AbstraktÄven om åldrande är den största riskfaktorn för mänskliga kroniska (cancer, diabetiker, kardiovaskulära och neurodegenerativa) sjukdomar, är få ingrepp kända förutom kalorirestriktioner och ett litet antal läkemedel (med betydande biverkningar) som direkt åtgärdar åldrande. Det finns alltså ett akut behov av nya alternativ som generellt kan försena åldrandeprocesser och förebygga åldersrelaterade sjukdomar. Cellulärt åldrande är grunden för åldringsprocesser. Den kronologiska livslängden (CLS) för jäst Saccharomyces cerevisiae är det väletablerade modellsystemet för att undersöka ingripanden av mänskligt postmitotiskt cellulärt åldrande. CLS definieras som antalet dagar celler förblir livskraftiga i en stationär fas. Vi utvecklade en ny, billig och snabb kvantitativ metod för att mäta CLS i cellkulturer inkuberade tillsammans med olika kemiska medel och kontroller på 96-brunnsplattor. Vårt PICLS-protokoll med (1) användningen av propidiumjodid för fluorescensbaserad cellöverlevnadsavläsning i en mikroplattläsare och (2) mätning av totalt cellantal via OD600nm-absorption från samma platta ger verklig hög genomströmningskapacitet. Beroende på logistik kan stora antal plåtar bearbetas parallellt så att sållningen av tusentals föreningar blir genomförbar på kort tid. Metoden validerades genom att mäta effekten av rapamycin och kalorirestriktion på jäst CLS. Vi använde denna metod för screening av kemiska medel. Vi upptäckte den anti-aging/neuroskyddande potentialen hos 2,5-anhydro-D-mannitol (2,5-AM) och föreslår dess användning individuellt eller i kombination med andra antiåldrande åtgärder.

Glykosid av cistanche kan också öka aktiviteten av SOD i hjärt- och levervävnader och avsevärt minska innehållet av lipofuscin och MDA i varje vävnad, effektivt rensa upp olika reaktiva syreradikaler (OH-, H₂O₂, etc.) och skydda mot DNA-skador orsakade av OH-radikaler. Cistanche-fenyletanoidglykosider har en stark rensande förmåga av fria radikaler, en högre reducerande förmåga än vitamin C, förbättrar aktiviteten av SOD i spermiesuspension, minskar innehållet av MDA och har en viss skyddande effekt på spermiemembranfunktionen. Cistanche-polysackarider kan öka aktiviteten av SOD och GSH-Px i erytrocyter och lungvävnader hos experimentellt åldrande möss orsakade av D-galaktos, samt minska innehållet av MDA och kollagen i lungor och plasma, och öka innehållet av elastin, har en bra rensande effekt på DPPH, förlänger hypoxitiden hos åldrande möss, förbättrar aktiviteten av SOD i serum och fördröjer den fysiologiska degenereringen av lungor hos experimentellt åldrande möss. Med cellulär morfologisk degeneration har experiment visat att Cistanche har den goda antioxidantförmågan och har potential att vara ett läkemedel för att förebygga och behandla åldrande hudsjukdomar. Samtidigt har echinacoside i Cistanche en betydande förmåga att avlägsna DPPH-fria radikaler och har förmågan att avlägsna reaktiva syrearter och förhindra friradikal-inducerad kollagennedbrytning, och har även en god reparationseffekt på anjonskada av tymin-fria radikaler.

