RNA M6 A-läsaren YTHDF2 kontrollerar NK-cells antitumör och antiviral immunitet del 2

YTHDF2 krävs för den antivirala funktionen hos NK-celler

För att avgöra om Ythdf2-brist påverkar antiviralaktiviteten hos NK-celler, injicerade vi 2,5 × 104 PFU av MCMV i Ythdf2WT-möss och Ythdf2ΔNK-möss.

Resultaten visade att Ythdf2ΔNK-möss var mer mottagliga för MCMV-infektion, vilket framgår av signifikant viktminskning och ökade virala titrar i blodet, mjälten och levern jämfört med Ythdf2WT-möss (Fig. 3, A och B; och Fig. S2, A och B) .

Vi observerade också en signifikant minskning av procentandelen och det absoluta antalet totala NK-celler i mjälten och blodet hos Ythdf2ΔNK-möss jämfört med de i Ythdf2WT-möss efter infektion (Fig. 3, C och D; och Fig. S2, C och D). Ytterligare analys visade att NK-celler från Ythdf2ΔNK-möss hade signifikant lägre uttryck av Ki67 än Ythdf2WT-möss (Fig. 3, E-G).

Men NK-cellviabiliteten var likartad mellan Ythdf2WT-möss och Ythdf2ΔNK-möss, vilket visas av annexin V-färgning (Fig. S2 E). Dessa data indikerar att bristen på YTHDF2 i NK-celler resulterar i en defekt i cellproliferation snarare än cellöverlevnad under virusinfektion. NK-celler hämmar MCMV-infektion genom de aktiverande receptorernaLy49H och Ly49D, och processen kännetecknas av ett perforin- eller IFN-medierat antiviralt svar (Arase et al., 2002; Lee et al., 2009; Loh et al., 2005; Orr et al., 2010; Sumaria et al., 2009).

Vi fann att Ythdf2ΔNK-möss signifikant minskade Ly49H+ och Ly49D+ NK-celler i mjälten och blodet jämfört med Ythdf2WT-möss efter infektion (Fig. 3, H-J; och Fig. S2, F-K).

Ytterligare analys visade att även om per procent endast Ly49D+Ly49H+-celler uppvisade en skillnad i Ythdf2ΔNK-möss jämfört med den för Ythdf2WT-möss, så visade det absoluta cellantalet för Ly49D−Ly49H+ NK-celler, Ly49D+Ly49H−49H+-celler i Ly49D- och LyNK-celler, och mjälte och blod minskade alla signifikant i Ythdf2ΔNK-möss jämfört med Ythdf2WT-möss efter infektion (Fig. S2, L-W).

Våra data tyder på att kontroll av MCMV-infektion av YTHDF2 främst verkar förmedlas av Ly49D+Ly49H+ NK-celler. Granzym B- och IFN-produktionen av NK-celler i Ythdf2ΔNK-möss var jämförbar med den för Ythdf2WT-möss (Fig. S2, X och Y).

Vi fann signifikant minskad perforinproduktion av Ythdf2ΔNK-möss jämfört med den för Ythdf2WT-möss i både mjälte och blod 7 dagar efter infektion (Fig. 3, K–M), vilket indikerar att YTHDF2 huvudsakligen påverkar sperforinmedierad antiviral aktivitet mot MCMV i NK-celler. tyder på att YTHDF2 är avgörande för NK-cellexpansion och effektorfunktion under MCMV-infektion.

YTHDF2 kontrollerar NK-cellshomeostas och terminal mognad i ett stabilt tillstånd

Ovanstående fynd att Ythdf2-brist i NK-celler förstärkte tumörmetastaser och försämrad NK-cellkapacitet för att kontrollera MCMV-infektion uppmuntrade oss att undersöka om YTHDF2 krävs för NK-cellsupprätthållande vid ett stabilt tillstånd.

Såsom visas i Fig. 4A, reducerades frekvensen och det absoluta antalet NK-celler signifikant i det perifera blodet, mjälten, levern och lungorna men inte i benmärgen (BM) hos Ythdf2ΔNK-möss jämfört med Ythdf2WT-möss.

Det fanns dock inga signifikanta förändringar bland vanliga lymfoida stamceller, pre-NK cell progenitor och raffinerad NK cell progenitor (NKP) i BM (Fathman et al., 2011) mellan Ythdf2WT och Ythdf2ΔNK möss (Fig. S3 A), vilket indikerar att YTHDF2 kanske inte påverkar NK-cells tidiga utveckling i vår modell.

För att undersöka de potentiella mekanismerna som är ansvariga för minskningen av NK-celler i Ythdf2ΔNK-möss, undersökte vi cellproliferation, viabilitet och handelsförmåga hos NK-celler efter Ythdf2-deletion i ett stabilt tillstånd. Andelen prolifererande NK-celler var jämförbar mellan Ythdf2WT- och Ythdf2ΔNK-möss, vilket framgår av Ki67-färgning (Fig. S3 B).

