Theaflavin-reglerade Imd Condensates Control Drosophila Intestinal Homeostas and Aging

Vänligen kontaktaoscar.xiao@wecistanche.comför mer information

SAMMANFATTNING

Svart te är den mest konsumerade tedrycken i världen och har konsekvent rapporterats ha anti-aging fördelar. Huruvida teaflaviner, en typ av de karakteristiska fytokemikalierna i svart teextrakt, är inblandade i att reglera åldrande och livslängd hos konsumenter är dock i stort sett okänt. I den här studien visar vi att theaflaviner spelar en fördelaktig roll för att förhindra åldersdebut i tarmläckage och dysbios, vilket fördröjer åldrande i Drosophila. Mekanistiskt reglerar teaflaviner kondensataggregatet av Imd för att negativt styra överaktiveringen av Imd-signaler i fruktflugans tarmar. Dessutom förhindrar teaflaviner DSS-inducerad kolit hos möss, vilket tyder på att teaflaviner spelar en roll för att modulera tarmens integritet. Sammantaget avslöjar vår studie en molekylär mekanism genom vilken teaflaviner reglerar tarmhomeostas sannolikt genom att kontrollera Imd-koalescens.

Klicka här för att veta mer

INTRODUKTION

Åldrande, som kännetecknas av en nedgång i fysiologiska funktioner i individuella organsystem och en ökande risk för sjukdom och död, innebär ackumulering av skador på molekyler, celler och vävnader (Alavez et al., 2011; Bartke et al., 2019; Engeet al., 2017). Identifieringen av funktionella material eller kemikalier som förhindrar biologisk försämring för att fördröja åldringsprocessen och förlänga livslängden är utan tvekan avgörande (Bar-ardo et al., 2017; Kapahi et al., 2017). Tidigare studier har rapporterat att svart te, det mest konsumerade teet i världen, har betydande aktiviteter som fördröjer åldrandet (Cameron et al., 2008; Fei et al., 2017; Kumar och Rizvi, 2017; Naumovski et al., 2019 ; Peng et al., 2009; Xiao et al., 2020). Kosttillskott med extrakten av svart te förlänger effektivt livslängden för försöksdjur som maskar (Feet al., 2017), fruktflugor (Peng et al., 2009; Site al., 2011), möss (Site al., 2011). ; Xiao et al., 2020) och råttor (Kumar och Rizvi, 2017).

Det är välkänt att svart te-extrakt huvudsakligen innehåller två typer av fytokemikalier, nämligen katekiner och teaflaviner (TF) (Cameron et al., 2008; Kondo et al., 2019; Li et al., 2013), varav den senare produceras från katekiner av endogent polyfenoloxidas och peroxidas under oxidationsprocessen vid produktion av svart te (Li et al., 2013). En serie studier har identifierat katekinernas antiåldrande roll genom att förbättra oxidativ stress och åldersrelaterad inflammation och minska vävnadsskador (Cameron et al., 2008; Niu et al., 2013; Peng et al., 2009; Si et al. .2011; Waaner et al., 2015). Funktionella studier av TF:ers bidrag till åldrandet har dock släpat efter dem på katekiner, eftersom det är svårt att extrahera tillräckliga mängder TF:er från svarta teblad för medicinska studier (Takemoto och Takemoto, 2018). Nyligen har flera biosyntetiska metoder utvecklats för massproduktion av TF: er (Takemoto och Takemoto, 2018), vilket gör det möjligt att utforska de exakta biologiska effekterna av TF: er och de underliggande regleringsmekanismerna.

Nyligen har ökande uppsättningar data belyst tarmarnas centrala roller i åldrande och livslängdsmodulering (Guo et al., 2014; Jji et al., 2019; Maynard och Weinkove, 2018; Rothenberg och Zhang, 2019; Salazar et al. ,2018). Det intestinala epitelet, som fungerar som en selektiv barriär, tillåter absorption av näringsämnen, joner och vatten och begränsar värdkontakt med skadliga enheter, inklusive mikroorganismer, dietantigener och miljögifter (Capo et al., 2019; Nicholson et al. , 2012; Ryu et al., 2010). Som en högomsättningsvävnad hos individer ger tarmkanalen den bästa livsmiljön för symbiotiska mikroorganismer, inklusive naturliga anaeroba förhållanden, rikligt med näringsämnen och en lämplig temperatur och pH

Figur 1. Theaflaviner förlänger Drosophilas livslängd och förbättrar klättringsförmågan

(A och B) Fruktflugor av honkön odlades med standardmat som kompletterades med 1 mg/ml eller 2,5 mg/ml teaflaviner (TF) eller utan TF:er som basal. Flugor överfördes till färska flaskor innehållande nya medier varannan dag, och döda flugor har fått poäng under hela den vuxna livslängden. Överlevnadskurvor (A) och medellivslängd (B) för honflugor analyserades och visades.

(Cand D) Honan w18 matades med standardfoder från Drosophila (referens Basal) eller med livsmedel kompletterade med 1 mg/ml respektive 2,5 mg/ETF. Sex oberoende grupper av flugor vid de angivna åldrarna (10 dagar, 30 dagar, 40 dagar respektive 50 dagar) utsattes för kafé(C)- och Fluorescein-matningsanalyser (D). värde, bildar nischer som upptas av specifika bakteriearter i kroppen (Bonfini et al., 2016; Buchon et al., 2013; Nicholson et al., 2012). Under tiden påverkar dessa symbiotiska mikroorganismer och deras metaboliter också direkt eller indirekt näringsbearbetning; matsmältning och absorption; Energi balans; immun funktion; gastrointestinal utveckling och mognad; och många andra viktiga fysiologiska aktiviteter (Bonfini et al., 2016; Broderick, 2016; Maynard och VVeinkove, 2018; Nicholson et al., 2012). Det ömsesidigt fördelaktiga förhållandet mellan de två symbionterna kan upprätthålla stabiliteten och dynamiska balansen i det intestinala mikroekosystemet (Bonfini et al., 2016; Brodeerick, 2016; Broderick et al., 2014; Guo et., 2014; May-nard och Weinkove, 2018; Nicholson et al., 2012).