Klicka för att se produkter mot åldrande

【För mer information: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

NyckelordSaccharomyces cerevisiae · Kronologisk livslängd · Kemisk screening · Antiåldrande förening · 2,5-anhydro-D-mannitol

Introduktion

The growing fraction of the elderly (>65 år) bland den totala befolkningen (från ~ 10 procent i världen (över 20 procent i första världens länder) 2020 till extrapolerade 16 procent år 2050), såväl som deras ökande förväntade livslängd (med ~ 10 år sedan 1960 i första världens länder ), konfronterar världen med allt svårare problem [1, 2]. Förutom att generellt minska livsaktiviteten är åldrandet fortfarande den största riskfaktorn för utvecklingen av kroniska sjukdomar som därefter äventyrar det oberoende mänskliga livet och slutligen leder till döden [3–7]. De nuvarande medicinska metoderna för att förebygga åldersrelaterade patologier är rekommendationer för en hälsosam livsstil, inklusive träning och kost. Dessa ingrepp ensamma är dock inte tillräckliga för att förhindra uppkomsten av åldersrelaterade sjukdomar.

Åldrande kännetecknas av en progressiv förlust av fysiologisk integritet, effektivitet i cellulära funktioner och metabolisk signalering [8]. Ökande ansträngningar riktas för att förstå cellulära åldrandeprocesser som påverkar det mycket sammanlänkade och funktionellt redundanta gen- och proteininteraktionsnätverket [8, 9]. Trots komplexiteten i åldrandet har nyligen genomförd forskning i olika modellsystem, inklusive däggdjur, visat att försenat åldrande och ökad hälsa är möjliga genom anti-aging interventioner såsom rapamycin-läkemedelsadministrering och kalorirestriktion (glukos) [10-15]. Att utöka repertoaren av anti-aging-föreningar som kan användas som geroskyddande terapeutika och minska deras oönskade biverkningar är därför en av de lovande strategierna som kan fördröja åldrandet och förlänga hälsan.

Ny forskning har visat att molekylära mekanismer som observeras vid mänskligt åldrande är bevarade i olika organismer, inklusive encellig jäst [8, 10, 16, 17]. Den spirande jästen Saccharomyces cerevisiae är en av de mest studerade modellorganismerna för att avslöja de biologiska processer som är involverade i cellulärt åldrande. Fördelarna med att studera åldrande i jäst inkluderar en kort generationstid, en lättillgänglig livslängd och dess mottaglighet för analyser med hög genomströmning. Därför blev denna organism ett kraftfullt verktyg för identifiering av anti-aging-interventioner. Jäst används vanligtvis för att studera åldrande på två olika sätt: replikativ livslängd (RLS) och kronologisk livslängd (CLS) [18]. RLS mäter antalet gånger en enskild cell delar sig, en åldrande modell för mitotiska celler som stamceller. CLS mäter hur lång tid en icke-delande cell förblir livskraftig i den stationära fasen, en åldrande modell för postmitotiska celler som neuroner. Viabiliteten för åldrande jästceller under näringsberövade stationära fasförhållanden minskar, och de dör så småningom.

CLS har traditionellt mätts genom att uppskatta antalet kolonibildande enheter (CFU) på agarplattan [18]. Jästceller i en kolv med totalt medium (större än eller lika med 20 ml) exponeras för en enda kemisk förening. Vid olika tidpunkter (t.ex. efter 2, 5 och 8 dagar) serieutspäds små portioner av den kronologiska åldrande kulturen från fasken, ströks ut på näringsagarplattor och inkuberas i 2–3 dagar för kolonibildning och räkning. Överlevnadsfraktionen bestäms från CFU för varje kronologisk ålderspunkt i förhållande till dag 1 (anses som 100 procent cellöverlevnad). CFU-metoden är kvantitativ men förknippad med många nackdelar. Det kräver flera serieutspädningar, pläteringssteg och inkubationsperioder för att kolonierna ska visas. Koloniräkning utförs antingen med manuella eller dyra instrument. Dessutom är denna metod olämplig och alldeles för dyr för screening med hög genomströmning (HTS) av tusentals föreningar eftersom den kräver betydande mängder av de testade läkemedlen, kolvkulturer med stor volym och många agarplattor. Tyvärr är CFU-metoden och alla nyare varianter för att mäta CLS kritiskt beroende av förmågan hos de postmitotiska cellerna att återgå till den mitotiska fasen. I princip kan denna metod inte skilja jäst i mitotiskt arrest från döda celler.

