Den hämmande effekten av curcuminderivat J147 på melanogenes och melanosomtransport genom att underlätta ERK-medierad MITF-nedbrytning del 1

Den terapeutiska användningen av curcumin och kemiskt modifierad curcumin (CMC) för att undertrycka melanogenes och tyrosinasaktivitet har erkänts. J147 är en modifierad version av curcumin med överlägsen biotillgänglighet och stabilitet. Det finns dock ingen rapport om effekterna av J147 på pigmentering in vitro och in vivo. I våra studier undersökte vi de hypopigmentära effekterna av J147-behandling på melanocyter och utforskade den underliggande mekanismen. De nuvarande studierna antydde att J147 undertryckte både basal och -MSH-inducerad melanogenes, såväl som minskad melanocytdendritförlängning och melanosomtransport. J147 spelade dessa roller huvudsakligen genom att aktivera den extracellulära signalreglerade proteinkinasvägen (ERK). När det väl aktiverats resulterade det i MITF-nedbrytning och ytterligare nedreglerade uttrycket av tyrosinas, TRP-1, TRP-2, Myosin Va, Rab27a och Cdc42, vilket i slutändan hämmade melaninsyntes och melanosomtransport. Dessutom demonstrerades de hypopigmentära effekterna av J147 in vivo i en zebrafiskmodell och UVB-inducerad hyperpigmenteringsmodell i bruna marsvin. Våra resultat antydde också att J147 inte uppvisade någon cytotoxicitet in vitro och in vivo. Sammantaget bekräftade dessa data att J147 kan visa sig vara ganska användbar som ett säkrare naturligt hudblekningsmedel.

Cistanchehar också funktionen attfrämja kollagenproduktion, vilket kan öka hudens elasticitet och lyster och hjälpa till att reparera skadade hudceller. CistancheFenyletanolglykosiderha en betydande nedreglerande effekt påtyrosinasaktivitet, och effekten på tyrosinas har visat sig vara konkurrenskraftig och reversibel hämning, vilket kan ge en vetenskaplig grund för att utveckla och användavita ingredienseri Cistanche. Därför har cistanche en nyckelroll vid blekning av huden. Det kanhämma melaninproduktionenför att minska missfärgning och matthet; och främja kollagenproduktionen tillförbättra hudens elasticitetoch utstrålning. På grund av det utbredda erkännandet av dessa effekter av cistanche, mångablekning av hudenprodukter har börjat ingjuta växtbaserade ingredienser som Cistanche för att möta konsumenternas efterfrågan, vilket ökar det kommersiella värdet av Cistanche i hudblekningsprodukter. Sammanfattningsvis är cistanches roll i hudblekning avgörande. Dess antioxidanteffekt och kollagenproducerande effekt kan minska missfärgning och matthet, förbättra hudens elasticitet och lyster och därmed uppnå en blekande effekt. Den breda användningen av Cistanche i hudblekningsprodukter visar också att dess roll i kommersiellt värde inte kan underskattas.

Nyckelord: J147, hypopigmentära effekter, melanosomtransport, ERK-väg, MITF-nedbrytning

Klicka på Cistanche Tubulosa för blekning

För mer information: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

INTRODUKTION

Hudens pigmentering beror på både melaninsyntesen och distributionen i epidermislagret. Melanin produceras huvudsakligen runt kärnan i melanocyter och lagras i melanosomer (Tian et al., 2021). Efter mognad migrerade melanosomer längs mikrotubuli och aktinfilament till dendritspetsarna på cellerna och slutligen till de närliggande keratinocyterna för att avsluta distributionsprocessen (Beaumont et al., 2011; Ohbayashi och Fukuda, 2012). Under normal fysiologisk status skyddar melanin mänsklig hud från ultravioletta (UV) skador, giftiga kemikalier och andra miljöfaktorer (Slominski et al., 2004; Yousaf et al., 2020). Men överdriven produktion och ackumulering inducerar hyperpigmentering och är associerade med hudsjukdomar som postinflammatorisk melanoderma, melasma och solar lentigines, vilket leder till en anmärkningsvärd psykosocial börda (Pillaiyar et al., 2017). Därför är det nödvändigt att utveckla effektiva och säkra hudblekningsmedel.