cistanche kan anti-aging

En serie studier har visat att det medfödda immunsvaret är avgörande för att upprätthålla tarmmikrobiotahomeostas och bevaras från ryggradslösa djur till ryggradsdjur (Guillouet al., 2016; Guo et al., 2014; Ryu et al., 2006, 2010; Vijay- Kumar et al., 2010). I Drosophila är två viktiga signalvägar, nämligen vägarna för Toll och immunbrist (Imd), involverade i de medfödda immunsvaren (Lu et al., 2020; Myllymakiet al., 2014; Valanne et al., 2011). Noterbart är att Drosophila Toll-vägen delar likheter med interleukin-1-receptorn från däggdjur (IL-1R) och MyD88-beroende Toll-like receptor (TLR), medan Imd-vägen är liknande till tumörnekrosfaktorreceptorn (TNFR)-vägen och den TRIF-beroende TLR-vägen hos däggdjur (Imler, 2014; Myllymaki et al., 2014; Valanne et al., 2011). Dessa två vägar kontrollerar uttrycket av antimikrobiella peptider (AMP) genom aktivering av NF-KB-transkriptionsfaktorer (Imler, 2014; Myllymaki et al., 2014; Valanne et al., 2011).bioflavonoiderImd-signalvägen aktiveras normalt av gramnegativ bakterieinfektion och resulterar i uttryck av en annan uppsättning AMP, såsom Attacin, Cecropin och Diptericin (Kleino och Silverman, 2014; Myllymaki et al., 2014). Uttryck av dessa AMP kräver peptidoglykanigenkänningsprotein (PGRP)-LC-receptorn i Imd-vägen och den signalberoende klyvningen och nukleära translokationen av Relish, en transkriptionsfaktor för NF-kB-familjen (Kleino och Silverman, 2014; Myllymaki et al., 2014). En nyligen genomförd studie visade att amyloidbildning krävs för aktivering av Drosophila Imd-vägen vid igenkänning av bakteriella peptidoglykaner (Kleino et al., 2017). Huruvida detta Imd-kondensat är involverat i andra biologiska processer, såsom underhåll av tarmhomeostas och åldrandereglering, är dock i stort sett okänt.

I den aktuella studien använde vi fruktflugor och möss som djurmodeller för att undersöka rollerna för TF: er för att kontrollera tarmens integritet och åldrande. Vi visade att TF: er fördröjer den åldersdebuterande överproliferationen av intestinala stamceller, skyddar mot dysbios av tarmmikrobiomet och förhindrar aktivering av Imd-signalvägen, vilket förlänger livslängden i Drosophila. Ytterligare mekanistiska studier indikerade att TFs negativt bidrar till Imd-signalering kan vara genom att blockera kondensering av Imd snarare än dess ubiquitinering. Dessutom fann vi att TF: er är mycket effektiva för att förhindra DSS-inducerad kolit hos möss. Sammantaget avslöjar våra fynd en potentiell roll för TF: er för att modulera Imd-beteende, vilket kan vara nyckelfaktorn i deras positiva bidrag till intestinal homeostas och livslängdsförlängning.

RESULTAT

Kosttillskott av teaflaviner förlänger Drosophilas livslängd

För att undersöka om theaflaviner (TF) påverkar åldrande och livslängd i Drosophila, föd vi upp kvinnliga w'118 flugor med standardfoder som kompletterades med 1 mg/ml eller 2,5 mg/ml TFs och utförde livslängdsanalyser som tidigare beskrivits (Ji et al. ., 2019). Flugor som fick en diet kompletterad med en lika stor volym av TFs lösningsmedel (H2O) ansågs som kontroller. Som visas i figur 1A förlängde kosttillskott av en relativt låg koncentration av TFs (1 mg/ml) fruktflugans livslängd något, och en hög koncentration av TFs (2,5 mg/ml) hade en signifikant positiv effekt på livslängden. Noterbart resulterade långvarigt upptag av höga koncentrationer av TF: er (2,5 mg/ml) i cirka 8 dagars höjning av medellivslängden för kvinnliga flugor (Figur 1B), vilket tyder på en fördelaktig roll för TFsin för att reglera livslängden i Drosophila. Liknande resultat erhölls när vi testade de potentiella effekterna av ytterligare TF: er på livslängden för manliga w'*'''8 flugor (figurerna S1A och S1B).

Figur 2. Theaflaviner förhindrar åldersdebut i tarmdysfunktion och mikrobiota dysbios i Drosophila

(A och B) Förlust av intestinal integritet analyserades av Smurftest vid åldrarna 10 dagar, 30 dagar, 40 dagar och 50 dagar av kvinnliga w18 vuxna. Exempel på icke-smurf och smurf visades i (A). Procentandelar av Smurf i olika indikerade grupper analyserades och visades i (B).

(C) Bakteriella överflöd som sparats av qPCR av 16S rRNA-genen i kvinnliga w18-filer från olika indikerade grupper analyserades och visades.

(DF) Sekvensering av den kommensala bakteriella 16S rRNA-genen utfördes. Proportionerna av bakteriella taxa (D), en värmekarta över de viktigaste mikrobiella taxa (F) och den relativa förekomsten av Gammaproteobacteria (F) analyserades och presenterades.

Figur 2. Fortsättning

(G och H) Tarmar dissekerades från de indikerade honflugorna som matades med 2,5 mg/ml TFs eller utan TFs som kontroll vid 10 dagars och 40 dagars ålder. Bilder av mellantarmsobjektglas togs med fluorescensmikroskopi för GFP-signaler (G). Statistisk analys som visar procentandelen av GFP-positiva celler visas i (H).