Aktuella tekniska framsteg inom CFU-härledda metoder mäter cellöverlevnad och tillväxt baserat på utväxten av läkemedelsexponerad stationär fasjäst i näringsrik kultur antingen i ett flytande medium eller genom en spotting-analys på en agarplatta [17, 19–21] . Efter 24 timmar mäts utväxten av åldrade celler i flytande medium genom absorbansen vid OD600nm, medan i spotting-analysen, utväxten av fläckig åldrad kultur på agarmedium identifieras visuellt efter 48 timmar. Den logistiska förbättringen inkluderar användningen av 96-brunnsplattor som tillåter begränsad screening av kemisk eller genomomfattande raderingsstam. För poolade märkta jästdeletionsstammar krävs flödescytometri för att kvantifiera den individuella stammens livsduglighet [22].

Propidiumjodid (PI) är ett fluorescerande färgämne som bara kommer in i de döda cellerna och är således en kraftfull markör för direkt kvantifiering av cellviabilitet [23-25]. Tidigare har studier använt en PI-baserad metod för att mäta CLS och kvantifiera cellviabilitet genom att analysera bilderna som förvärvats av en fluorescerande cellräknare, UV-transilluminator eller flödescytometri [26, 27]. Emellertid är de flera provbearbetnings-, bildbehandlings- och mjukvarukraven för dataanalys dyra och tidskrävande, vilket hindrade dessa metoder i verkliga applikationer med hög genomströmning. Införandet av alternativa färgämnen som SYTOX grönt är av begränsat värde i en miljö med hög genomströmning på grund av de oöverkomliga kostnaderna [26].

Därför krävs nya metoder för att kvantifiera livsdugligheten hos den åldrade cellen för att undvika de begränsningar som är förknippade med befintliga metoder. I detta arbete beskriver vi PICLS, en PI-baserad CLS-mätmetod som är utväxtoberoende. Vårt nya tillvägagångssätt bygger på att inkubera jästceller med olika testföreningar eller olika testmediaförhållanden i 96-brunnsplattor. Vi använder PI för att kvantifiera cellöverlevnad. Snabb och effektiv avläsning (inom ~15 min) tillhandahålls av en mikroplattläsare, en billig enhet som är lätt tillgänglig i de flesta laboratorier. Denna billiga metod är väl lämpad för storskalig screening av de kemiska medlen för att identifiera anti-aging föreningar eftersom många olika föreningar, kontroller eller spädningar bekvämt kan placeras på en enda platta och ett stort antal plattor kan bearbetas parallellt. Dessutom validerade vi vår metod genom att bestämma förlängningen av CLS av jäst med hjälp av kända anti-aging-interventioner som rapamycinadministrering och kalorirestriktion. En snabb undersökning av tillgängliga kemikalier i vårt laboratorium avslöjade oväntat 2,5-anhydro-D-mannitol (2,5-AM) som förlänger jästens livslängd. Vi bekräftade också antiaging-aktiviteten hos 2,5-AM med traditionella utväxtmetoder. Andra testade sockeranaloger gav inte någon liknande effekt.

Resultat

Utveckling av en metod för kvantifiering av cellviabilitet med hjälp av propidiumjodidfluorescensmätning i mikroplattläsaren

Vårt nya protokoll börjar med att exponera vildtypsjästceller eller deras mutanter placerade i näringsrika medier i 96-brunnsplattor tillsammans med en specifik koncentration av kemiska föreningar av intresse. Vi använder PI som en markör för celldöd eftersom detta fluorescerande färgämne bara kommer in i icke-överlevande celler [23-25]. Cellviabiliteten i kulturen i stationär fas kvantifieras efter ett visst antal dagar genom att läsa av PI-fluorescensen i mikroplattläsaren som i sin tur ger ett elektroniskt läsbart kalkylblad för dataanalys.

