Mekanismen för Cistanche Deserticola som främjar tarmfunktionen

Yuan Gao, Chuanjie Zong, Fen Liu, Lei Fang, Runlan Cai, Yue Shi, Xi Chen, Yun Qi

Abstrakt

Fenyletanoidglykosider(PhGs), en klass av polyfenoliska föreningar, anses vara en av de viktigaste bioaktiva beståndsdelarna iCistanchedeserticolaYC Ma (CD), vars extrakt används oralt i traditionell kinesisk medicin. Även om tidigare farmakologiska studier har rapporterat att PhG utövar många aktiviteter, har deras tarmtransportprofiler inte klarlagts. I denna studie undersökte vi tarmpermeabiliteten för ett PhG-rikt extrakt (PRE) frånCistancheDeserticolasom ett integrerat system i Caco-2-cellmonolagermodellen med hjälp av ett bioanalyssystem. Resultaten visade att PRE främst transporteras via dåligt absorberad passiv diffusion nedför en koncentrationsgradient utan efflux, vilket ger den farmakokinetiska basen för den kliniska tillämpningen av PhGs iCistanche Deserticola. Vi bestämde också tarmpermeabiliteten för tre huvudtyperPhGs[akteosid (AC), isoakteosid (IS) och echinakosid (EC)]av HLPC. Dessutom utvecklade vi en ny HPLC-fluorescensdetektionsmetod för att exakt bestämma flödesmängden AC och IS. Som förväntat, transportegenskaperna hos de trePhGsöverensstämmer med de för PRE, vilket indikerar att det nuvarande bioassaysystemet är lämpligt och tillförlitligt för utvärdering av transportegenskaperna för aktiva ingrediensgrupper (AIG) i PRE. Dessutom kan detta system också vara lämpligt för andra växtextrakt med lämplig bioaktivitet.

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Cistanche deserticola har många effekter, klicka här för att veta mer

Introduktion

Caco-2-cellinjen, som härrörde från humana kolonadenokarcinom, uppvisar enterocytliknande egenskaper. Under normala förhållanden differentierar Caco-2-celler sig spontant från mogna celler och bildar intakta monolager [1]. De intilliggande cellerna vidhäftar via täta förbindelser bildade vid den apikala sidan av monoskiktet, vilket kan särskilja de passivt och aktivt transporterade läkemedlen över epitelskiktet [2]. På grund av den morfologiska och biokemiska likheten med normala enterocyter, fungerar Caco-2-cellmonoskikt som en väl accepterad in vitro-modell för studiet av den intestinala absorptionspotentialen och transportegenskaperna hos läkemedel [3, 4].

Till skillnad från kemikalier är växtextrakt (PE) blandningar vars biologiska aktivitet och aktiva beståndsdelar ofta inte är väl identifierade [5]. Dessutom är tarmtransportegenskaperna hos PE, i motsats till egenskaperna hos dess beståndsdelar, nära relaterade till klinisk användning. Fluxmätningar för ett testprov över ett Caco-2-cellmonoskikt involverar vanligtvis kemiska metoder, såsom HPLC, LC/MS, etc. Även om dessa metoder är kraftfulla verktyg är de komplexa, tidskrävande, dyra och ibland kräver sofistikerad utrustning. Ännu viktigare är att varken en enskild eller en minoritetskomponent kan återspegla PE som helhet. Ett nytt tillvägagångssätt oberoende av bestämning av beståndsdelar måste därför etableras för att identifiera och utvärdera PEs transportegenskaper.