Under de senaste åren har melanincellbiologi blivit ett bredare forskningsfält och flera viktiga proteiner som bidrar till melanogenes och melanosomtransport har belysts, vilket är vägen för identifiering av melaninsynteshämmare. Tyrosinas är uteslutande nödvändigt för melanogenes och hämning av tyrosinas katalytiska verkan är den vanligaste metoden för att minska melaninproduktionen (D'Mello et al., 2016). Flera kända tyrosinashämmare, inklusive arbutin och kojinsyra, har redan utvecklats som kosmetiska tillsatser (Ding et al., 2020). KIF5b och Rab27A-Melanophilin-Myosin Va-komplexet bidrar till den utåtgående melanosomtransporten (Ohbayashi och Fukuda, 2012; Noguchi et al., 2014). Cdc42 reglerar dendritförlängning, vilket är avgörande för melanosomöverföring (Luo, 2000). Hämningen av dessa ovanstående proteiner kan avsevärt undertrycka melanosomtransport, vilket är en viktig mekanism för att utveckla hudblekningsmedel. Mikroftalmiassocierad transkriptionsfaktor (MITF) är en mastertranskriptionsfaktor i melanogenes. Dessutom reglerar MITF också melanosomtransport genom att inducera uttrycket av Rab27a och Cdc42 (Noguchi et al., 2016). Flera signalvägar deltar i pigmentering genom att reglera uttrycksnivån av MITF. Aktivering av cAMP-proteinkinas A (PKA) stimulerar pigmentering genom cAMP-responselementbindande protein (CREB) beroende uppreglering av MITF-uttryck (Rodríguez och Setaluri, 2014). Omvänt, aktivering av extracellulärt signalreglerat proteinkinas (ERK) hämmar melanogenes genom att accelerera MITF-nedbrytning (Lv et al., 2020a). Många anti-melanogena medel har utvecklats som riktar sig mot tyrosinasaktivitet, melanosomöverföring eller melanogenrelaterade signalvägar. Men få inhibitorer genomgick studier in vivo och visade goda resultat (Pillaiyar et al., 2017).

Curcumin är en diarylheptanoidförening isolerad från rhizom av Curcuma longa (Zingiberaceae) och används som en gul smak eller pigment i livsmedel (Zheng J. et al., 2018). Studier har visat dess olika fysiologiska funktioner, inklusive antiinflammatoriska, antioxidativa, anti-amyloid- och antitumöraktiviteter (Liu et al., 2016; Zheng Y. et al., 2018). Bortsett från dessa hämmar curcumin tyrosinasaktivitet och undertrycker melanogenes i melanocyter (Lee et al., 2010; Tu et al., 2012). Men den dåliga biotillgängligheten av curcumin begränsar dess tillämpning (Karthikeyan et al., 2020). För att lösa detta problem utvecklas J147 som en potent förening av curcuminderivat med större stabilitet och biotillgänglighet (Li et al., 2020). J147 har en neuroprotektiv effekt och befinner sig för närvarande i fas I kliniska prövningar för Alzheimers sjukdom. Det finns dock fortfarande ingen rapport om effekterna av J147 på pigmentering in vitro och in vivo.

MATERIAL OCH METODER

Reagens

J147 (J302241), -MSH (M118985) och tyrosinas från svamp (T128536) erhölls från Aladdin (Shanghai, Kina). Vi fick antikroppar mot Myosin Va (sc-365986), KIF5b (sc-133184), GP100 (sc-393094), Cdc42 (sc-8401), Rab27a (sc{{ 13}}), p-JNK (sc-6254), JNK (sc-7345), p-p38 MAPK (sc-166182) och p38 MAPK (sc-398546) från Santa Cruz (CA, USA). Antikropparna mot MITF (97800), p-MEK (2338), MEK (4694), p-ERK (4370) och ERK (4695) erhölls från Cell Signaling Technology (MA, USA). Antikropparna mot tyrosinas (ab180753), TRP-1 (ab235447), TRP-2 (ab221144), cytokeratin (ab7753) och S100 (ab133519) erhölls från Abcam (Cambridge, Storbritannien). p38-hämmare SB203580 (S1863), ERK-hämmare PD98059 (S1805), BCA-proteinanalyskit (P0012), cellysbuffert (P0013) och -aktin (AF5001) erhölls från Beyotime (Shanghai, Kina). RT-qPCR-kit (RR036A) köptes från Takara Biomedical Technology (Beijing, Kina).

Cell kultur

MTT-analys

Cellviabiliteten undersöktes med MTT-analys (Yun et al., 2020). Kortfattat såddes cellerna i 96-brunnsplattor och behandlades med J147 (1–8 μM) i 48 timmar. Sedan tvättades cellerna med PBS och ersattes med MTT-lösning (20 μL). Efter inkubation i ytterligare 4 timmar avlägsnades supernatantlösningen och DMSO (200 μL) sattes till varje brunn. Slutligen bestämdes den optiska absorbansen vid 570 nm.