Som en första validering visar vi att arbete med små mängder i mikroplattans brunnar ger resultat som liknar kyvettbaserade tillvägagångssätt och att mikroplattans läsare är tillräckligt känslig för att fånga cellöverlevnadsdata. Således analyserade vi PI-färgning av jästceller. Jästceller odlades i glaskolven och kokades i 15 minuter vid 100 grader. Levande och döda celler tvättades och inkuberades i 1 x PBS (fosfatbuffrad saltlösning) utan och med PI (5 µg/ml) under 15 minuter. Efter inkubation tvättades cellerna och återsuspenderades i PBS. Celler visualiserades med mikroskopi och fluorescensintensiteten mättes med mikroplattläsaren (tilläggsbild S1). Efter bekräftelse på att PI är en lämplig markör för celldöd, utfördes en efterföljande analys för att utveckla metoden. PI-färgade döda celler återsuspenderades i PBS till de slutliga 48 OD600nm mätt i kyvetten med användning av en spektrofotometer. Därefter serieutspäddes celler i PBS (OD600nm 48 till 0,05) och överfördes till en svart 96-brunnsplatta (costar 3603). För att notera, svarta mikroplattor är fyra gånger dyrare än klara plattor och mindre lättillgängliga, men vi använde dem eftersom de är mer lämpade för fluorescensavläsning på grund av dämpande autofluorescens som härrör från proverna och mikroplattytorna. Med ett GelDoc-avbildningssystem (Fig. 1A) visualiserade vi graden av inkorporering av PI-färgning i de döda jästcellerna vid olika utspädningar. Med samma platta mätte vi PI-fluorescensintensiteten med en mikroplattläsare vid excitation 535 nm och emission 617 nm våglängder. Vi hittade en hög linjär korrelation mellan PI-fluorescensintensitet och cellulär absorbans vid OD600nm (Fig. 1B). Detta resultat indikerar att vår variant av den PI-fluorescensbaserade metoden är effektiv för att kvantifiera cellviabilitet.

As a next step, we determined the optimal range of cell density (quantified by OD600nm) so that cell density could be directly measured in 96-well   plates instead of in cuvettes. Using the black microplates with dead yeast cells from the previous experiment, we determined the correlation of  OD600nm measurements taken from the cuvettes and from the microplate directly. We found a high linear correlation between the two series of measurements in the OD600nm range of 0.05 to 12 of the cuvette (Fig.  1C). However, the trend is no longer maintained for higher OD600nm values>12 av kyvetten (fig. ID). Därefter bestämde vi förhållandet mellan PI-fluorescensintensitet och cell OD600nm i 96-brunnsplattan inom det optimala OD600nm-intervallet 0,05–12. Vi observerar en nästan perfekt linjär korrelation (Fig. 1E). Således representerar vårt protokoll en robust metod för att kvantifiera cellviabilitet.

Effekt av mikroplatttyper på kvantifiering av cellviabilitet med propidiumjodidfluorescensmätning i mikroplattläsaren

Effekt av rapamycin på jästens kronologiska livslängd

Rapamycin är en av de välkända anti-aging-interventionerna som har visat sig förlänga livslängden för flera modellorganismer, inklusive jäst, nematoder, fruktflugor och möss [10, 14, 15, 28–30]. Det hämmar det näringsavkännande komplexet TORC1 (målet för rapamycinkomplex 1). TORC1 är ett konserverat multi-subunit proteinkomplex i eukaryota celler som kopplar näringsämnen i miljön med celltillväxt och proliferation [19, 29, 31-34].

Vi har undersökt effekten av rapamycin på den kronologiska livslängden (CLS) för jäststammen för att validera vårt nyutvecklade protokoll. Här och nedan använde vi den prototrofa jäststammen (CEN.PK113- 7D) i våra experiment för att undvika de starka effekterna av aminosyraauxotrofi på cellöverlevnad i stationär faskultur [35, 36]. Celler åldrades med olika koncentrationer av rapamycin i det syntetiskt definierade (SD) mediet. Celltillväxt mättes vid olika tidpunkter (24 timmar, 48 timmar och 72 timmar). Vi fann att celltillväxt nådde mättnad cirka 24 timmar efter inkubering med 5 nM eller mindre rapamycin (Fig. 4A). Administrationen av 10 nM rapamycin saktade dock celltillväxten och mättnad nåddes först efter 48 timmar (Fig. 4A). Tidigare observerades en liknande trend för celler som växer med rapamycin i ett CLS-experiment [37].