(I) Tarmar från de angivna flugorna samlades in och utsattes för immunfärgningsanalyser med användning av antikroppar mot fosforylerad Histon 3(pH3). Statistiska resultat som kvantifierar pH-3-positiva celler per tarm analyserades och visades. I B, C, H och, analyseras data med det tvåsidiga studenttestet och visas som medelvärden ± SEM.NS, inte signifikant,*p<><0.001. see="" also="" figure="">

ETF:er har varit kända för att ha en bitter smak, och bitter mat undviks vanligtvis av både konsumenter inklusive fruktflugor och däggdjur (Yamazaki et al., 2014; Yang et al., 2018). Vi försökte sedan klarlägga om TF: er kan påverka Drosophila födointag, eftersom tidigare studier har visat att dietrestriktioner leder till förlängd livslängd både hos ryggradsdjur och ryggradslösa djur (Hudry et al., 2019; Kapahi et al., 2017; Moger-Reischer et al. ., 2020). För att göra detta utförde vi först caféanalysen, ett allmänt använt tillvägagångssätt för att direkt och exakt mäta matningshastigheten genom att använda en kapillärmatare som innehåller ett flytande medium, som tidigare beskrivits (Ja et al., 2007). Som visas i figurerna 1C och S1C förändrade kosttillskott av TF: er (1 mg/ml respektive 2,5 mg/ml) knappast matkonsumtionen för testade flugor. För att ytterligare bekräfta detta använde vi sedan Fluorescein som ett spårämne för mat (Rera et al., 2012; Wang et al., 2005) och utförde en naturlig matningsanalys (Danilov et al., 2015). Som visas i figurerna 1D och S1D, kunde vi inte observera några korrelationer mellan TFs-tillskott och nivåer av matintag. Sammantaget antydde våra resultat att de fördelaktiga rollerna för TF: er för att förlänga livslängden kanske inte beror på dietrestriktioner hos Drosophila.

Ytterligare TF: er är nödvändiga för att påverka Drosophila energihomeostas

Det har föreslagits att polyfenoler i svart te utövar en positiv effekt på att förebygga fetma genom att hämma lipid- och sackaridsmältning, absorption och intag, vilket minskar kaloriintaget (Cameron et al., 2008). Vi försökte sedan klarlägga om TFs-reglerad LDrosophila livslängdsförlängning beror på förändringar i näringsabsorption och energilagring. För att göra detta undersökte vi först nivåerna av triacylglycerid (TAG), en av de vanligaste detekterade lipidmetaboliterna (Tennessen et al., 2014), i honflugor under hela deras liv som tidigare beskrivits (Fan et al., 2017).köpa cistancheSom visas i figur 1E, påverkade behandling av TF: er knappast övergripande TAG-förekomster vid olika ålderspunkter. När vi ytterligare upptäckte glykogeninnehåll och kvantifierade cirkulerande kolhydrater (glukos och trehalos) med Hexokinase-kitet (Li et al., 2018; Ten-nessen et al., 2014), visade resultaten att det inte fanns några uppenbara förändringar mellan prover med eller utan TFs-behandling (figur 1F-1H). Att notera erhölls konsekventa resultat när vi undersökte metaboliska fenotyper med användning av manlig w118 som djurmodeller (figurerna S1E-S1H). Sammantaget antydde dessa data att kosttillskott av TF: er är oumbärlig för reglering av kolhydrat- och energihomeostas under Drosophilas livslängd.

Vi undersökte vidare kinetiken för den naturliga senescensen av Drosophila under dietära TFs-interventioner genom att utföra snabba iterativa negativa geotaxi-tester (RING) som tidigare beskrivits (Dilliane et al., 2017; Staats et al., 2018). Som visas i figurerna 1l, 1J, S1l och S1J förbättrades klättringsindexen för åldrade (40 dagar) w1118 (både kvinnor och män) i TFs-tillskottsgrupper markant (en nästan 12 procents ökning hos kvinnor och nästan 18 procents höjning hos män ) jämfört med kontrollgrupper, vilket tyder på att TF: er potentiellt förbättrar Drosophila-klättring och rörelseaktiviteter.

Theaflaviner förhindrar åldersdebut i tarmläckage och mikrobiota dysbios

Tidigare studier har visat att fruktflugans rörelseaktivitet och livslängd är starkt relaterade till värdens hälsotillstånd, såsom kön, kost, ålder och genotyp (Caruso et al., 2013; Heintz och Mair, 2014). Nyligen har flera bevis visat att bevarande av intestinal Imd-signalering homeostas förbättrar tarmens integritet genom att förhindra överproliferation av ISC och prekursorceller och genom att fördröja åldersdebuterande tarmepitel dysfunktion, vilket i sin tur positivt bidrar till organismhälsa (Clark et al. , 2015; Guo et al., 2014). Hos Drosophila är en förkortad livslängd nära förknippad med dysfunktion av den intestinala epitelbarriären, och utvecklingen av denna barriärs integritet under åldrandet resulterar i förlängning av livslängden (Clark et al., 2015; Guoet al., 2014; Jet al., 2019). Således försökte vi avgöra om TFs ändrar integriteten hos tarmen genom att utföra Smurf-analysen, en metod som har beskrivits tidigare (Clark et al., 2015; Rera et al., 2011). Som visas i figur 2A, kallades de testade fruktflugorna i vilka blå färgämnen var begränsade till matsmältningskanalen som icke-smurf (vänster panel i figur 2A). Om blå färgämnen observerades