Mätning av melanininnehåll

Celler med en densitet på 2 × 105 celler/ml såddes i 6-brunnsodlingsplattor. Efter 24 timmars inkubation odlades celler med olika doser av J147 (1, 2, 4 μM) och med eller utan -MSH (60 nM) stimulering. Efter 48 timmars behandling skördades cellerna och det totala melaninet i cellpelleten löstes i 100 μL NaOH-arbetslösning (1 mol/L, 10 procent DMSO) vid 80 grader C under 1 timme, och absorbansen mättes vid 405 nm (Lv et al., 2015; Lv et al., 2019).

Tyrosinasaktivitetsanalys

Cellulär tyrosinasaktivitet undersöktes såsom beskrivits tidigare (Liao et al., 2017; Lv et al., 2020a). I korthet lyserades celler med cellysbuffert efter tvättning tre gånger, och sedan erhölls supernatanten för tyrosinasaktivitetsanalys genom att centrifugera lysaten. 100 μL PBS (0,1 M, pH 6,5) innehållande 10 ug proteiner blandat med 100 μL 0,1 procent L-DOPA. Plattan inkuberades vid 37 grader under 1 timme, och sedan övervakades optisk absorbans vid 475 nm.

Den direkta effekten av J147 på tyrosinasaktivitet testades av ett cellfritt system som beskrivits tidigare (Lv et al., 2020a). I korthet utfördes reaktionen för bestämning av svamptyrosinasaktivitet i en 96-brunnsplatta och reaktionsblandningen innehöll svamptyrosinas (10 enheter), L-tyrosin (0,03 %, 50 μL) och 100 μL PBS (0,1 M, pH 6,5) tillsats med olika koncentrationer av J147. Efter inkubation vid 37 grader under 10 minuter mättes absorbansen vid 475 nm med användning av en mikroplatta spektrofotometer.

Masson–Fontana ammoniaksilverfärgning

För att detektera melaninpigment fixerades hudbitar och melanocyter i formalin och färgades enligt standardprotokollet (Gu et al., 2018; Lv et al., 2020b). Kortfattat tvättades objektglasen 3 gånger med avjoniserat vatten och inkuberades sedan i ammoniaksilverlösning vid rumstemperatur under 12 timmar. Efter att ha sköljts väl i avjoniserat vatten inkuberades objektglasen i hypolösning under 5 min. Därefter sköljdes objektglasen igen och motfärgades med en neutral röd fläck i ytterligare 5 min. Slutligen, efter noggrann sköljning, observerades objektglasen under ett Nikon-Eclipse-Ti-mikroskop.

Immunfluorescens för melanosomöverföring

Samodlingssystemet för B16F10- och HaCaT-celler etablerades på den konfokala skålen, som beskrivits tidigare (Lee et al., 2015; Lv et al., 2020c). Efter J147-behandlingen immunfärgades cellerna med anti-GP100 och anti-Cytokeratin enligt standardprotokollet. Bilderna togs från Nikon-Eclipse-Ti-mikroskopet.

Immunhistokemi för S-100

Immunhistokemi för S-100 utfördes som tidigare beskrivits (Lee et al., 2013; Lv et al., 2020b). En kort beskrivning var följande: objektglasen blockerades med 5 procent BSA vid 25 grader C under 1 timme och inkuberades sedan med anti-S-100 primär antikropp vid 4 grader C över natten. Nästa dag tvättades objektglasen 3 gånger med TBST-lösning och inkuberades med den sekundära antikroppen. Därefter behandlades objektglasen med aminoetylkarbazol för att framkalla sektionerna och observerades under ett mikroskop.

Omvänd transkription – PCR

Cellulärt totalt RNA extraherades med TRIzol-reagens och kvantifierades spektrofotometriskt. Sedan användes SuperScript II omvänt transkriptas för att syntetisera enkelsträngatcDNA enligt tillverkningsinstruktionerna.Oligonukleotidprimrar köptes från GenScript(Nanjing, Kina). Sekvenserna avMITFgenprimrar är 5′- AGAGCAGGGGCAGAGAGTGAGTG -3′, 5′-AACTTGATTCCAGGCTGATGATGTC -3′. Sekvenserna avGAPDHgenprimers är 5′- AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′, 5′- TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA -3′. PCR-produkter varseparerades genom elektrofores på 1 procent agarosgeler och detekteradesunder ultraviolett ljus (Lee et al., 2013).