Som ett nästa steg mättes CLS för celler odlade i olika koncentrationer av rapamycin. Vi bestämde cellöverlevnaden med hjälp av PI-fluorescens vid olika kronologiska ålderstidpunkter. Tillväxttidpunkten 72 timmar ansågs vara dag 1. Vi kan dra slutsatsen från överlevnadsgrafen att olika koncentrationer av rapamycintillsats förlänger CLS för jäst (Fig. 4B). Överlevnaden av åldrade celler kompletterade med rapamycin (5 nM och 1 0 nM) på dag 4 var ~75 procent; men utan rapamycin var ~50 procent. På dag 7 var överlevnaden för rapamycin-kompletterade åldrade celler 70 procent; men utan rapamycin reducerades till mindre än 20 procent. CLS-förlängning av åldrade celler kan också observeras vid lägre koncentrationer (0,62–2,5 nM) av rapamycin (Fig. 4B).

Vi har validerat vårt protokoll genom att direkt jämföra det med två traditionella utväxtmetoder som mäter jästens CLS. För det första genomförde vi utväxtanalysen i det flytande mediet för att mäta effekten av rapamycin på livslängden. Överlevnaden av kronologiskt åldrande celler övervakades vid olika ålderspunkter genom att överföra en 3-µl kultur till 200μL YPD-medium i en ny 96-brunnsplatta. Utväxt motsvarar antalet livsdugliga celler i ympen (Fig. 4C). Åldrad cellutväxt registrerad via OD600nm-absorbans bestämdes med användning av en mikroplattläsare. Överlevnadsfraktionen beräknades från utväxt OD600nm-absorbansen för varje ålderspunkt i förhållande till dag 1 (ansett som 100 procent cellöverlevnad). Överlevnadsgrafen visas i fig. 4D.

På samma sätt genomförde vi utväxten genom spotting-analys på agarmediet. Vi såg 3-µl åldrande kultur på YPD-agarplattan och inkuberade den i 48 timmar. Utväxten av åldrade celler på YPD-agarplattan visualiserades av GelDoc-avbildningssystemet (Fig. 4E). Som förväntat kan vi observera trender för livslängdsförlängning av rapamycin under både YPD-vätske- och agarutväxtanalyser som är parallella med de som bestäms med vårt nya protokoll.

Dessa resultat visar att vårt HTS-protokoll reproducerar att rapamycin förlänger den cellulära livslängden. Dessutom bedömer vi Z-faktorn för att utvärdera kvaliteten på denna metod [38]. Generellt sett indikerar Z-faktorer i intervallet 0.5–1.0 utmärkta HTS-analyser. Z-faktorn bestämdes för olika koncentrationer av rapamycin med PI-fluorescens av åldrade celler (kompletterande Fig. S2). Vår finansiering, en Z-faktor {{10}}.70 för 5 nM rapamycin och 0.74 för 10 nM rapamycin, placerar denna HTS-metod i högkvalitetskategorin. Således är vårt protokoll tillräckligt robust för att identifiera potentiella anti-aging föreningar.

För att undersöka om metoden är effektiv i en annan genetisk bakgrund av jäst, testade vi effekten av rapamycin på CLS av BY4743-stammen. Saccharomyces cerevisiae BY4743-stam är auxotrof för histidin, leucin och uracil. BY4743-stammen odlades i olika koncentrationer av rapamycin i SD-mediet kompletterat med auxotrofa beståndsdelar. Överlevnad av åldrade celler kvantifierades med hjälp av PI-fluorescens (kompletterande Fig. S3). Vi fann att rapamycin ökade livsdugligheten för BY4743-celler kvantitativt på liknande sätt som för CEN.PK113-7D. Således visar dessa resultat att vår metod är effektiv i olika jäststammar.