Viabiliteten av NKcells var också ekvivalent mellan Ythdf2WT och Ythdf2ΔNK möss, vilket visas av annexin V-färgning (Fig. S3 C). För att kontrollera om YTHDF2 påverkar utträdet av NK-celler från BM till periferin, injicerades Ythdf2WT- och Ythdf2ΔNK-möss iv med en antiCD45-antikropp för att markera immunceller och avlivades efter 2 minuter, och deras BM-celler analyserades.

Detta gjorde det möjligt för oss att kvantifiera antalet NK-celler i de sinusformade kontra parenkymala regionerna i BM, en indikator på NK-cellshandel från BM till perifert blod under ett steady state (Leong et al., 2015). Resultaten visade en signifikant minskning av frekvensen av CD45+ NK-celler i Ythdf2ΔNK-möss jämfört med Ythdf2WT-möss i sinusoiderna (Fig. 4 B), vilket indikerar att Ythdf2-brist försämrar utträdet av NK-celler från BM till cirkulationssystemet in vivo .

Immunceller genomgår homeostatisk proliferation under lymfopeni inducerad av vissa virusinfektioner eller orsakad av kemoterapi (Sun et al., 2011). Även om vi fann att YTHDF2 är oumbärlig för NK-cellproliferation vid ett steadystate, observerade vi en signifikant minskning av cellproliferation under MCMV-infektion (Fig. 3, E-G). Vi undersökte därför rollen av YTHDF2 för att reglera NK-cells homeostatisk proliferation i en lymfopenisk miljö in vivo.

Vi samöverförde ett lika stort antal mjält-NK-celler från CD45.2 Ythdf2ΔNK-möss eller CD45.1-kongena möss med intolymfocytbrist Rag2-/-Il2rg-/- möss. Resultaten visade att en större andel NK-celler härrörde från CD45.1WT-kontrollmöss än från CD45.2 Ythdf2ΔNK-möss på dag 3 efter cellöverföring (Fig. S3 D).

Ytterligare analys visade att minskningen av NK-celler från Ythdf2ΔNK-möss berodde på nedsatt cellproliferation (Fig. S3 E) men inte cellapoptos (Fig. S3 F), vilket tyder på att YTHDF2 driver NK-cells homeostatisk proliferation in vivo under lymfopena förhållanden.

Ytterligare differentiering av murina NK-celler kan klassificeras i omogna (CD11b−CD27+), mellanmogna (CD11b+CD27+), och terminalmogna (CD11b+CD27−) stadier baserat på CD11b- och CD27-nivåer ( Chiossone et al., 2009; Geiger och Sun, 2016).

Vi fann att Ythdf2-uttryck ökade med mognad och att CD11b−CD27+, CD11b+CD27+, CD11b+CD27− visade lägsta, mellanliggande och högsta uttrycksnivåer av Ythdf2, respektive (Fig. S3 G), vilket indikerar att YTHDF2 kan vara involverad i NK-cellmognad. Vi undersökte därför rollen för YTHDF2 i NK-cellmognad definierad av cellytmarkörerna CD11b och CD27.

Vi fann att förlust av Ythdf2 i NK-celler resulterade i en signifikant minskning av frekvensen av terminala mogna NK-celler och/eller en ökning av omogna och medelmogna NK-celler i mjälten, levern, lungan och blodet men inte i BM (Fig. 4 C och Fig. S3 H), vilket indikerar att YTHDF2 positivt reglerar terminal NK-cellmognad. I enlighet med dessa data var nivåerna av KLRG1, som är en terminal NK-cellmognadsmarkör, signifikant lägre i Ythdf2ΔNK-möss i mjälten, levern och lungan men inte BM jämfört med det för Ythdf2WT-möss i motsvarande organ eller vävnadsavdelningar (Fig. 4 D).

För att avgöra om det minskade antalet mogna NK-celler av Ythdf2-brist är cell inneboende, skapade vi chimärer i Rag2−/−Il2rg−/− möss genom att injicera BM-celler från CD45.1 WT och CD45.2 Ythdf2ΔNK möss, blandade i en 1:1 förhållande. Som framgår av flödescytometri vid 8 veckor efter transplantation härleddes en minskad andel terminala mogna NK-celler från CD45.2 Ythdf2ΔNK BM-celler än de från CD45.1 WT-kontrollceller (Fig. 4 E), vilket tyder på att NK-cellterminalmognad kontrolleras av YTHDF2 är cellinneboende.

T-box transkriptionsfaktorer Eomes och Tbet är kritiska för NKcellmognad (Daussy et al., 2014; Gordon et al., 2012). Intracellulär färgning avslöjade en signifikant minskning av proteinnivåerna av Eomes i NK-celler från Ythdf2ΔNK-möss jämfört med Ythdf2WT-möss (Fig. S3 I). Dessutom fann vi att minskningen av protein- och mRNA-nivåer av Eomer specifikt inträffade i terminala mogna (CD11b + CD27-) NK-celler (Fig. S3, J-L).

Men i motsats till Eomes var uttrycket av Tbet likvärdigt i NK-celler mellan Ythdf2ΔNK och Ythdf2WT-möss (Fig. S3, I och K), vilket indikerar att YTHDF2 möjligen reglerar NKcell-terminalmognad genom att rikta in sig på Eomes.