Den globala prevalensen av kronisk njursjukdom (CKD) ökar med befolkningens åldrande
Sep 20, 2022
Kontakta oscar.xiao@wecistanche.com för mer information
Bakgrund:Fibros är ett av de vanligaste patologiska dragen i njurarnas åldrandeprocess, och fibros i åldrande njurar förvärrar också processen med kronisk njursjukdom (CKD). Corallodiscus flabellata BLBurtt (C.flabellata, CF) är ett vanligt använt botaniskt läkemedel i kinesisk folklore. Men få studier har rapporterat dess farmakologiska effekter. Denna studie syftade till att utforska effekten av CF-etanolextrakt på njurfibros i SAMP8-möss och identifiera potentiellt aktiva föreningar.
Metoder:Åldringsaccelererad musbenägen 8 (SAMP8) användes som djurmodeller och olika doser av CF gavs genom sondmatning under en månad. Att observera graden av njuråldring hos möss med användning av -galaktosidasfärgning. Masson-färgning och expressionsnivåerna av Col-lI, a-SMA och FN användes för att utvärdera njurfibros hos möss. Proteinuttrycksnivåerna för Nrf2-vägen och Wnt/-catenin/RAS-vägen i njuren mättes. Och -galaktosidas ( -gal) inducerade NRK-52E-celler som en in vitro-modell för att screena de aktiva komponenterna i CF.
Resultat:CF-etanolextraktet hämmade signifikant aktiviteten av njurgalaktosidas och expressionsnivåerna för Coll-, a-SMA- och FNin SAMP8-möss och förbättrade Masson-färgning i SAMP8-möss. CF minskade anmärkningsvärt urinprotein, kreatinin, ureakväve och serumnivåer av TNF-a och IL-1 i SAMP8-möss och ökade signifikant nivåerna av SOD och GSH-Px. Dessutom aktiverade CF Nrf2-vägen och blockerade Wnt/-catenin/RAS-vägen i njurarna hos möss. Dessutom 3,4-dihydroxifenyletanol (SDC-0-14,16) och (3,4-dihydroxifenyletanol-8-O-[4-O-trans -kaffeoyl- -D-apiofuranosy-(1→3)- -D-glukopyranosyl (1→6)]- -D-glukopyranosid (SDC-1-8) isolerades från CF , vilket minskade åldrandet av NRK-52E-celler, och kanske de aktiva ingredienserna i CF som spelar anti-aging-rollen.
Slutsatser:Våra experiment belyste att CF-etanolextrakt kan förbättra njurfibros i SAMP8-möss via Wnt/-catenin/RAS-vägen. Och SDC-0-14,16 och SDC-1-8 kan vara den materiella grunden för CF att utöva anti-njurålderdomsrelaterade effekter.
Nyckelord:Åldrande, Corallodiscus flabellata, njure, njurfibros, SAMP8, åldrande, Wnt/ -catenin/RAS
Introduktion
Den globala prevalensen av kronisk njursjukdom (CKD) ökar med befolkningens åldrande och utgör en betydande börda för samhället [1-3]. Den vanligaste patologiska manifestationen av CKD är någon form av njurfibros[4]. Likaså är njurfibros också ett av tecknen på njuråldring [2]. Studier har visat att oxidativ stress, inflammation, Wnt/-catenin, renin-angiotensin-aldosteron-systemet (RAS) och rapamycin(mTOR)-signalering alla är relaterade till CKD inducerad av senescens [5]. Njurfibros i åldrande njurar är nära relaterat till aktiveringen av Wnt/-catenin och RAS-signalvägen [6]. Vid aktivering av Wnts, translokeras -catenin i cytoplasman till kärnan, där det binder till lymfoiden förstärkarbindande faktor (LEF)/T-cellfaktor (TCF) transkriptionsfaktorfamiljen och initierar transkriptionen av nedströms målgener. Intressant nog innehåller promotorregionen av RAS-genen även LEF/TCF-bindningsställen, vilket gör det möjligt för -catenin att främja bindningen av LEF-1 till dessa platser[7].cistanche kolesterol,Därför kan inriktning på Wnt/-catenin/RAS-signalvägen vara en potentiell terapeutisk strategi för njurfibros [8,9]. Under de senaste åren har ersättningsterapi av njurfibros med naturliga produkter uppmärksammats av många forskare [10] . Xiaoyan Shen et al. fann att ginsenoside Rgl förbättrade glomerulär fibros under njuråldring genom att hämma aktiveringen av NLRP3-inflammasom hos SAMP8-möss [11]. Denna studie undersökte effekten av C. flabellate(CF)extrakt på njurfibros i SAMP8-möss från Wnt/-catenin/RAS-vägen.