Effekt av glukos på jästens kronologiska livslängd

Vi validerade också vår metod genom att undersöka effekten av kalorirestriktioner på jästens kronologiska livslängd. Kalorirestriktion är en av de etablerade interventionerna för att fördröja åldrandet och förlänga livslängden över modellorganismen, inklusive jäst- och däggdjursceller [11, 13, 16]. För att bestämma effekten av kalorirestriktion på jästens CLS minskar vi glukoshalten i odlingsmediet. Vi odlade cellen i tre olika SD-mediumförhållanden innehållande 0,25 procent, 0,5 procent och 2 procent glukos. Vi mätte celltillväxt vid olika tidpunkter (24 timmar, 48 timmar och 72 timmar). Alla kulturer nådde tillväxtmättnad efter 24 timmar (Fig. 5A). Celltillväxten var lägre vid 0,25 procent och 0,5 procent jämfört med 2 procent glukos (Fig. 5A). Vi mätte överlevnaden av kronologiskt åldrande för celler odlade under olika glukoskoncentrationer med hjälp av PI-fluorescensmetoden (Fig. 5B). Vi drar slutsatsen från överlevnadsgrafen att glukosrestriktion förlänger jästens CLS. Vi bekräftade också samtidigt förlängningen av CLS genom utväxtanalyser (fig. 5C, D och E), vilket ytterligare validerade vår nya metod för att bestämma jästens CLS. Effekten av glukosrestriktion på CLS-förlängningen av BY4743-stammen visades också med PICLS-metoden (tilläggsbild S3). Sålunda representerar vårt tillvägagångssätt för att mäta jästens CLS en ny, snabb och billig metod för att screena de kemiska medlen och odlingsförhållandena för att identifiera anti-aging-interventionerna.

Screening av de kemiska medlen med den nyutvecklade metoden identifierade 2,5-vattenfri-D-mannitol som en ny anti-åldrande förening

Efter att ha utvecklat och validerat det nya protokollet, använde vi denna metod för att screena hundratals kemiska medel för identifiering av anti-aging föreningar (kompletterande Fig. S4 och kompletterande tabell 1). Som ett av de överraskande resultaten hittade vi indikationer för föreningen 2,5-anhydro-D-mannitol (2,5-AM) för att förlänga jästens CLS. I Fig. 6 presenterar vi resultatet av detaljerade uppföljningsexperiment för denna förening. Vi testade antiåldrande aktivitet av 2,5-AM vid olika koncentrationer på 96-brunnsplattan. Först bestämde vi effekten av 2,5-AM på celltillväxt. Jästceller inkuberades med varierande koncentrationer av 2,5-AM i SD-mediet. Celltillväxt mättes vid olika tidpunkter (24 timmar, 48 timmar och 72 timmar). Vi fann att celltillväxt nådde samma mättnadsnivå efter 24 timmar för alla testade koncentrationer av 2,5-AM (Fig. 6A). Sedan mätte vi överlevnaden för kronologiskt åldrade celler kompletterade med olika koncentrationer av 2,5-AM med PI-fluorescensmetoden. Som tidigare ansågs 72-h tillväxtkulturen dag 1 för CLS-analysen. Överlevnadsgrafen är ritad för olika kronologiska ålderstidpunkter (Fig. 6B). Vi finner att 2,5-AM utökar CLS på ett koncentrationsberoende sätt. Överlevnaden för åldrade celler kompletterade med 2,5-AM (8 mM) på dag 4 var ~80 procent; men utan 2 var 5- AM ~ 50 procent . På dag 7 var överlevnaden för 2,5-AM kompletterade åldrade celler ~ 75 procent; men utan 2, 5-AM minskades till mindre än 20 procent . Antiåldringsaktiviteten hos 2,5-AM verifierades också med utväxtanalyser (Fig. 6C, D och E).