CistanchedeserticolaYC Ma (CD), en holoparasitisk växt, är en vanlig traditionell kinesisk medicin som främst används för att behandla njurbrist, kroppssvaghet och förstoppning, och dessa användningar har officiellt registrerats i den kinesiska farmakopén [6]. Fenyletanoidglykosider (PhGs), inklusive echinacoside (EC), acteosid (AC), isoacteosid (IS), etc., är en klass av polyfenoliska föreningar [7]. De anses vara en av de viktigaste bioaktiva beståndsdelarna iCistancheart [8]. Farmakologiska studier har visat att bioaktiviteten avPhGsär mångsidig och inkluderar antioxidativa [9], anti-trötthet [10], leverskyddande [11], immunmodulerande [12], antiinflammatoriska [7, 13] och neuroprotektiva effekter [14]. Men tarmtransportegenskaperna hosPhGshar inte undersökts. I den här studien undersökte vi intestinal permeabiliteten för ett PhG-rikt extrakt (PRE) från CD som ett integrerat system och permeabiliteten för tre stora PhG (AC, IS och EC) i differentierade Caco-2-celler. Våra resultat indikerade att PRE främst transporteras via dåligt absorberad passiv diffusion nedför en koncentrationsgradient utan efflux, vilket ger den farmakokinetiska grunden för den kliniska tillämpningen av PhGs i CD.

Material och metoder

Material

The human intestinal Caco-2 cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). AC, IS and EC (>98 procent) köptes från Must Biotechnology Co. (Chengdu, Kina). Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM), fetalt bovint serum (FBS) och icke-essentiella aminosyror (NEAA) producerades av Gibco BRL (Grand Island, NY, USA). 6-brunns TranswellTM-plattor (insert membrantillväxtarea 4,67 cm2) erhölls från Corning (Costar) Inc. (Tewksbury, MA, USA). Råttsvanskollagen erhölls från Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Alla reagenser och kemikalier för HPLC-analysen var av analytisk kvalitet.

Beredning av PRE från Cistanche deserticola

Det lufttorkade CD-materialet pulveriserades och extraherades genom perkolering med 70 procent etanol. Den PhG-rika fraktionen framställdes som tidigare beskrivits [10] och extraherades med vattenmättad n-butylalkohol. Extraktluten koncentrerades och torkades under reducerat tryck. Makroporös harts-UV-spektrofotometri [15] mätte en PhG-halt på 78,4 procent. Det slutliga provet representerade ett utbyte på 1,75 procent av råmaterial i torrvikt. Det erhållna provet förvarades vid -20 grader tills vidare användning.

Bestämning av AC, IS och EC med HPLC

Ett Shimadzu HPLC-system utrustat med LC-lösningsprogramvaran användes för att analysera innehållet av AC, IS och EC i PRE. En omvänd fas Intersil C18-kolonn (4,6 mm × 25 0 mm, 5 μm) användes och hölls vid rumstemperatur. De mobila faserna var acetonitril och vatten innehållande 0,1 procent fosforsyra (v/v) med gradienteluering (tabell 1) vid en flödeshastighet av 1,0 ml/min. UV-spektrofotometerdetektorn var inställd på 334 nm. För att exakt bestämma flödet av AC och IS utvecklade vi en ny metod för HPLC-fluorescensdetektion (HPLC-FLD). Efter en strukturell analys och fluorescensvåglängdsskanning (data visas inte) erhöll vi de optimala fluorescensdetektionsförhållandena för AC (Ex: 338 nm, Em: 448 nm) och IS (Ex: 320 nm, Em: 434 nm)

HPLC-analysmetoden validerades med hjälp av följande prestandaegenskaper: stabilitet, linjäritet, känslighet, precision (variabilitet inom och mellan dagar) och noggrannhet. Analyterna i transportbufferten förvarades vid 25 grader i mörker under 24 timmar och deras stabilitet mättes. Analyterna var mycket stabila i närvaro av vitamin C (0,4 procent) eftersom de relativa standardavvikelsevärdena (RSD) i toppområdena var < 3,5="" procent.="" den="" linjära="" regressionsekvationen,="" korrelationskoefficienten,="" linjäritetsområde,="" lod="" och="" loq="" för="" ac,="" is="" och="" ec="" visas="" i="" tabell="" 2.="" lod="" (18–30="" nm)="" och="" loq="" (60–100="" nm)="" värden="" illustrerar="" att="" hplc-fld-="" och="" hplc-uv-metoderna="" är="" mycket="" känsliga.="" rsd-värdena="" som="" uttrycker="" metodens="" precision="" var="" alla="">< 2="" procent="" för="" variabilitet="" inom="" och="" mellan="" dagar,="" vilket="" tyder="" på="" god="" precision.="" för="" utvärdering="" av="" återvinning="" tillsattes="" ac,="" is="" och="" ec="" till="" transportbufferten="" för="" att="" ge="" tre="" (höga,="" medelhöga="" och="" låga)="" koncentrationsnivåer.="" återvinningsvärdena="" för="" metoden="" för="" analyterna="" är="" sammanfattade="" i="" tabell="" 3.="" de="" genomsnittliga="" återvinningarna="" varierade="" från="" 90,0="" procent="" till="" 96,4="" procent,="" vilket="" indikerar="" god="" noggrannhet.="" sammanfattningsvis="" är="" de="" etablerade="" hplc-metoderna="" tillfredsställande="" med="" avseende="" på="" linjäritet,="" känslighet,="" precision="" och="" noggrannhet="" för="" kvantifiering="" av="" ac,="" is="" och="" ec="" i="">