Cistanche kan anti-aging
CF som medicinalväxt i Kina registrerades först i "Dian Nan Ben Cao. Hela växten används vanligtvis för behandling av dysenteri, för tidig utlösning, sädesblåsor och njursjukdom i etniska minoritetsområden i Kina [12]. För närvarande , finns det få rapporter om CF i modern forskning. De farmakologiska studierna i vårt laboratorium fann att CF-extrakt hade diuretiska effekter och förbättrade lipopolysackarid/D-galaktosamin-inducerad leversvikt och hjärnskador hos råttor [13, 14]. Och fytokemiska studier på den avslöjade att fenyletanoidglykosider och flavonoider var de huvudsakliga kemiska komponenterna i CF [15,16] Syftet med denna studie var att undersöka effekten av CF-extrakt på njurfibros hos SAMP8-möss och att belysa dess möjliga mekanism, för att tillhandahålla experimentella bevis för behandling av njursjukdom med CF som beskrivs i gamla böcker.
Material och metoder
Insamling och utvinning av växtmaterialet
"Yunnan Chinese Herbal Medicine" visar att CF kan skördas under hela året. CF-växterna som användes i detta experiment skördades i Xixia County, Henan-provinsen, Kina i september. Det identifierades av professor Suiqing Chen från Henan University of Chinese Medicine, och proverna förvarades i laboratorieprovbiblioteket.cistanche deserticola biverkningarPlantorna (1 kg) återloppskokades med 50 procent etanol (3 x 12 L, varje 1 timme), och blandningen filtrerades med 16 lager gasväv. De kombinerade filtraten torkades genom rotationsindunstning med användning av en frystork. Slutligen var det procentuella utbytet av 50 procent etanolråextrakt av CF 15,5 procent. Det torkade extraktet förvarades i kylskåp tills vidare användning. Tilläggsmaterialet listar relevanta data om ingrediensbeteckningen för CF-extrakt.
En annan separationsprocess som tidigare rapporterats användes i denna studie för att erhålla vattenelueringsfraktionen, 20 procent etanolelueringsfraktion, 30 procent etanolelueringsfraktion och 40 procent etanolelueringsfraktion från CF [13]. Den 40 procentiga etanolfraktionen separerades med hjälp av Sephadex LH-20 och silikagelkolonn och renades genom semi-preparativ högpresterande vätskekromatografi (HPLC) för att slutligen erhålla föreningar som SDC-0-14,16, SDC{ {10}}, SDC-0-60(p-hydroxibensylalkohol).
Djur och administration
Sex månader gamla manliga SAMP8 och senescensaccelererade musresistenta 1(SAMR1)-möss från First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine (Tianjin, Kina) användes i denna studie. Djuren hölls under kontrollerade ljusförhållanden (12-h ljus/mörkercykel), temperatur (23-25 grad C) och luftfuktighet (45-55 procent) och fick en standarddiet- och vattenannons libitum. Totalt 48 SAMP8-möss delades in i fyra experimentgrupper (n=12/grupp): SAMP8-modellmöss (M), lågdos CF-etanolextraktbehandlade SAMP8-möss (CF-L, 387,5 mg/kg, intragastriskt), medeldoserade CF-etanolextraktbehandlade SAMP8-möss (CF-M, 775 mg/kg, intragastriskt) och högdos CF-etanolextraktbehandlade SAMP8-möss (CF-H, 1550 mg/ kg, intragastriskt). Mössen i SAMRI-kontrollen (Con, n=10) och SAMP8-modellgrupperna (M) behandlades med fysiologisk koksaltlösning (0,9 procent). Alla möss behandlades oralt under 1 månad. Alla djurförsök godkändes av den etiska kommittén vid Henan University of Chinese Medicine och utfördes enligt institutionella riktlinjer (Henan, Kinas godkännandenummer: HACTCM-2018009060-19). Under experimentet inträffade en musdöd i var och en av Con- och M-grupperna, och två möss dog i CF-H-gruppen.
