Gao, D.; Wang, H.; Sun, L.; Chen, ZJ centrala roller för cGAS-cGAMP-signalering i antiviralt försvar och immunadjuvanseffekter. Science 2013, 341, 1390–1394. [CrossRef] [PubMed]

2. Ansari, MA; Dutta, S.; Veettil, MV; Dutta, D.; Iqbal, J.; Kumar, B.; Roy, A.; Chikoti, L.; Singh, VV; Chandran, B. Herpesvirusgenomigenkänning inducerad acetylering av nukleär IFI16 är väsentlig för dess cytoplasmatiska translokation, inflammasom- och IFN-svar. PLoS Pathog. 2015, 11, e1005019. [CrossRef] [PubMed]

3. Orzalli, MH; Broekema, NM; Diner, BA; Hancks, DC; Elde, NC; Cristea, IM; Knipe, DM cGAS-medierad stabilisering av IFI16 främjar medfödd signalering under herpes simplex-virusinfektion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2015, 112, E1773–E1781.[CrossRef] [PubMed]

4. Woodward, JJ; Iavarone, AT; Portnoy, DA c-di-AMP som utsöndras av intracellulär Listeria monocytogenes aktiverar ett Iinterferonsvar av värdtyp. Vetenskap 2010, 328, 1703–1705. [CrossRef] [PubMed]

5. Dou, Z.; Ghosh, K.; Vizioli, MG; Zhu, J.; Sen, P.; Wangensteen, KJ; Simithy, J.; Lan, Y.; Lin, Y.; Zhou, Z.; et al. Cytoplasmickromatin utlöser inflammation vid senescens och cancer. Naturen 2017, 550, 402–406. [CrossRef]

6. Takahashi, A.; Loo, T.; Okada, R.; Kamachi, F.; Watanabe, Y.; Wakita, M.; Watanabe, S.; Kawamoto, S.; Miyata, K.; Barberare, GN; et al. Nedreglering av cytoplasmatiska DNaser är inblandad i cytoplasmatisk DNA-ackumulering och SASP i åldrande celler. Nat.Commun. 2018, 9, 1249. [CrossRef]

7. McArthur, K.; Whitehead, LW; Huddleston, JM; Li, L.; Padman, BS; Oorschot, V.; Geoghegan, ND; Chappaz, S.; Davidson, S.; Chin, HS; et al. BAK/BAX makroporer underlättar mitokondriebråck och mtDNA-utflöde under apoptos. Science 2018,359, eaao6047. [CrossRef]

8. Matsui, H.; Ito, J.; Matsui, N.; Uechi, T.; Onodera, O.; Kakita, A. Cytosoliskt dsDNA av mitokondriellt ursprung inducerar cytotoxicitet och neurodegeneration i cellulära och zebrafiskmodeller av Parkinsons sjukdom. Nat. Commun. 2021, 12, 3101. [CrossRef]

9. Sliter, DA; Martinez, J.; Hao, L.; Chen, X.; Sun, N.; Tara, D.; Fischer, TD; Burman, JL; Li, Y.; Zhang, Z.; et al. Parkin och PINK1 mildrar STING-inducerad inflammation. Naturen 2018, 561, 258–262. [CrossRef]

10. Hou, Y.; Wei, Y.; Lautrup, S.; Yang, B.; Wang, Y.; Cordonnier, S.; Mattson, MP; Croteau, DL; Bohr, VA NAD(+)-tillskott reducerar neuroinflammation och cellåldring i en transgen musmodell av Alzheimers sjukdom via cGAS-STING. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 2021, 118, e2011226118.

For more information:1950477648nn@gmail.com