Bestämning av PRE genom bioanalyssystem

Bioanalysen (total antioxidativ kapacitet) baserades på FRAP-analysen (ferric reducing/antioxidant power) som vi tidigare beskrivit [16] och validerades i termer av linjäritet och precision (variabilitet inom och mellan dagar). Linjäriteten för bioanalysmetoden bestämdes baserat på kalibreringskurvorna. Koncentrationsintervallet för linjäritet var 0.0625 − 40 ug/ml (y=0.0258x plus 0.0968, R2=0.996). Precisionen för den etablerade bioassaymetoden bestämdes i termer av variabiliteten inom och mellan dagar för en analys av PRE (10,0 ug/ml). Metodens repeterbarhet under dagen bestämdes baserat på fem på varandra följande bestämningar på samma dag. Repeterbarheten mellan dagar mättes baserat på fem på varandra följande bestämningar på tre olika dagar. RSD-värdena för metodens precision var 1,014 procent och 4,72 procent för variabilitet inom respektive dag, vilket indikerar god precision. Således är den etablerade bioanalysmetoden tillfredsställande med avseende på linjäritet, precision och noggrannhet för kvantifieringen av PRE i transportbuffert.

Cell kultur

Caco{{0}}-celler odlades vid 37 grader och 95 procent relativ luftfuktighet i en atmosfär innehållande 5 procent CO2 och medium bestående av DMEM, 10 procent FBS, 1 procent NEAA, 1 procent L-glutamin, penicillin ( 100 U/ml) och streptomycin (100 ug/ml). Mediet byttes varannan dag under celltillväxt och differentiering. Cellerna odlades i 75-cm2 plastflaskor och skördades var 3-5 dag med 0,05 procent EDTA-trypsin. För transportexperimenten såddes cellerna med en densitet av 1×105 celler/cm2 på Transwell-inlägg belagda med kollagen. Ungefär 21 dagar efter sådd användes monoskikten för transportexperimenten. Deras integritet bestämdes genom att mäta det transepiteliala elektriska motståndet (TEER) över monoskikten med en EVOM utrustad med ENDOHM-SNAP (World Precision Instruments, Inc., USA). TEER-värdena för Caco-2-cellmonoskiktet behövde överstiga 500 O∙cm2.

Transportexperiment

Monoskiktet tvättades med transportbuffert (P-buffert innehållande 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvat, 10 mM glukos, 3 mM CaCl2 och 145 mM NaCl, pH 7,4) och förinkuberades sedan i 20 minuter vid 37 grader. Efter avlägsnande av transportbufferten sattes färsk transportbuffert innehållande testprover till den apikala (AP) kammaren (1,5 ml) i AP till basolaterala (BL) riktningsstudier eller BL-kammaren (2,5 ml) i BL till AP riktningsstudier. För AC-, IS- och EC-analyser med användning av HPLC avlägsnades en alikvot (300 ul) från varje mottagarkammare vid olika tidsintervall (30, 60, 90 och 120 min). Mottagningskammaren fylldes på med samma volym färsk förvärmd (37 grader) transportbuffert efter varje provtagning. De insamlade proverna förvarades vid -20 grader för vidare användning. För PRE-bestämning med bioassay togs endast proverna efter 120 minuter. På grund av instabiliteten hos PRE, AC, IS och EC tillsattes 0,4 procent (vikt/volym) vitamin C för att stabilisera proverna för att bestämma AC-, IS- och EC-halterna med HPLC, och proverna för PRE bioassay analyserades omedelbart efter provtagning. Den skenbara permeabilitetskoefficienten (Papp eller 'Papp) värde för varje prov beräknades.