Provsamling
I slutet av experimentet hölls mössen individuellt i metaboliska burar för 12-h urinsamlingar. Mössen bedövades sedan med isofluran och blodprover togs genom retro-orbital blödning. Njurarna från varje mus avlägsnades sedan kirurgiskt och hölls vid 80 grader fram till analyserna.
Cellodling och in vitro-studie
NRK-52E-celler köpta från Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina) odlades för att undersöka effekten av CF-extrakt på cellåldring orsakad av D-galaktos (D-gal, S11050, Yuanye, Shanghai, Kina). NRK-52E-cellerna odlades i Dulbeccos modifiering av Eagles medium Dulbecco (DMEM, 12 100 046, Thermo Fisher, Massachusetts, USA) försedd med 10 procent fetalt bovint serum i en inkubator vid 37 grader C och i närvaro av 5 procent , CO.Cells odlades i 96-brunnsplattor eller 6-brunnsplattor till 80-85 procent konfluens och behandlades sedan med tillväxtmedium som innehöll olika läkemedelskombinationer: Media plus D-gal ( 20 mg/mL）, Media plus D-gal plus CF (10, 25,50, 100 ug/mL) respektive Media plus D-gal plus monomer förening (10 μM) under 48 timmar. Därefter, metyltiazolyltetrazolium( MTT)-analys användes för att detektera cellviabilitet, och -galaktosidasfärgning användes för att observera cellåldring.
Åldringsassocierad -galaktosidasfärgning
Frysta njurar från möss skivade i 10-μm-tjocka sektioner och NRK-52E-celler färgades med åldringsassocierat -galactosidase(SA- -gal, C0602, Beyotime Biotechnology, Shanghai, Kina) enligt tillverkarens protokoll.
Histologisk analys
Njursektionerna fixerades med 4 procent buffrad paraformaldehyd, och 10-μm tjocka paraffininbäddade sektioner färgades med Massons trichrome(G1006, Service, Wuhan, Kina) och observerades mikroskopiskt. De blåfärgade områdena i Massons trikromfärgade sektioner mättes kvantitativt från sex slumpmässigt utvalda fält och analyserades med programvaran Image-Pro Plus 6.0.
Biokemiska mätningar
Serum- och njurhomogenatproverna tinades till rumstemperatur och nivåerna av superoxiddismutas (SOD, CSB-E08556m, Wuhan Huamei, Wuhan, Kina), glutationperoxidas (GSH-Px, A005-1-2, Nanjing Jiancheng, Nanjing, Kina), interleukin-1 (IL-1, RK00006, ABclonal, Wuhan, Kina), tumörnekrosfaktor- (TNF-, RK00027, ABclonal, Wuhan, Kina), ureakväve (C{ {10}}, Nanjing Jiancheng, Nanjing, Kina), kreatinin(Cr, C011-2-1, Nanjing Jiancheng, Nanjing, Kina) i musserum, totalt urinprotein (C035-2-1, Nanjing Jiancheng, Nanjing , Kina) i musurin och uttrycksnivåerna av kollagen typ I (Col-I, MU30364, Bio-Swamp, Wuhan, Kina), -slätmuskelaktin (-SMA, MU30359, Bio-Swamp, Wuhan, Kina), fibronektin (FN, MU30179, Bio-Swamp, Wuhan, Kina) i mus njurvävnader mättes sekventiellt enligt protokollet från analyskittillverkaren.