Western Blotting

Proteiner (40 ug) separerades med SDS-PAGE-geler och överfördes till nitrocellulosafilter (NC)-membran med ett elektroforetiskt överföringssystem (Bio-Rad). NC-membran blockerades med 3 procent BSA i TBST-lösning vid rumstemperatur under 1,5 timmar. Därefter inkuberades membran med primära antikroppar vid 4 grader över natten. Nästa dag tvättades blottarna 3 gånger med TBST-lösning och inkuberades sedan med peroxidaskonjugerade sekundära antikroppar vid 25 grader i 1 timme och visualiserades genom att använda förstärkt kemiluminescens (Lv et al., 2020d).

Bestämning av melanininnehåll i zebrafiskmodell

Kortfattat, synkroniserade embryon samlades in och arrangerades med pipett (tre till fyra embryon per brunn med 2 00 μL embryomedium i 96-brunnsplattor). Sedan löstes J147 och PTU i 0,1 procent DMSO och sattes till embryomediet från 35 till 60 timmar (25 timmars exponering). Inverkan av J147 på melanogenesen av zebrafisk observerades under stereomikroskopet (Zheng J. et al., 2018).

Fenotypbaserad utvärdering och UVB-inducerad hyperpigmentering marsvinsmodell

8 bruna marsvin (6 veckor, cirka 250–300 g) köptes från Institute of Laboratory Animal Science (Peking, Kina). Dessa marsvin hölls ensamma i ett rum med konstant temperatur och luftfuktighet under en 12-h ljus/mörkercykel. De separata områdena (1 cm diametral cirkel) på baksidan av varje djur exponerades för 500 mJ/cm2 UVB (Sigma SH-4, Shanghai, Kina) en gång om dagen under 1 vecka för att etablera hyperpigmenteringsmodellen. Sedan gavs vehikeln (PEG400/EtOH=7:3) och J147 (1 procent) till de hyperpigmenterade områdena (20 μL lösning per cirkel) två gånger om dagen i 3 veckor. Graden av pigmentering utvärderades genom att beräkna ΔL-värdet enligt L-värdet uppmätt med spektrofotometern (YS3010, 3nh, Shenzhen, Kina), enligt följande: ΔL=L (vid varje uppmätt dag)-L (vid dag 0) (Lee et al., 2013; Lv et al., 2020b). Alla djurförsök i denna studie godkändes av djurvårds- och användningskommittén vid Changzhou University.

Statistisk analys

RESULTAT

J147 minskad melanogenes och antalet dendriter i B16F10-celler

Strukturen för J147 visas i figur 1A. För det första utfördes ett cellviabilitetsexperiment för att undersöka om J147 var cytotoxiskt för B16F10-celler. Som visas i figur 1B observerades inga cytotoxiska effekter av J147 vid ett doseringsområde på 1–8 μM efter 48 timmar. Sedan undersökte vi påverkan av J147 på melaninsyntes. Som visas i figur IC inhiberade J147 basal melaninsyntes. -MSH främjar avsevärt melanogenes i melanocyter. Ökningen av melanogenes inducerad av -MSH vändes efter J147-behandling. Konsekvent visade Masson-Fontana ammoniaksilverfärgning att J147 minskade anmärkningsvärt melanininnehållet i B16F10-celler med eller utan -MSH (Figur 1D). Dessutom minskade antalet och längden av dendriter och melaninkoncentrationen i dendriter också jämfört med obehandlade celler (Figur 1D). Resultaten antydde att J147 minskade melanogenes och dendritbildning utan cytotoxiska effekter.

J147 hämmade den cellulära tyrosinasaktiviteten och uttrycket av tyrosinas, TRP-1, TRP-2

Tyrosinasfamiljen av proteiner (tyrosinas, TRP-1 och TRP-2) deltog i melanogenes. Bland dessa är tyrosinaser nyckelenzymer som reglerar melaninbiosyntesvägen (D'Mello et al., 2016). För att avgöra om J147 påverkar tyrosinasaktivitet, använde vi först L-DOPA-oxidationsmetoden för att bestämma effekterna av J147 på cellulär tyrosinasaktivitet. J147 (1–4 μM) visades utöva djupgående hämmande effekter på cellulär tyrosinasaktivitet på ett dosberoende sätt i B16F10-celler (Figur 2A). Därefter utfördes en svamptyrosinasaktivitetsanalys för att bestämma de direkta effekterna av J147 på tyrosinasaktiviteten. Som visas i figur 2B observerades inga hämmande effekter, vilket indikerar att J147 inte påverkade de enzymatiska aktiviteterna av svamptyrosinas (figur 2B). Som vi vet styrs melanogenes av aktiviteten och mängderna av dessa tyrosinaser. För att undersöka om de anti-melanogena effekterna av J147 är korrelerade med uttrycket av tyrosinas, genomfördes Western blot-analys. Som visas i figur 2C reducerades nivåerna av tyrosinasexpression signifikant efter J147-behandling med eller utan -MSH, och samma resultat observerades i TRP-1- och TRP-2-uttrycket. Dessa observationer indikerade att J147 hämmade cellulär tyrosinasaktivitet och melanogenes genom att minska expressionsnivåerna av tyrosinas, TRP-1 och TRP-2.

