Idag anses cellulär åldrande vara en vanlig reaktion av nästan alla typer av prolifererande celler

Vänligen kontaktaoscar.xiao@wecistanche.comför mer information

AbstraktRiktad eliminering av åldrande celler, analys, är en av kärntrenderna inom anti-aging-terapi. Hjärtglykosider har nyligen visat sig vara senolytiska med brett spektrum. Här testade vi senolytiska egenskaper hos hjärtglykosider mot mänskliga mesenkymala stamceller (hMSC). Hjärtglykosider hade ingen senolytisk förmåga mot åldrande hMSCs av olika ursprung. Med hjälp av biologiska och bioinformatiska tillvägagångssätt jämför vi senescensutveckling i 'hjärtglykosiderkänsliga' A549 och '-okänsliga' hMSCs. Frånvaron av analys visade sig vara medierad av den effektiva kaliumimporten och ökad apoptosresistens i senescent hMSCs. Att försvaga "antiapoptotiskt försvar" predisponerar hMSC för analys. Vi avslöjade att apoptosresistens, som tidigare erkänts som ett vanligt kännetecken för åldrande, i själva verket inte är en allmän egenskap hos åldrande celler. Dessutom är endast apoptos-prolin åldrande celler känsliga för hjärtglykosid-inducerad analys. Sålunda kan vi spekulera i att analysens effektivitet kan bero på om åldrande celler verkligen blir apoptosresistenta jämfört med deras prolifererande motsvarigheter.

NyckelordStamceller. Senolys·Senescens·Apoptos·Stressmotstånd

Klicka här för att veta mer

Introduktion

Idag anses cellulär senescens vara en vanlig reaktion hos nästan alla typer av prolifererande celler, inklusive cancer och stamceller, såväl som vissa postmitotiska celler på en mängd stressande stimuli [1-3]. Följande typer av cellulär senescens kan särskiljas i enlighet med ursprunget för den inducerande faktorn: replikativ (på grund av DNA-skadan vid de förkortade telomerändarna), onkogeninducerad (som svar på avvikande aktivering av onkogen signalering), stressinducerad ( medierad av DNA-skador orsakade av oxidativ stress, värmechock, UV- och y-strålning, etc.) och kemoterapi-inducerad (aktiverad i cancerceller som svar på kemoterapeutiska läkemedel)[4-7]. Det finns heterogenitet i markörer som uttrycks av senescerande celler beroende på både celltyp och en förolämpning som används för att inducera åldrande. Det finns dock flera vanliga egenskaper som är typiska för de flesta typer av åldrande celler. Det väsentliga kännetecknet för åldrande för alla typer av delande celler är den irreversibla proliferationsförlusten [8].cistanche tubulosa extraktIrreversibiliteten av cellcykelstoppet kontrolleras av de cyklinberoende kinas (CDK)-hämmarna pl6 och p21 och regleras ofta av tumörsuppressorproteinet p53 [8,9]. De andra viktiga egenskaperna hos åldrande celler är aktiveringen av ett ihållande DNA-skadesvar; cellhypertrofi, som ofta uppstår som ett resultat av försämrad ribosomal biogenes och proteinsyntes; störning av lysosomal nedbrytning och dysfunktion av de övriga nedbrytningssystemen; ökad aktivitet av det specifika lysosomala enzymet senescensassocierat- -galaktosidas; olika mitokondriella förändringar; förvärv av den senescensassocierade sekretoriska fenotypen (SASP), sammansatt av pro-inflammatoriska faktorer, matrisnedbrytande enzymer, reaktiva syrearter, etc.; epigenetiska förändringar och kromatinlandskapsförändringar, inklusive bildandet av åldringsassocierade heterokromatiska foci och åldringsassocierad utvidgning av satelliter [8-10]. Med andra ord bevarar åldrande celler metabolisk aktivitet och vitalitet, men deras funktion är signifikant förändrad jämfört med ursprungscellerna.