Immunhistokemisk analys
Den immunhistokemiska analysen utfördes med hjälp av rutinmetoden [17]. De använda antikropparna inkluderade följande: Wnt4 (14371-1-AP, Proteintech, Chicago, USA), -catenin(17565-1-AP,Proteintech, Chicago, USA), typ 1 angiotensin II-receptorer (AGTR1,{{ 7}}AP, Proteintech, Chicago, USA), p-nukleär faktor erytroid 2-relaterad faktor 2 (p-Nrf2, ab76026, Abcam, Cambridge, Storbritannien), pc-Fos(ab27793,Abcam, Cambridge, Storbritannien ), bindvävstillväxtfaktor (CTGF, GB11078, Service, Wuhan, Kina). Sektionerna observerades under ett mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan).cistanche dosering redditMät arean och den integrerade optiska densiteten (IOD) för området med tan-uttryck med hjälp av programvaran Image-Pro Plus 6.0 och beräkna den genomsnittliga optiska densiteten (MOD, MOD=IOD/area) för semi -kvantitativ analys.
Western blot-analys
Western blot-analys utfördes som beskrivits i en tidigare studie [18]. Kortfattat homogeniserades njurvävnaderna i lysbuffert och kvantifierades med användning av ett Bradford Protein Assay Kit (AR0197, Boster Biological Technology, Wuhan, Kina). Homogenaten utsattes sedan för natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores, överfördes till polyvinylidenfluoridmembran och blockerades i blockeringsbuffert (4 procent fettfri torrmjölk) under 90 minuter. De inkuberades sedan med primära antikroppar (Wnt4; renin; AGTR1; p-Nrf2; pc-Fos; Kelch-liknande ECH-associerat protein 1 (Keapl, GB11847, Service-bio, Wuhan, Kina); -aktin (AC026, Abclonal, Wuhan, Kina); och glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH, AC033, Abclonal, Wuhan, Kina)) över natten vid 4 grader följt av inkubation med en lämplig fluo-närvaro-konjugerad sekundär antikropp i 1 timme vid rumstemperatur . Proteinerna av intresse skannades med en Odyssey IR-skanner (LI-COR Biosciences, Nebraska, USA), och signalintensiteterna kvantifierades med hjälp av programvaran Image Studio. Proteinnivåerna normaliserades mot -aktin eller GAPDH.
UPLC-Q-TOF-MS-analys för njurprover
Njurvävnaderna vägdes och homogeniserades i iskall fysiologisk koksaltlösning (vikt/volym=1:1). Sedan sattes 1 mL acetonitril till 200 μL vävnadshomogenatprov, följt av ultraljudsextraktion i 30 minuter. Extraktet centrifugerades vid 12,000 g och 4 grader under 10 min. Supernatanten togs in i flaskan för analys. Kromatografisk separation utfördes på ultraperformance vätskekromatografi (UPLC) (Dionex UltiMate 3000 System, Thermo Scientific, Massachusetts, USA), med LC-systemet innefattande en Acclaim RSLC 120 C18 kolonn (2,2 μm, 2,1×100 mm; Thermo Scientific).cistanche extrakt fördelarDen mobila fasen bestod av lösningsmedel A(acetonitril) och vatten med {{0}},1 procent myrsyra (B). Separationen utfördes genom gradienteluering enligt följande: 10-70 procent A från 0 till 3 min, 70-78 procent A från 4 till 13 min, 78-90 procent A från 14 till 15 min, 90 procent -10 procent A från 15 till 16 min, och 10 procent A från 16 till 20 min. Injektionsvolymen för testprovet var 2μL. Masspektrometri (MS)-analysen utfördes genom att använda en ESI-källa under följande förhållanden: kapillärspänningen i det positiva läget var 3,5 kV och kapillärspänningen i det negativa läget var 3,2 kV. Nebulisatorns tryck var 2,0 bar, temperaturen på den torra gasen var 230 grader och flödeshastigheten var 8 l/min.
Statistisk analys
The acquired raw data from ultra-performance liquid chromatography coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q/TOF-MS) analysis were first preprocessed using profile analysis(version 2.1, Bruker, Germany). The"bucket table" was obtained and imported into the SIMCA-P software(version13.0 Umetrics AB, Sweden)for principal component analysis (PCA). Other results were presented as mean±stand-ard deviation(SD). The data were processed using IBM SPSS Statistics 26.0. The normal distribution of the data used the Levene test, which required the average value, P>{{0}}.05; envägsvariansanalysen användes för jämförelse mellan grupper. AP-värde mindre än 0,05 ansågs vara statistiskt signifikant.