Figur 3. Fortsättning

(EG) Tarmar isolerades från kvinnliga w1118-filer matade med 2,5 mg/ml TF: er eller utan TF:er som basal vid 10 dagar, 30 dagar, 40 dagar respektive 50 dagar gamla. Totalt RNA extraherades och utsattes för aRT-PCR-analyser. mRNA-expressionsnivåerna för diptericin (F), attacin (F) och cecropin A1(G) analyserades och visades. I EG analyseras data med det tvåsidiga Students t-test och visas som medelvärden ± SEM.NS, inte signifikant, *p<><><0.001. see="" also="" figure="">

läcker ut från tarmarna in i buken, värdarna räknades som smurf (höger panel i figur 2A). I överensstämmelse med tidigare fynd (Clark et al.,2015), ökade proportionerna av Smurf gradvis under åldrandet (Figur 2B). Intressant nog minskade andelen smurfvuxna kraftigt i de grupper som matades med TFs jämfört med de åldersmatchade kontrollerna hos båda kvinnorna (från 8,2 procent till 3,7 procent, från 19,4 procent till 15,6 procent och från 35,4 procent till 27,1 procent för grupperna vid åldrarna 30 dagar, 40 dagar respektive 50 dagar, figur 2B) och vuxna män (från 2,7 procent till 0,9 procent, från 6,9 procent till 0,9 procent och från 8,3 procent till 2,7 procent vid 30 års ålder dagar, 40 dagar respektive 50 dagar, figur S2A), vilket indikerar att TF: er kan förhindra tarmbarriärdysfunktion hos åldrade fruktflugor. Det bör noteras att vi observerade större minskningar av Smurfprocenten hos män (minskade med nästan 65,8 procent , 86,9 procent och 67,4 procent vid åldrarna 30 dagar, 40 dagar respektive 50 dagar) än de i åldern -matchade honor (minskade med nästan 54,1 procent, 19,5 procent och 23,3 procent vid åldrarna 30 dagar, 40 dagar respektive 50 dagar), vilket antyder att TF:er kan spela en bättre roll för att minska tarmläckaget hos hanflugor.

Tidigare studier har föreslagit att åldersdebut i tarmbarriärdysfunktion ofta är korrelerad med dysbios i tarmmikrobiotan (Clark et al., 2015; Guo et al., 2014). Således undersökte vi den intestinala kommensala bakteriella sammansättningen efter TFs-tillskott. Vi använde först universella primrar och utförde kvantitativa PCR-experiment för att kvantifiera de bakteriella 16S rRNA-gennivåerna. Som visas i figur 2C visade den totala bakteriepopulationen från TF:s interventionsgrupper en slående minskning (nästan 45 procent -55 procent) jämfört med kontrollerna, vilket tyder på att tillskott av TF:er troligen förhindrar mikrobiotanexpansion under åldrandet . Sedan utförde vi metagenomi för att i detalj undersöka förändringarna i det mikrobiella samhället i tarmen orsakade av kosttillskott med TF: er. Som visas i figur 2D-2F minskade uppenbarligen andelen gammaproteobakterier, vars expansion visade sig vara nära förknippad med tarmbarriärsvikt (Clark et al., 2015), uppenbarligen av TFs-tillskott i åldrade tarmar ( en nästan 7 procents minskning), vilket antyder att TFs positivt bidrar till homeostasen av tarmmikrobiotan under åldrandet i Drosophila.

Theaflaviner förbättrar intestinal proliferativ homeostas i Drosophila

We further examined the intestinal integrity of flies that were treated with or without TFs. First, we employed the widely-used P{Esg-Gal4}/P{Uasp-GFP};{Tub-Gal80*s}strain(referred to as esgts>GFP), där tarmstamcellerna (ISC) och progenitorcellerna märktes med GFP. Som visas i figurerna 2G och 2H var antalet GFP-positiva celler i TFs interventionsgrupper vid 40 dagars ålder (20 tarmar räknades) mycket mindre (nästan 29,7 procent) än i de åldersmatchade kontrollerna (nästan 47,6 procent och 19 tarmar räknades), vilket tyder på att TF: er kan hämma den åldersdebuterade överproliferationen av ISC: er. Vidare utförde vi immunfärgningsexperiment med användning av antikroppar mot Phospho-Histone 3(pH3), en specifik markör för mitotiska celler i tarmvävnad. Vi observerade färre pH-3-positiva celler i tarmen från åldrade TFs-kompletterade vuxna (medeltalet var 20,6) än hos kontrollerna (medeltalet var 39,5, figur 2). Sammantaget tyder våra resultat på att kosttillskott med TF: er förbättrar intestinal proliferativ homeostas och förhindrar åldersdebut av mikrobiotadysplasi, vilket fördröjer åldrandet hos Drosophila.

Theaflaviner modulerar negativt intestinala Imd-signaler

För att utforska de underliggande molekylära mekanismerna genom vilka TFs positivt bidrar till Drosophila-tarmhomeostas, utförde vi RNA-seq-analys med användning av åldersmatchade tarmprover från kvinnliga w1118-vuxna som behandlats med eller utan TFs. Fragment per kilobas per miljon (FPKM) analyser antydde att de övergripande genuttrycksmönstren var likartade mellan de två experimentella grupperna (Figur 3A). Ytterligare differentiell expressionsanalys identifierade emellertid totalt 229 differentiellt uttryckta gener, varav 99 var uppreglerade och 126 var nedreglerade (Figur 3B). Intressant nog visade genontologianalys av dessa gener att immunsvarsvägen förändrades kraftigt av kosttillskott med TF: er (Figur 3C).

I Drosophila har medfödda immunsignalvägar visat sig spela en dominerande roll för att reglera åldersdebut i tarmhomeostas och livslängd (Clark et al, 2015; Guo et al, 2014). Vi fokuserade sedan på att undersöka uttrycksmönstren för de antimikrobiella peptiderna (AMP) nedströms de medfödda immunsignalerna. Som visat

Figur 4. Fortsättning

(D) Renade Imd-proteiner inkuberades med olika koncentrationer av TFs (50 uM, 100 uM respektive 200 uM) vid rumstemperatur under 5 minuter. Prover utsattes sedan för fluorescensemissionsspektrumanalys med användning av de angivna våglängderna (excitation vid 430 nm, emission från 450 nm till 550 nm med en slitsbredd på 5 nm). Ett prov utan TF användes som baslinjekontroll.

（E and F）Lysates of guts from NP11>Myc-Imd-flugor bereddes och inkuberades med TFs (100 μM) vid rumstemperatur i 30 minuter. SDD-AGE (övre panel i E) och SDS-PAGE (nedre panel i E) analyser utfördes för att analysera Imd-proteinaggregat. Tubulin användes som laddningskontroll.cistanchDensitometrianalys utfördes för att kvantifiera Imd-kondensat i olika prover, och resultaten visades i (F). (G) Ett representativt kromatogram av TFs prov.