J147 hämmade melanosomtransport genom att reglera uttrycket av myosin Va, Rab27a och Cdc42

Människans hudpigmentering bestäms av melaninsyntesen såväl som fördelningen av melanin. I däggdjursmelanocyter tillverkas melanin huvudsakligen i cellkroppen ochmigrerar längs aktinfilamentoch mikrotubuli till dendriter, och slutligentill de närliggande keratinocyterna för att avslutafördelningenbearbeta (Ohbayashi och Fukuda, 2012). Som visas iFigur 1D, J147 minskade markant dendritbildningen.Dessutom var melaninkoncentrationen i dendriter ocksåreduceras när melaninpigmentet aggregerades i perinukleärtregioner. Därefter samodlade vi B16F10- och HaCaT-celler tillundersöka om J147 påverkarmelanosomöverföring tillkeratinocyter genom konfokalmikroskopi. Fördelningen avmelanin sågs i HaCaT-cellerna i samkulturenmodell (Figur 3A). Däremot medan samkulturmodellen varbehandlas med J147 i 48 timmar, melanosomgranulära signaler inHaCaT-celler var signifikantreducerad (Figur 3A).

För att ytterligare klargöra den underliggande mekanismen för hämningseffekterna av melanosomöverföring av J147, undersökte vi flera avgörande faktorer involverade i melanosomtransport. KIF5b förmedlar utåtgående melanosomtransport längs mikrotubuli, och Rab27a Melanophilin-Myosin Va-komplexet bidrar till melanosomtransport längs aktinfilament i melanocyter (Reiner et al., 2020). Dessutom stimulerar Cdc42 bildning av dendriter i melanocyter, vilket också spelar en viktig roll i melanosomtransport. Som visas i figur 3B minskade uttrycket av Cdc42, Myosin Va och Rab27a, men inte KIF5b signifikant efter J147-behandling i tillståndet med eller utan -MSH. Våra resultat indikerade att J147 hämmade melanosomtransport genom att minska uttrycket av Myosin Va, Rab27a och Cdc42.

J147 Accelererad MITF-nedbrytning

MITF är en av nyckelregulatorerna för melanogenes och den kontrollerar gentranskriptionen av tyrosinas, TRP-1, TRP-2, Cdc42 och Rab27a (Noguchi et al., 2016; Kim et al., 2019 ). Vi undersökte först påverkan av J147 på MITF-transkript. Som visas i figur 4A ökade -MSH anmärkningsvärt MITF-transkriptionen, men ingen förändring observerades efter J147-behandling, vilket indikerar att J147 inte nedreglerar MITF-uttryck. Därefter undersökte vi om J147 påverkar översättningen av MITF. Som visas i figur 4B, efter -MSH-behandling, ökade MITF-proteinnivåerna, toppade vid 4 timmar och började minska vid 8 timmar (figur 4B). På ett annat sätt minskade inte proteinnivåerna av MITF vid 4 timmar efter J147-behandling, men vid 8 timmar sjönk MITF-proteinnivåerna snabbt till odetekterbara nivåer, vilket indikerar att J147 inte påverkar översättningen av MITF utan påfallande accelererar MITF-proteinnedbrytningen.

J147 undertryckt melanogenes genom MEK/ERK-signalvägen

Mitogenaktiverade proteinkinaser (MAPK) signalväg, inklusive extracellulärt signalreglerat proteinkinas (ERK), p38 och c-jun N-terminalt kinas (JNK), spelar avgörande roller i pigmentering (Lee et al., 2013). ERK-fosforylering är känd för att underlätta nedbrytningen av MITF och så småningom skingra de melanogena stimuli, som representerar en viktig negativ återkopplingsmekanism (Kwon et al., 2017). Funktionen av p38 och JNK-vägen förblir dock kontroversiell. Därför undersökte vi effekten av J147 på MAPK-signalvägarna. Som visas i figur 5A aktiverade J147 MEK/ERK och p38, medan ingen påverkan hittades i fosforyleringen av JNK-signalvägen.

För mer information: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501