Resultat
CF förbättrade åldrandet och fibrosen i njurarna hos SAMP8-möss
För att undersöka effekten av CF på njurarna hos SAMP8-möss, mättes SA- -gal-aktivitet i njurarna. I Fig. la ökade SA- -galaktiviteten i njurvävnader avsevärt i M-gruppen (blå förstärkning). Administrering av CF-L och CF-M hämmade signifikant -galaktosidasaktivitet i njurarna hos SAMP8-möss medan förbättringen av CF-H inte var signifikant. Dessutom var njurindexet för modellgruppen signifikant lägre än det för kontrollgruppen (Fig. 1b, P<0.05). after="" treatment="" with="" cf-m,="" the="" kidney="" index="" of="" samp8="" mice="" was=""><0.01). next,="" the="" results="" of="" masson's="" trichrome="" staining="" (fig.="" lc,=""><0.01)and the="" expression="" of="" fibrosis="" indicators="" col-i,="" α-sma,="" and="" fn="" revealed="" that="" m-group="" mice="" had="" more="" severe="" renal="" fibrosis="" than="" con-group="" mice,="" and="" cf-l="" and="" cf-m="" significantly="" attenuated="" renal="" fibrosis="" in="" samp8="" mice(fig.leg,=""><>
CF förbättrade njurfunktionen, oxidativ stress och inflammationsnivåer hos SAMP8-möss
Dessutom testades njurfunktionsindikatorerna för varje grupp av möss, vilket inkluderade urinvolym hos möss under 12 timmar, Cr- och ureakvävenivåer i serumet och urinproteinnivåer. Som visas i Fig. 2a-d var urinproteinet, serum Cr och serum urea kvävenivåer i modellgruppen signifikant högre än de i kontrollgruppen (Fig. 2a, P)<0.01), while="" the="" urine="" volume="" of="" the="" model="" group="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" of="" the="" control="" group(fig.2b-d,=""><0.01). cf="" supplementation="" down-regulated="" the="" levels="" of="" urine="" protein,="" serum="" cr="" and="" urea="" nitrogen="" in="" the="" model="" group(fig.2b-d,=""><0.05 or=""><0.01) while="" increasing="" the="" urine="" output="" of="" model="" mice.="" collectively,="" the="" results="" indicated="" that="" samp8="" mice="" had="" kidney="" damage="" associated="" with="" aging,="" and="" treatment="" with="" cf="" effectively="" ameliorated="" this="" injury.="">cistanche genghis khanDärefter undersöktes huruvida CF fördelaktigt modulerade oxidativ stress och inflammation i njurarna hos snabbt åldrande möss. Som visas i Fig.2e-h var nivåerna av SOD och GSH-Pxin i njurarna i M-gruppen signifikant lägre än de i Con-gruppen, och nivåerna av IL-1 var signifikant högre än Con-gruppen. Efter CF-behandling har ovanstående indikatorer förbättrats, speciellt förbättringseffekten av CF-L och CF-M är bättre.
CF aktiverade Nrf2-vägen i njurarna hos SAMP8-möss
Expressionsnivån av p-Nrf2 mättes i njurvävnader för att undersöka om Nrf2-vägen var involverad i den skyddande effekten av CF (Fig. 3a-c) i denna studie. Expressionsnivån för p-Nrf2 minskade signifikant i SAMP8-gruppen enbart (P<0.01, fig.="" 3c),="" and="" the="" downregulation="" was="" reversed="" to="" some="" extent="" by="" the="" treatment="" of="" cf="" crude="" extract.="" there="" was="" no="" significant="" change="" in="" the="" expression="" level="" of="" keapl="" among="" the="" groups(fig.="" 3b="" and="" d).="" further,="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" was="" detected="" and="" analyzed="" by="" immunohistochemical="" and="" western="" blot="" analyses.="" it="" was="" found="" that="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" mice="" in="" the="" m="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" con="" group;="" while="" cf="" treatment="" significantly="" reduced="" the="" expression="" levels="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" the="" mice="" (fig.3a-b="" and="">
CF-attenuerad Wnt/-catenin/RAS-signalaktivering i njuren hos SAMP8-möss
För att ytterligare utforska den potentiella mekanismen för CF som utövar anti-fibroseffekten. Lokaliseringen av protein utfördes med användning av immunhistokemi. Som visas i fig. 4a, uttrycksnivån för Wnt4 och
-catenin inducerades huvudsakligen i njurtubulära celler. Liknande resultat observerades när AGTR1, nedströms vägmål för Wnt-signalering, bedömdes (Fig. 4a). Därefter kvantifierades proteinuttrycksnivån och resultaten visade att Wnt4-, -catenin-, renin- och AGTR1-proteiner ackumulerades i njurvävnaden hos möss i modellgruppen, medan CF signifikant hämmade dessa förändringar (fig. 4b-f) ). Dessutom lokaliserades och analyserades också uttrycksnivån av CTGF och kvantitativt. I överensstämmelse med ovannämnda resultat uttrycktes CTGF huvudsakligen i njurtubuli, och CF inhiberade markant aktiviteten av CTGF (fig. 4d g).