（H och I） Renade Flag-Imd-proteiner inkuberades med TFs, TF1, TF2a, TF2b eller TF3 (100 μM för varje prov) eller med en lika stor volym buffert (kontroll) vid rumstemperatur i 30 minuter enligt anvisningarna. Prover utsattes sedan för SDD-AGE (övre panel i H) och SDS-PAGE (nedre panel i H) analyser för att bestämma aggregationsmönstren för Imd. Densitometrianalys för att kvantifiera Imd-kondensat i olika prover utfördes och visades i (). I C, F och I analyseras data med det tvåsidiga studenttestet och visas som medelvärden ± SEM.***p< 0.001.="" see="" also="" figure="">

i figur 3D, AMP-gener som styrs av immunbristvägen (Imd), inklusive diptericin A (DptA), dip-tericin B(DptB), attacin A(AttA), cecropin A1 (CecA1), cecropin A2(CecA2) och cecropin C (Cece), minskade signifikant (med 39,4 procent, 72,3 procent, 10,5 procent, 86,5 procent, 99,8 procent respektive 36,1 procent) i TFs-behandlade grupper jämfört med kontrollgrupperna. För att ytterligare bekräfta resultaten från RNA-seq-analys utförde vi en kvantitativ omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (gRT-PCR) för att kvantifiera de relativa uttrycksnivåerna av Imd-relaterade AMP-gener i Drosophila tarmprover erhållna vid fyra olika ålderspunkter inklusive 10 dagar, 30 dagar, 40 dagar och 50 dagar. Som visas i figur 3E-3G minskade mRNA-expressionsnivåerna för vissa gener, inklusive diptericin, attacin och cecropin A1, signifikant (med nästan 35,9 procent -66,6 procent) hos TF-behandlade åldrade tarmar. Sammantaget avslöjade våra data att TF: er potentiellt antagoniserade aktiveringen av Imd-signalvägen i Drosophila-tarmceller under åldrande.

Theaflaviner är nödvändiga för transkriptionell reglering av Imd-vägen eller ubiquitination av Imd

Vi försökte undersöka sambandet mellan TFs och Imd och utförde ytplasmonresonansanalysen (SPR) som tidigare beskrivits (Lan et al., 2020). Som visas i figur 4A. TFs uppvisade måttlig bindningsaffinitet med renat Imd-protein vid en uppskattad Kp-konstant på 8,078 uM. Sedan tenderar vi att bestämma hur TF: er styr den intestinala Imd-signalvägen. Baserat på resultaten av transkriptomanalys från RNA-seq-data fann vi att uttrycksnivåerna för de viktigaste regulatoriska faktorerna i Imd-signalvägen, såsom PGRP-LC, Imd och Relish, knappast förändrades av TFs-behandling (Figur S3A) ). Vi samlade vidare tarmprover från flugor som utsattes för kosttillskott med eller utan TFs i olika åldrar och utförde qRT-PCR-experiment för att specifikt detektera uttrycksmönstren för dessa gener. Som visas i figur S3B var mRNA-nivåerna för vissa gener, inklusive efffete, faded, tak1, pgrp-Ica, uev1a, böjlös, relish, imd, pgrp-sc2, tab2, ird5 Kenny och diap2, liknande mellan kontrollgrupperna och TF:s interventionsgrupper, vilket tyder på att TF:er inte är involverade i att reglera Imd-signaler på transkriptionsnivå.

Därefter undersökte vi Imd ubiquitination-profilerna eftersom tidigare studier har föreslagit att ubigutinering av Imd är avgörande för nedströms signaltransduktion i Imd-vägen (Myllymaki et al., 2014; Zhou et al., 2005). Vi utförde först en E1-skiftningsanalys in vitro och fann att behandling med TFs inte har någon uppenbar inverkan på de enzymatiska reaktionerna av E1 och ubiquitin för att bilda konjugerad E1 / Ub (Figur S4A). Dessutom transfekterade vi Drosophila S2-celler med plasmider som uttrycker flaggmärkt Imd tillsammans med HA-märkt Ub och behandlade sedan cellerna med eller utan TF: er. Ytterligare ubiquitinationsanalyser antydde att TFs-tillskott knappt påverkade nivåerna av ubiquitinerad Imd i odlade celler (figurerna S4B och S4C). För att bestämma relationerna mellan TF: er och Imd ubiquitination in vivo, använde vi den transgena flugan P {NP1-Gal4}/P{Uasp-Myc-Imd};P{Tub-Gal80*} (refererad till som NP1* s > Myc-Imd), där ett Myc-märkt Imd-protein uttrycktes starkt i tarmceller (Figur S4D). Våra ubiquitinationsexperiment visade att kosttillskott med TF: er var nödvändigt för att modulera ubiquitination av Imd i tarmvävnader (figurerna S4D och S4E). Sammantaget indikerade våra resultat att TFs negativt styr Drosophila Imd-signaler genom att inte påverka ubiquitinationsmönstret för Imd.

Theaflaviner förhindrar Imd-kondensatmontering

En nyligen genomförd studie antydde att aggregering av Imd är avgörande för aktiveringen av nedströms gener i Imd-vägen (Kleino et al., 2017). Vi sökte sedan undersöka om TF:er reglerar processen för

Figur 5. Fortsättning

(F och G) Kvinnliga w18 (refererade till som imd plus / plus ), imd' heterozygota och homozygota mutanter (refererade till som imd plus /- respektive imd-/-) föds upp standardfoder från Drosophila (refererad till som Basal) eller kosttillskott med 2,5 mg/ml (refererat till som TFs) och sedan utsatts för livslängdsanalys. Överlevnadskurva (F) och medellivslängd (G) analyserades och visades.