Dataanalys

Papp-värdena i AP BL- eller BLAP-riktningarna för AC, IS och EC beräknades baserat på följande ekvation: Papp {{0}} (4Q/4t)/(AC0), där Papp är den skenbara permeabilitetskoefficienten (cm/s) bestämd med HPLC. (4Q/4t) är graden av uppkomst av testföreningen (AC, IS eller EC) på mottagarsidan (μmol/s); A är skärets yta (cm2); CO är den initiala testföreningskoncentrationen på givarsidan (μmol/ml). Specifikt användes massenheten "ug" istället för "μmol" när 'Papp-värdena beräknades. Data uttrycks som medel ± SD.

Resultat

Sammansättning av Acteosid, Isoacteosid och Echinacoside i PRE från Cistanche Deserticola

Eftersom AC, IS och EC anses vara de viktigaste bioaktiva PhGs av Cistanche-arter [8], analyserade vi deras innehåll i PRE via HPLC-UV. Det representativa kromatogrammet visas i fig. 1. Identifieringen av dessa beståndsdelar baserades på jämförelse av retentionstiderna och UV-spektrumet med de för autentiska standarder vid en våglängd av 334 nm. Innehållet av AC, IS och EC i PRE var 26,60 procent, 1,84 procent respektive 32,83 procent. Således står dessa tre föreningar för 61,27 procent av PRE; dessutom indikerar ovanstående resultat att PhG-halten i PRE är 78,4 procent. Därför står AC, IS och EC för cirka 80 procent av PhGs i PRE.

Total antioxidativ kapacitet av PRE, AC, IS och EC

Studier av den antioxidativa aktiviteten hos PhG från CD har rapporterats [9], och AC, IS och EC står för cirka 80 procent av PhG i PRE. Således analyserades den totala antioxidativa kapaciteten hos PRE, AC, IS och EC och uttrycks med hjälp av FRAP-värdena (× 10–6 mmol). Som visas i Fig. 2, när FRAP-värdet var 8 × 10–6 mmol, var slutkoncentrationerna av PRE, AC, IS och EC 6,20 ug/ml, 3,14 ug/ml, 22,92 ug/ml och 4,89 ug/ ml, vilket indikerar att den totala antioxidativa kapaciteten för dessa fyra prover rankades enligt följande: AC > EC > PRE > IS. Bioaktiviteten hos PRE tillskrivs dess aktiva ingrediensgrupper (AIG). För cirka 60 procent av PRE, AC och EC visade starkare total antioxidativ aktivitet än PRE och IS. Eftersom IS (1,84 procent) utgör en mycket liten del av PRE, är andra komponenter, såsom den svagt antioxidativa IS, också tydligt aktiva i PRE. Överraskande nog skilde sig den totala antioxidativa aktiviteten nästan 7- gånger mellan AC och dess isomer IS, vilket indikerar inte bara antalet fenoliska hydroxylgrupper [9] utan även placeringen av fenoliska hydroxylgrupper i molekylen påverkade anti -oxidativ effekt.

Validering av Caco-2 monolager

För att validera Caco-2-cellmonolagersystemet, Papp-värdena för propranolol (en vältransporterad markör) och Lucifergul (en dåligt transporterad markör) från AP till BL över Caco-2-monoskikten bestämdes till 1,51 × 10–5 cm/s respektive 2,8 × 10–7 cm/s, och dessa värden överensstämde med de som publicerats i tidigare rapporter [17, 18]. Analysen av alkaliskt fosfatasaktivitet bekräftade också att Caco-2-cellmonoskikten var kvalitativt jämförbara med tunntarmsepitelet [19]