CF och dess föreningar hämmade senescensen av NRK-52E-celler inducerade av D-gal
D-gal-inducerade NRK-52E-celler användes för att screena vissa aktiva ingredienser i CF, för att bestämma den materiella grunden för behandling av senila njurar med extraktet av CF. Resultaten visade att CF förbättrade cellviabiliteten på ett dosberoende sätt och föreningarna
SDC-0-14,16 och SDC-1-8 isolerade från CF hade bättre effekter på cellproliferation. Dessutom uppvisade 25 ug/ml CF och föreningarna SDC-0-14,16 och SDC-1-8 alla effekten av att hämma -galaktosidasaktivitet (Fig. 5).
CF förbättrad PCA-analys av njurvävnad i SAMP8-möss Huvudkomponentanalys (PCA) utfördes för att utforska effekterna av CF på SAMP8-möss. Som visas i Fig. 6a fanns det en uppenbar gruppering mellan kontroll- och modellgrupperna (R2X=0.542; Q2=0.38), vilket tyder på att de endogena metaboliterna av SAMP8-möss skilde sig från SAMR1 möss, vilket gör att de avviker från SAMR1-gruppen. Som visas i Fig. 6b, grupperade de olika CF-grupperna också i olika klasser från kontroll- och modellgrupperna, och CF-grupperna flyttade sig närmare kontrollgruppen, vilket indikerar att
endogena metaboliter från de CF-intervenerade SAMP8-mössen liknade de hos SAMR1-mössen.
Diskussion
Åldrande spelar en viktig roll i utvecklingen av CKD [19]. När CKD-fibros fortskrider uttrycker och utsöndrar åldrande celler profibrotiska faktorer (TGF-, CTGF, och så vidare) och pro-inflammatoriska faktorer (IL-1, IL-6, TNF- och så vidare ), som är senescensassocierade sekretoriska fenotypfaktorer, vilket påskyndar njurfibros [20, 21]. För närvarande har traditionell kinesisk medicin uppnått goda resultat vid behandling av njurfibros med färre biverkningar [22]. Denna studie undersökte de interventionella effekterna av CF-extrakt på njurfibros hos SAMP8-möss. Musstammen som valdes för denna studie var SAMP8, som utvecklades baserat på livslängden, senescensen och patologiska fenotypiska graderingspoängen för AKR/möss och var en accelererad åldringsmodell enbart av genetiskt ursprung [23,24]. Studier har visat att förändringarna i njurpatologin hos SAMP8-möss (9 månader) inkluderar tubulointerstitiell fibros och fokal segmentell glomeruloskleros [25]. Och det visade sig att njurfibros hos SAMP8-möss var åldersrelaterad [6]. Därför testade vi aktiviteten av -galaktosidas och
nivån av njurfibros i SAMP8-möss och fann att CF-L och CF-M förbättrade njurfibros- och -galaktosidasaktivitet i SAMP8-möss (Fig. 1). Och vi testade också urinproduktionen från mössen. I överensstämmelse med tidigare publicerade studier som indikerar att CF erhållen genom två olika processer hade diuretiska effekter [13], ökade extraktet signifikant urinvolymen hos SAMP8-möss. Den aktuella studien visade också att tillskott med CF förbättrade njurfunktionen, aktiviteten hos antioxidantenzymer och nivåer av inflammatoriska faktorer hos SAMP8-möss (Fig.2).