I och F användes Log Rank-testet för statistisk analys. I BE, och, användes det tvåsidiga Students t-test för statistisk analys, och data är sh som medelvärden ± SEM. NS, ej signifikant, *s<0.05, **p="" <="" 0.01,=""><0.001. see="" also="" figure="">

Imd aggregatbildning. Först renade vi Myc-märkta Imd-proteiner från odlade S2-celler och inkuberade proteinerna med olika koncentrationer av TF: er (Figur 4B). Intressant nog fann vi att TF:er markant förhindrade aggregeringen av Imd (reducerad med 81,7 procent -89,7 procent, figurerna 4B och 4C), vilket antyddes av våra semidenaturerande detergentagarosgelelektroforesanalyser (SDD-AGE). För att bekräfta detta fynd utförde vi ytterligare tioflavin-T-bindningsanalyser och erhöll konsekventa resultat (Figur 4D). Sist tog vi upp NP1ts > Myc-Imd transgena flugor som utsattes för kosttillskott med eller utan TFs och samlade in tarmprover från äldre vuxna. SDD-AGE-experimenten antydde att aggregation av Imd kraftigt nedreglerades av TFs i tarmceller (minskade med 16,7 procent -22 procent, figur 4E och 4F).

För att bestämma hur TF:er bidrar till att kontrollera Imd-kondensatmonteringen, utsatte vi TF:er för HPLCanal-ysis och fann att de huvudsakligen innehöll fyra typer av monomerer (Figur 4G), nämligen teaflavin (TF1), teaflavin 3-O-gallat ( TF2a), theaflavin 3'-O-gallate (TF2b) och theaflavin 3,3'-di-O-gallate (TF3), som överensstämde med tidigare rapporter (Li et al., 2013; Takemoto och Takemoto, 2018) . Sedan inkuberade vi var och en av dessa kemikalier med renat Imdprotein och utförde SDD-AGE-experiment. Som visas i figurerna 4H och 4l resulterade behandling av alla dessa TF-monomerer i en markant minskning (med 59,5 procent, 60,9 procent, 58,4 procent, 58,2 procent och 55,8 procent för TF, TF1, TF2a, TF2b respektive TF3) i de samlade Imd-nivåerna. Sammantaget antydde våra resultat att TF: er negativt reglerar Drosophila Imd-signalvägen förmodligen genom att kontrollera beteendet hos Imd-kondensat.

Theaflaviner förlänger Drosophilas livslängd på ett Imd-beroende sätt

To examine whether TFs prolong Drosophila lifespan depending on their regulatory role in Imd, we specifically knocked down Imd in gut tissues using the transgenic flies P{NP1-gal4)PITub-gal80*}/P{Uasp-imd-IR(KK)} (referred to as Imd RNAi). As shown in Figures 5A and 5B, dietary supplementation of TFs extended the lifespan of controls (elevation of nearly 7.2 days in the mean lifespan), whereas prevention of Imd expression in guts apparently reversed the lifespan extension caused by TFs. Consistent results were obtained when we utilized male Imd RNAi and control flies to perform lifespan assays (Figures S5A and S5B). Further qRT-PCR assays showed that the mRNA expression levels of AMP genes at ages of 10 days, 30 days, 40 days, and 50 days, including diptericin, attacin, and cecropin A1.hardly changed in the gut tissues of Imd RNAi flies(Figures 5C-5E), whereas additional TFs caused reductions of 31%-72.3% in mRNA abundances of these genes in samples from control groups. To confirm these results from Imd RNAi flies, we first performed lifespan assays using w18(control, referred to as imd+/+), imd' heterozygous (referred to as imd+/-), and homozygous(referred as imd-/-)mutant flies. We found that TFs addition extended lifespan and increased mean life longevity of imd+/-flies (elevation of nearly 6.2 days, Figures 5F and 5G). However, this lifespan extension effect by TFs was almost abolished in imd-/-flies (Figures 5F and 5G). Next, we performed lifespan assays utilizing Relish RNAi(NP1's>Relish RNAi and control(NP1ts>plus )flugor. eftersom Relish är nyckeltranskriptionsfaktorn som är ansvarig för Imd-nedströms AMP-genuttryck (Myllymaki et al., 2014). Som visas i Fiqures S5C och S5D. kosttillskott av TF: er förlängde avsevärt kontrollflugornas livslängd, och denna förlängning av livslängden förhindrades signifikant hos Relish RNAi-flugor. Sammantaget indikerade våra data att kosttillskott av TFs positivt bidrar till Drosophilas livslängd troligtvis beroende på intestinala Imd-signaler.

För att se om förlängningen av livslängden av TFstill sker i en axenisk bakgrund, utförde vi livslängdsanalyser med hjälp av w1118-honor under axeniska förhållanden. Som visas i figurerna S5E och S5F påverkade tillägget av olika koncentrationer av TF: er (1 mg/ml och 2,5 mg/ml) knappast förhållandena mellan dödlighet och medellivslängd hos w18 vuxna. Eftersom axeniska uppfödningsförhållanden till stor del kan förhindra riklig mikrobiota, och därmed begränsa Imd-signaler i skärsår (Clarke al., 2015), föreslog våra data att TF:er förlänger Drosophilas livslängd kan vara genom modulering av tarmmikrobiotareglerade medfödda immunsignaler.

Figur 6. Theaflaviner lindrar DSS-inducerad kolit hos CD-1-möss

(A) TF-behandling påverkade inte vattenförbrukningen i olika grupper av CD-1-möss.

(BD) Gavage-administrering av olika koncentrationer av TFs (1 mg/ml, 2,5 mg/ml respektive 5 mg/ml) förbättrade förkortningen av tjocktarmen och förstoringen av mjälten orsakad av DSS hos CD-1-möss. Representativa bilder (B) och statistiska analyser av kolon (C) och mjälte (D) visades. (E) Administrering av olika koncentrationer av TF: er (1 mg/ml, 2,5 mg/ml respektive 5 mg/ml) förhindrade tarmläckage inducerat av DSS i CD-1-möss. (F och G) Kolon uppsamlades från angivna grupper av möss. Totalt RNA extraherades och utsattes för qRT-PCR-analyser för att detektera mRNA-expressionsnivåerna för TNFa(F) och IL-6 (G).