Permeabiliteten av Acteosid, Isoacteosid och Echinacoside

In general, the Papp values of well-absorbed drugs were high (>1.0 × 10–5 cm/s), medan de för dåligt absorberade läkemedel var låga (< 1.0="" ×="" 10–6="" cm/s)="" [3].="" as="" shown="" in="" table="" 4,="" the="" papp="" values="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" was="" nearly="" on="" the="" order="" of="" 10–7="" cm/s,="" indicating="" that="" these="" compounds="" were="" poorly="" permeable.="" furthermore,="" efflux="" or="" active="" transport="" were="" not="" observed="" because="" the="" ratios="" of="" papp="" bl="" to="" ap="" papp="" ap="" to="" bl="" for="" ac,="" is="" and="" ec="" was="" between="" 0.90="" ~="" 1.55,="" and="" the="" criterion="" of="" net="" efflux="" proposed="" by="" the="" fda="" guidance="" is="" a="" ratio="" less="" than="" 2="" [20].="" based="" on="" the="" kinetic="" curves="" presented="" in="" fig.="" 3,="" the="" bidirectional="" transport="" percentages="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" at="" 200="" μm="" increased="" linearly="" with="" time.="" the="" transport="" rate="" (tr)="" values="" of="" the="" three="" compounds="" increased="" linearly="" in="" both="" directions="" between="" approximately="" 100="" and="" 300="" μm="" (fig.="" 4).="" these="" results="" indicate="" that="" the="" main="" transport="" mechanism="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" is="" also="" passive="">

Permeabiliteten av PRE

Ovanstående resultat indikerar att den totala antioxidativa kapaciteten hos PRE åtminstone beror på 61,27 procent av AIG från PRE. Således utvärderade vi TR för PRE baserat på dess koncentration-effektkurva för total antioxidativ kapacitet och beräknade 'Papp-värdena för att återspegla transportegenskaperna för PRE. 'Papp-värdena för PRE för AP!BL och BL!AP var (2,16 ± 0,26) × 10–7 cm/s och (3,13 ± 0,29) × 10–7 cm/ s, vilket indikerar att denna förening var dåligt permeabel. Dessutom var efflux eller aktiv transport inte uppenbar eftersom förhållandet mellan 'Papp BL till AP / 'Papp AP till BL för PRE var 1,45 [20]. Dessutom ökade den dubbelriktade TR för PRE linjärt mellan cirka 300 och 900 ug/ml (Fig. 5). Avsaknaden av riktningspreferens av resultaten tyder på att passiv diffusion är den huvudsakliga transportmekanismen för PRE.

Diskussion

Jämfört med högrenade läkemedelsprodukter är PE i allmänhet en blandning som består av hundratals beståndsdelar med vitt skilda fysiokemiska egenskaper. Därför utövar PE systematisk, multitarget och flerkanals synergistisk verkan på grund av deras komplexa AIG [21], vilket hindrar analysen av PEs transportegenskaper. För att utvärdera transportegenskaperna hos PE mer vetenskapligt har vissa forskare identifierat flera komponenter, snarare än en enda komponent, i PE [22–24]. Ändå kan ett begränsat antal beståndsdelar inte spegla PE som helhet. Det är dock omöjligt att bestämma alla komponenter i PE. Dessutom, om olika komponenter i PE uppvisar helt olika transportegenskaper, kommer de holistiska transportegenskaperna hos PE vara svåra att identifiera.

På 1990-talet användes bioanalyssystem för att utvärdera TR av antimikrobiella medel [25]. År 2005 hade Eguchi och hans kollegor [26] utvärderat den antioxidativa aktiviteten hos morotsextrakt genom att använda BL-media från differentierade Caco-2-celler; detta tillvägagångssätt är mer lämpligt för att återspegla in vivo-situationer.