Keap1-Nrf2-systemet har fått uppmärksamhet av många forskare under de senaste åren på grund av dess antioxidant- och antiinflammatoriska egenskaper. Dess farmakologiska potential vid behandling av njursjukdomar hade studerats omfattande i icke-kliniska och kliniska studier [26]. Nrf2 är en master transkriptionell regulator för gener relaterade till redoxstatus och antioxidanteffekter [27]. Studier har visat att fosforylering krävs för Nrf2-aktivering och målgeninduktion [28]. Aktivering av Nrf2 förbättrade CKD-progression genom att förhindra oxidativ stress och upprätthålla cellulär redoxhomeostas [29]. Som en viktig transkriptionsfaktor spelar Nrf2 en avgörande roll i försvaret mot oxidativ stress genom att reglera dess nedströms antioxidanter och avgiftningsenzymer [30]. Kim et al. rapporterade att resveratrol, som en potent Nrf2-aktivator, förbättrade åldringsrelaterad progressiv njurskada [31]. I den aktuella studien förbättrade CF dämpningen av Nrf2 i njurarna hos SAMP8-möss utan att påverka uttrycksnivån av Keapl, vilket tyder på att CF-råextrakt kan förbättra oxidativ skada i njurarna genom att aktivera Nrf2-vägen (Fig. 3).
Njurfibros kännetecknas av överdriven extracellulär matrix (ECM) deposition som leder till bildandet av ärr i njurparenkymet [32]. Transformerande tillväxtfaktor- (TGF-) tros vara en nyckelcytokin vid fibroblastöveraktivering [33, 34]. Naturligtvis är det inte tillräckligt att rikta in sig på TGF-signaleringsvägen för att minska njurfibros. Vissa studier indikerade att CTGF, Wnt/-catenin, renin-angiotensinsystemet, oxidativ stress och så vidare var inblandade i njurfibros [35-37]. Wnt/-catenin är en evolutionärt bevarad signalväg involverad i regleringen av vävnadshomeostas, organutveckling och skadereparation[38]. Cisternas et al. diskuterade den pro-fibrotiska effekten av Wnt-signalering i både skelettmuskulatur och njure [39]. Allt fler bevis har fastställt att Wnt/-catenin-signalvägen spelar en avgörande roll för att reglera utvecklingen och progressionen av njurfibrotiska lesioner efter skada [40-42]. Wnt/-catenin-signalen är relativt tyst i njurarna hos friska vuxna och aktiveras när njurarna utsätts för olika typer av skador [43].
Hos däggdjur har Wnt-familjen minst 19 familjemedlemmar som är kritiska för njurutveckling. Och minst 15 av dessa familjemedlemmar är differentiellt uppreglerade i den åldrande njuren, inklusive Wnt4 [6]. Resultaten av föreliggande studie visade att uttrycksnivån av Wnt4-protein i njurarna hos SAMP8-möss var signifikant högre än hos SAMR1-möss, vilket verifierades av både Western blot och immunhistokemiska analyser (Fig. 4a, d och f). Av en slump uppreglerades också expressionsnivån av -cateninprotein. Både Wnt4 och -catenin uttrycktes också i renala tubulära epitelceller, vilket avslöjades av den immunhistokemiska analysen (fig. 4a och f). Wnt/-catenin framkallade njurfibros genom att inducera flera fibrogena gener såsom RAS-komponenter, matrismetalloproteinas-7 (MMP-7), plasminogenaktivatorhämmare 1 (PAI-1) och snigel [37 ]. Zhou et al. beskrev Wnt/-catenin som den huvudsakliga uppströmsregulatorn, som kontrollerar uttrycket av alla testade RAS-komponenter i njurarna [44]. Zhou et al. använde en 5/6 nefrektomi (5/6 NX) råttmodell för att visa uttrycksnivåerna av huvudkomponenter av RAS i hjärnan och njurarna, såsom angiotensinogen, angiotensin-omvandlande enzym och angiotensin II AT{{25 }}receptorn var signifikant uppreglerad. Den uppreglerade uttrycksnivån hämmades av en central blockerare av Wnt, som var en adenoassocierad virusvektor som överuttrycker DKK1-genen [45]. På liknande sätt fann den föreliggande studien att AGTR1 fortfarande uttrycktes i det renala tubulära epitelet och uttrycksnivåerna av renin och AGTRl i njurvävnaderna hos SAMP8-möss var signifikant högre än de hos SAMR1-möss (fig. 4a och dg). Dessa resultat indikerade att Wnt/-catenin/RAS-signalvägen aktiverades i njurarna hos SAMP8-möss, och CF hämmade effektivt aktiveringen av denna väg.