2,5-AM är en sockermolekyl som kan komma in i glykolysvägen. Det hydrolyseras endast vid uppströms glykolytiska steg som orsakar ackumulering av icke-metaboliserat 2,5-AM-1,6-bisfosfat (2,5-AMBP) i cellerna [39–41 ]. För att testa om 2,5-AM i koncentrationer som liknar CLS-experimentet har bearbetats av glykolysenzymer, undersökte vi den växande känsligheten hos SNF1-gendeletionsstammen. SNF1 är en cellulär energisensor och mycket konserverat AMP-aktiverat proteinkinas (AMPK) i eukaryoter [42, 43]. Jästceller som saknar AMPK-aktivitet är associerade med en överkänslig tillväxtfenotyp i närvaro av icke-metaboliserade glykolytiska intermediärer [44]. Vi mätte tillväxten av snf1Δ-deletionsstammen med olika koncentrationer av 2,5-AM. Vi fann att 2,5-AM hämmar tillväxten av snf1Δ-deletionsstammen jämfört med vildtypsstammen (tilläggsbild S5). Denna observerade tillväxtfenotyp indikerar att 2,5-AM genomgår glykolys och hydrolyseras till icke-metaboliserade glykolytiska intermediärer.

2,5-AM är en analog till sockerdelen fruktos [39]. För att klargöra om andra sockerarter också påverkar CLS, undersökte vi effekten av fruktos, mannitol och maltos på jäståldring. Vi inkluderade också sorbitol som är ett icke-metaboliserat socker som rapporterats öka CLS av jästceller genom att öka osmolariteten hos odlingsmediet [20, 45]. För det första testade vi effekten av fruktos, mannitol, maltos och sorbitol på celltillväxt. Jästceller inkuberades med olika koncentrationer av fruktos, mannitol, maltos och sorbitol liknande 2,5-AM i SD-mediet. Liksom 2, 5-AM, fruktos, mannitol, maltos och sorbitol inkuberade celler nådde tillväxtmättnad efter 24 timmar (Fig. 7A). Därefter mätte vi överlevnaden av kronologiskt åldrade celler på dag 1, dag 7, dag 14 och dag 21. Till skillnad från 2, 5-AM, förlängde inte tillskott av fruktos, mannitol, maltos och sorbitol livslängden för jäst (fig. 7B, C, D, E och kompletterande fig. S6). Anmärkningsvärt nog förlänger 2,5-AM livslängden även i det sena skedet av kronologisk åldrande. Åldrade celler kompletterade med 2,5-AM (8 mM) överlever (~65 procent) på dag 21. Överlevnaden för åldrade celler utan 2,5-AM-tillskott var dock mindre än 10 procent.

Mycket till vår förvåning fann vi att sorbitol vid låga koncentrationer som testats inte kan öka CLS (Fig. 7B, C, D, E och Kompletterande Fig. S6). Vi antog att högre sorbitolkoncentrationer kan krävas för att öka CLS. Vi testade en rad högre koncentrationer inklusive 1 M sorbitol, den koncentration som tidigare rapporterats påverka CLS (18 procent motsvarande 1 M) [20, 45]. I överensstämmelse med tidigare rapporter finner vi också att mycket höga sorbitolkoncentrationer (mellan 0,5 och 1 M) ökar CLS för jäst (Supplementary Fig. S7), uppenbarligen genom att öka mediets osmolaritet. Intressant nog tyder CLS-ökningen med 2,5-AM vid en mycket låg koncentration (2 mM) på att dess mekanism för antiåldrande aktivitet skiljer sig från den osmotiska. Dessa resultat tyder på att anti-aging-aktiviteten hos 2,5-AM är specifik för denna sockerförening och inte observeras för flera andra, liknande strukturerade kemikalier.

【För mer information: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】