Baserat på en tidigare rapport om aktiviteten hos PhGs [9] och våra resultat (Fig. 2), kan TR av AIG i PRE utvärderas genom att bestämma den totala antioxidativa kapaciteten hos mediet i mottagarkammaren. Efter transportexperimenten fann vi att TR för PRE var liknande i båda riktningarna, och denna transport var omättad och dåligt absorberad ('Papp < ​​1.0="" ×="" 10–6="" cm/s)="" [3],="" och="" det="" indikerade="" inte="" utflöde,="" vilket="" tyder="" på="" att="" passiv="" diffusion="" nedför="" en="" koncentrationsgradient="" är="" den="" huvudsakliga="" transportmekanismen="" för="" pre="" (fig.="" 5).="" vidare="" överensstämmer="" transportegenskaperna="" för="" pre="" med="" de="" för="" ac,="" is="" och="" ec,="" de="" effektiva="" komponenterna="" som="" uppvisar="" antioxidativ="" aktivitet="" i="" pre="" (fig.="" 4="" och="" tabell="" 4).="" detta="" resultat="" förväntades="" och="" indikerade="" att="" det="" nuvarande="" bioassaysystemet="" är="" lämpligt="" och="" tillförlitligt="" för="" utvärdering="" av="" transportegenskaperna="" för="" aig="" i="" pre="" i="" differentierade="">

I motsats till det kanoniska Papp-värdet, som vanligtvis används för att spegla transporten av en enstaka förening, kan 'Papp-värdet som erhålls från TR baserat på koncentration-effektkurvan inte bara återspegla de komponenter som penetrerar monolager med en intakt struktur utan involverar även andra faktorer relaterade till målaktiviteten, såsom komponenternas metaboliter, kemiskt nedbrutna produkter och till och med vissa cytokiner som utsöndras från Caco-2-celler som svar på stimulering som kan påverka målbioaktiviteten. Således bestämmer multifaktorn som nämns ovan, snarare än bara de transporterade intakta komponenterna, 'Papp-värdet. Därför kan 'Papp korrelera starkare inom Vivo-situationer än det kanoniska Papp-värdet [26]. I denna studie klargjorde vi den passivt diffusa och dåligt absorberade naturen hos PRE baserat på dess 'Papp-värde, och denna karaktär kan vara relaterad till den höga dosen och långa kliniska behandlingsperioden för CD [27]. Ändå kommer dessa fynd att ge mer systematisk vägledning för kliniker i tillämpningen av CD när endast transportegenskaperna för de flesta AIG i CD, inte bara PhGs, har identifierats.

Det valda bioaktivitetsobjektet måste dock vara tillräckligt känsligt för att kunna detekteras i mediet i mottagarkammaren, vilket utgör en utmaning för upprättandet av ett bioanalyssystem för att utvärdera transportegenskaperna hos PE. Dessutom bör bioaktiviteten också bero på så många komponenter som möjligt. I vår studie var analysen av den totala antioxidativa kapaciteten mer lämplig än flera andra metoder (S1 Fig.). Men trots det kan vår analys bara detektera TR för PRE vid 120 min.

Tillsammans etablerade den här studien ett nytt bioanalyssystem för att utvärdera tarmpermeabiliteten för PRE i differentierade Caco-2-celler. De erhållna resultaten visade att en dåligt absorberad passiv diffusion nedför en koncentrationsgradient utan utflöde är den huvudsakliga transportmekanismen för PRE (Fig. 5), vilket ger den farmakokinetiska grunden för den kliniska tillämpningen av PhGs i CD. Användningen av ett nytt bioassaysystem för att utvärdera TR och därigenom beräkna 'Papp-värdena för att bedöma tarmtransportegenskapen hos AIG i PE är klart genomförbar. Detta tillvägagångssätt kan också vara lämpligt för annan PE givet lämplig bioaktivitet

Stödjande information

S1 Fig. Effekter av PRE på (A) superoxidanjon, (B) hydroxylradikal, (C) lipidperoxidationsprodukt och (D) DPPH-radikal. Analysprocedurerna utfördes enligt tidigare rapporter [1, 2] utan användning av transportbuffert. Värdena för IC50 (50 procent hämningskoncentration) och SC50 (50 procent renande koncentration) beräknades baserat på standardkurvorna för koncentration och svar. (DOCX)

Författarbidrag

Tänkte och designade experimenten: YG XC YQ. Utförde experimenten: YG CZ FL LF RC YS. Analyserade data: CZ YG YQ. Bidragna reagenser/material/analysverktyg: RC. Skrev uppsatsen: YG YQ

Institutionen för forskningscentrum för farmakologi och toxikologi, Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Peking, PR Kina,

Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin, Heilongjiang, PR Kina