(HL) Kolon från olika grupper av möss samlades in longitudinellt och utsattes för HE-färgningsanalyser. Prover undersöktes med mikroskopi och representativa bilder av de angivna proverna (HL) erhölls och visades. Skalstänger, 40 μm. (M-Q') SEM-bilder som visar mikrotrichomerna av kolon från olika indikerade prover. Skalstaplar, 50 um (MQ) och 4 um (M'-Q').

I CG analyseras data med det tvåsidiga studenttestet och visas som medelvärden ± SEM.NS, inte signifikant, *p<><><0.001. see="" also="" figure="">

Theaflaviner lindrar DSS-inducerad kolit hos CD-1-möss

För att ytterligare undersöka den potentiella rollen för TF: er för att upprätthålla intestinal homeostas hos däggdjur, användes CD-1-möss för att inducera kolit med dextransulfatnatrium (DSS). Möss administrerades intragastriskt olika koncentrationer av TFs (1 g/L, 2,5 g/L eller 5 a/L) eller vatten som en kontroll under fyra veckor, följt av behandling med 2 procent DSS i dricksvatten under 7 dagar. För att se om TFs påverkar mängden DSS som dricks över olika grupper av möss, övervakade vi möss drickande varje dag. Som visas i Fiqure6A är TFs-behandling oumbärlig för att påverka dryckeskonsumtionen hos DSS-inducerade kolitmöss, DSS-behandlade möss presenterade kolitsyndrom med diarré och/eller hematochezi, som förhindrades genom dosberoende TFs-behandling (figur S6A-S6E).cistanche AustralienDessutom räddade intervention med TF: er minskningen i kolonlängd orsakad av DSS och förbättrade förstoringen av mjälten (figur 6B-6D).

Vi använde sedan dextran-4000-FITC (FITC-DX) för att undersöka tarmbarriärfunktionen hos dessa möss. Som visas i figur 6E visade möss från de DSS-behandlade grupperna en hög koncentration av FITC-DX i blodprover, vilket tyder på tarmläckage hos dessa djur. Intervention med TF: er förhindrade emellertid signifikant transporten av FITC-DX från matsmältningsorganen in i cirkulationssystemet (minskat med 56,1 procent -77,5 procent, figur 6E). Noterbart ändrade administreringen av TF inte tarmpermeabiliteten hos möss under normala förhållanden (Figur S6F). Eftersom inflammation spelar en avgörande roll i kolitutveckling av musmodell, utförde vi ytterligare qRT-PCR-experiment, vilket visade att TFs-behandling signifikant nedreglerade IL-6- och TNF-uttryck i tarmarna hos DSS-behandlade möss (figur 6F och 6G).

För att ytterligare analysera de patologiska förändringarna i tjocktarmen utförde vi hematoxylin-eosin (HE) färgningsanalyser. Som visas i figur 6H-6L och S6G-S6J förbättrades den DSS-inducerade allvarliga epitelskadan markant genom TFs-behandling på ett dosberoende sätt. Avbildning med svepelektronmikroskopi av dessa tarmprover gav vidare konsekventa resultat (figur 6M-6Q' och S6K-S6N'). Sammantaget visade våra resultat att TF: er spelar en fördelaktig roll för att skydda tarmbarriärfunktionen hos både insekter och däggdjur.

DISKUSSION

I denna studie undersökte vi de fysiologiska funktionerna hos TF: er för att modulera intestinal homeostas och livslängd och de underliggande molekylära mekanismerna. Vi visade att kosttillskott med TFs positivt bidrar till att förebygga åldersdebut av dysbios i tarmmikrobiotan och fördröjningen av tarm-epitel dysfunktion, vilket förlänger livslängden för Drosophila. Våra mekanistiska studier in vitro och in vivo avslöjade att TFs sannolikt spelar en negativ roll för att kontrollera Imd-signalvägen genom att blockera sammansmältningen av Imd. Dessutom fann vi att DSS-inducerad kolit effektivt kan lindras genom TF-tillskott i CD-1-möss. Våra resultat stöder uppfattningen att TF: er fördelaktigt bidrar till intestinal homeostas hos både ryggradslösa djur och ryggradsdjur.

Kosttillskott med theaflaviner förlänger Drosophilas livslängd

Tekonsumtion är populär över hela världen och är näst efter vattenkonsumtion (Rothenberg och Zhang, 2019). Många studier har fokuserat på de fysiologiska funktionerna ofta via både experimentella och kliniska tillvägagångssätt (Cameron et al., 2008; Niu et al., 2013; Peng et al., 2009; Rothenberg och Zhang. 2019; Spindleret al., 2013; Takemoto och Takemoto, 2018; Unno et al., 2020; Zhou et al., 2020. Det har i stor utsträckning visats att te gynnar hälsan genom att sänka lipidnivåerna och via effekter mot fetma, och de huvudsakliga funktionella föreningarna i te är katekiner, särskilt epigallocatechin gallate (EGCG) (Abbas och Wink, 2009; Modernelli et al., 2015; Niu et al., 2013; Wagner et al., 2015; Xiong et al., 2018). Tidigare studier har också indikerat att grönt te och svart te kan öka livslängden och livslängden för fruktflugor (Site al., 2011; Wagner et al., 2015), maskar (Fei et al., 2017; Xiong et al., 2018) och råttor (Imran et al. .,2018; Niu etal.2013). och den huvudsakliga regleringsmekanismen är det effektiva förebyggandet av oxidativ stress genom EGCG via modulering av ROS-signaler.cistanche fördelar,Huruvida TF: er, som de karakteristiska "gyllene" föreningarna i svart te, spelar en roll för att reglera åldrande och livslängd är i stort sett okänt. Denna studie ger övertygande bevis som indikerar att TFs-intervention är oumbärlig för att påverka födointaget, och långsiktigt upptag av TFs via kosten förlänger livslängden avsevärt hos både han- och honfruktflugor. Dessa fynd ger riktlinjer för ytterligare studier om funktionerna hos TF: er i däggdjurs livslängd.