CTGF utövar flera biologiska funktioner, inklusive att främja mitos av kemotaktiska celler, inducera adhesion och främja cellproliferation och ECM-syntes [35,46]. CCN2(CTGF)modulerad Wnt-signalering genom att binda till lipoproteinreceptorrelaterat protein med låg densitet 5/6 (LRP5/6) för att ytterligare mediera fibros [39, 47]. Andra studier använde gentystnad för att upptäcka och bekräfta att Nrf2 reglerade Wnt-vägen genom att reglera uttrycksnivån av CTGF, vilket påverkar njursjukdomar. Nrf2 reglerade också CTGF-transkriptionsnivån huvudsakligen via CTGF-transkriptionsregulator c-Fos [48]. Den immunhistokemiska analysen avslöjade att CTGF och pc-Fos uttrycktes huvudsakligen i renala tubulära epitelceller, och pc-Fos distribuerades också i glomeruli. Den kvantitativa analysen visade att expressionsnivåerna för båda proteinerna hämmades av CF (fig. 3b och e och 4a och c). Slutligen användes PCA-analysen för att ytterligare verifiera att CF förbättrade njurskador hos SAMP8-möss (Fig. 6). Den aktuella studien gav bevis för att CF inte bara aktiverade Nrf2-signalering utan också förlitade sig på Nrf2 för att balansera oxidativ stress och inflammation, hämmade Wnt/-catenin/RAS-signalering och förbättrad njuråldring och njurfibrogenes. Men vi fann också inkonsekvent förbättring av effekten av CF på Masson och SA- -galfärgning i detta experiment. Det spekuleras i att detta kan bero på den inkonsekventa utvecklingen av njuråldring och njurfibros hos SAMP8-möss. Graden av njuråldring hos mössen i detta experiment kan vara allvarligare än fibros. Därför var den förbättrande effekten av CF-H på njuråldern hos SAMP8-möss inte lika uppenbar som den för njurfibros.
Som en reducerande monosackarid används D-galaktos i stor utsträckning vid olika åldersrelaterade sjukdomar in vivo och in vitro. D-gal visade sig orsaka åldrande och skada i NRK-52E-celler [49], inducera åldrande av mänskliga njure proximala tubulära epitelceller (HKC-8-celler) och öka uttrycksnivåerna i två njurar. fibrosmarkörproteiner FN och a-SMA [6]. I denna studie användes D-gal för att inducera NRK-52E-celler in vitro. Genom att använda MTT-analys och -galaktosidasfärgning för att detektera föreningarna isolerade från CF, fann man att SDC-0-14,16 och SDC-1-8 förbättrade cellviabiliteten inducerad av D-gal och hämmade D-gal-inducerad cellåldring (Fig. 5). Dessa antydde att SDC-0-14,16 och SDC-1-8 kan vara den materiella grunden för CF för att fördröja åldrande av njurarna. SDC-1-8 är en av fenyletanoidglykosiderna. fenyletanoidglykosider visade sig förlänga livslängden för Caenorhabditis Elegans [50], med anti-aging, [51] och neuroprotektiva effekter [52-54]. Dessa ger en riktning för vår uppföljningsstudie om de farmakologiska effekterna av CF.
Slutsatser
Sammanfattningsvis visade in vivo-studier att CF minskade njurfibros hos äldre möss. Vissa potentiella aktiva ingredienser hittades in vitro-experiment. Dessa fynd gav farmakologiskt stöd för behandling av njursjukdom med CF och en riktning för vidare forskning om de aktiva ingredienserna i CF.
Denna artikel är extraherad från Cao et al. BMC Complementary Medicine and Therapies (2022) 22:52