Theaflaviner förbättrar åldersdebut mikrobiota dysbios och främjar intestinal homeostas Progressiv obalans av proliferativ homeostas och regenerativ kapacitet är ett kännetecken för åldrande och åldersdebuterande sjukdomar (Clark et al., 2015; Heintz och Mair, 2014; Maynard och Weinkove, Rera18; 2018; et al. 2012). Kronisk inflammation är associerad med förlust av homeostas och ökad cancerincidens i åldrande organismer (Bartke et al., 2019; Kapahi et al., 2017; Xiao et al., 2020). Detta är särskilt signifikant i barriärepitel såsom tarmepitel (Guo et al., 2014; Maynard och Weinkove, 2018). Med en modell för utveckling av åldersrelaterad dysplasi i den åldrande tarmen, visade vi att förbättrad värd-kommensala interaktioner i åldrande barriärepitel kan främja hälsa och livslängd. Vi använde ett antal icke-invasiva metoder för att analysera tarmfunktion och mikrobiotadynamik under åldrande. För det första indikerade Smurf-analysen en positiv roll för TF: er för att reglera epitelbarriärdysfunktion under åldrande. Sedan avslöjade immunfärgningsanalysen med flera transgena flugor att TF: er försenade överproliferationen av ISC: er och omsättningen av differentierade celler. Slutligen antydde sekvensering av mikrobiomet att TF: er nedreglerar åldersutvidgningen av den intestinala kommensala mikrofloran. Dessa resultat indikerade starkt att TF: er spelar en nyckelroll för att fördröja värdens åldrandeprocess genom att upprätthålla tarmhomeostas.

Theaflaviner lindrar överdrivna immunsvar i tarmen genom att negativt reglera Imd-signalering

Det har föreslagits att den känsliga balansen mellan tarmens immunfunktion och mikrobiota måste upprätthållas för att säkerställa den långsiktiga homeostasen av barriärepitel (Guo et al., 2014; Maynard och Weinkove, 2018). Tidigare studier har också visat att kronisk överdriven inflammation i tarmen är associerad med åldersrelaterad dysfunktion i barriärepitel och är ett kännetecken för åldrande (Clark et al., 2015; Guo et al., 2014; Ji et al., 2019) . Att upprätthålla en hälsosam kommensal population genom att bevara medfödd immunhomeostas i sådana epitel är således ett lovande tillvägagångssätt för att främja hälsa och livslängd (Bonfini et al., 2016; Broderick, 2016; Clark et al., 2015). Att utforska de molekylära mekanismerna genom att vilka TFs fördröjer åldrandet, utförde vi RNA-seq-analys med hjälp av dissekerade tarmar med eller utan TFs-behandling. Våra data antydde att gruppen av gener som uttrycks starkt i tarmarna hos kontrollfruktflugor jämfört med den hos TFs-behandlade djur var berikad med gener klassificerade som "immunsvars"-gener. Ytterligare bioinformatisk analys och get-PCR-analyser avslöjade att uttrycket av Imd-relaterade AMP-gener dramatiskt hämmades av kosttillskott av TF: er. Resultaten från CD-1 musexperiment som använder DSS för att inducera onormala immunsvar i tarmarna bekräftade ytterligare uppfattningen att TF: er fungerar som skydd mot tarminflammation.

Theaflaviner undertrycker signaler genom att bestämma amyloidsammansättningen av Imd

Hur reglerar TF:er negativt Imd-signalvägen? Baserat på resultaten av transkriptomanalys fann vi att TF: er är nödvändiga för transkriptionell reglering av nyckelfaktorerna i Imd-signalvägen. Av intresse observerade vi den uppenbara bindningsaffiniteten för TF: er med renat Imd-protein genom SPR-analys, vilket antydde en sannolikhet att TF:er kan spela en roll för att kontrollera Imd-proteinbeteende eller dess post-translationella modifieringsprocess. Tidigare studier har visat på en avgörande roll för ubiquitination i Imd-signaltransduktion (Kleino och Silverman, 2014; Myllymaki et al., 2014), och förebyggande av Imd-ubiquitination resulterar i djupgående avstängning av Imd-signalering (Myllymaki et al., 2014; Thevenon et al., 2009). Våra in vitro- och in vivoubiquitineringsanalyser visade dock att TF: er knappast påverkar ubiquitinationsmönstret för Imd. En nyligen genomförd studie har visat att amyloidbildning krävs för aktivering av Drosophila Imd-vägen vid igenkänning av bakteriella peptidoglykaner (Kleino et al., 2017). Intressant nog föreslog våra SDD-AGE- och ThTbinding-analyser att koalescensen av Imd förhindras av TF: er. Förebyggande av Imd-aggregering genom att slå ner eller mutation av Imd i tarmceller vände uppenbarligen de gynnsamma effekterna av TFs på livslängdsförlängning. För att ytterligare bekräfta vårt fynd skulle det vara intressant att undersöka om TF: er inte längre är funktionella för att förlänga livslängden hos fruktflygare när det konserverade kryptiska RHIM-motivet (cRHIM, aminosyror från 118:e till 121h)-motivet av Imd specifikt slås ut förstörs, baserat på upptäckten att brottet i Imd är avgörande för dess aggregering och amyloidbildning (Kleino et al., 2017). Ändå belyser vår studie en avgörande roll för TF: er för att kontrollera tarmens homeostas och åldringsprocessen, kanske genom att modulera Imd-koalescens. Framtida studier bör fokusera på att utforska vilka rester eller regioner av Imd som är bundna av TF: er och hur denna bindning resulterar i att förhindra Imd-kondensering. Dessutom indikerade våra fynd i däggdjurssystemet att TF: er effektivt kunde skydda tjocktarmen mot inflammation orsakad av den exogena giftiga kemikalien DSS, vilket tyder på en bevarad reglerande roll för TF: er för att upprätthålla intestinal homeostas. Det är värt besväret att undersöka om TF spelar en roll för att styra proteinsammansättning i däggdjursvävnader.

Den här artikeln är extraherad från zhongwenxie@ahau.edu.cn