Cistanche kan anti-aging

Det är nu klart att åldrande celler kan modifiera den omgivande mikromiljön som påverkar både närliggande celler och cellulära nischer, vilket kan leda till vävnadsfel och därför kan vara relaterat till progressionen av åldrande och åldersrelaterade sjukdomar [11,12]. Med det i åtanke, fokuseras idag mer uppmärksamhet på strategierna för riktad "dödning" av åldrande celler[13-15]. För detta ändamål utvecklas en ny klass av läkemedel som kallas senolytika aktivt. Senolytika riktar sig mot signalvägar som bidrar till åldrande cellers motstånd mot apoptos, vilket inducerar apoptos företrädesvis i åldrande celler[16]. Listan över senolytika fylls ständigt på med nya medel. De mest kända föreningarna med den angivna senolytiska aktiviteten är navitoclax (Bcl-2-familjenshämmare), en kombination av dasatinib (en hämmare av flera tyrosinkinaser) och quercetin (en naturlig flavonol), Hsp90-hämmare, MDM2-hämmare, FOXO{ {8}}p53-störande peptid, en proteinnedbrytare i BET-familjen, uPAR-specifik CAR-T, galaktokonjugerad navitoclax och olika senolytiska naturliga föreningar[16-24]. Nyligen identifierade två oberoende forskargrupper hjärtglykosider, särskilt ouabain, digoxin och bufalin, som bredspektrum senolytika [25,26].cistanche tubulosa recensionerDet är värt att nämna att nästan alla deklarerade senolytika har begränsningar, såsom oönskade biverkningar eller ineffektivitet mot vissa celltyper. Mesenkymala stamceller (MSCs), som finns i praktiskt taget alla postnatala organ/vävnader, kännetecknas av förmågan att självförnya (symmetriska divisioner) och differentiera, vilket bidrar till underhållet och regenereringen av den kvarvarande vävnaden [27]. På grund av dessa unika egenskaper, tillsammans med de potenta antiinflammatoriska och immunsuppressiva funktionerna, används MSC i stor utsträckning i cellersättningsterapi för behandling av olika sjukdomar, inklusive diabetes mellitus, multipel skleros, hjärtinfarkt, och så vidare [28]. Men, i likhet med deras differentierade avkommor och andra unipotenta celler, kan MSC:er senescera antingen replikativt eller för tidigt som svar på onkogeners aktivering och stressande stimuli [29, 30]. MSC:s åldrande har många oönskade efterverkningar, bland annat utmattning av poolen av stamceller, minskat vävnadsunderhåll och -regenerering, försämrad differentieringskapacitet, SASP-medierad åldringsspridning, minskade angiogena egenskaper, modifiering av stamcellsnisch [29,31-33]. Med hänsyn till den biologiska betydelsen av att de korrekta MSC:erna fungerar, kan åldrande MSC:er anses vara det avgörande målet för analys. I linje med detta förslag har ett antal recensioner som lyfter fram möjliga fördelaktiga resultat av borttagning av senescent MSCs publicerats under det senaste året [29, 31,34,35]. Ändå finns det bara några få experimentella data om detta problem [36-40].

Inom den föreliggande studien visar vi för första gången att hjärtglykosider, nämligen ouabain och bufalin, inte uppvisar hemolytisk aktivitet mot humana MSC (hMSCs) härrörande från endometrium (END-MSCs), fettvävnad (AD-MSCs), tandmassa (DP-MSCs) och Warton-gelé (WJ-MSCs). Dessutom bekräftar vi att båda hjärtglykosiderna kan inducera apoptos företrädesvis i senescent A549 och SK-HEP-1, som tidigare beskrivits i pilotstudierna [25,26]. Genom att utvärdera förändringar i jonisk homeostas orsakad av Nat/K plus -ATPas-blockering och expressionsnivåer av de relaterade generna avslöjar vi att frånvaron av ouabain-inducerad analys kan förmedlas av den ökade effektiviteten av den kompensatoriska K plus-importen i senescent END- MSC:er jämfört med senescent A549. Vidare, med hjälp av avancerad bioinformatik visar vi att åldrande av END-MSCs, resistenta mot ouabain-inducerad analys, åtföljs av förvärvet av apoptos-resistent fenotyp, medan åldrande av ouabain-känslig A549 inte är det. Viktigt är att blockering av aktiviteten hos antiapoptotisk protein MCL-1 före hjärtglykosidbehandling resulterade i analysen av apoptosresistenta senescenta END-MSCs. Därför tillhandahåller vi tydliga bevis för att apoptosresistens inte är en allmän egenskap hos åldrande celler. Baserat på erhållna data drar vi slutsatsen att effektiviteten av analytiska tillvägagångssätt kan bero på om celler verkligen blev apoptosresistenta under åldrandeutvecklingen.

Material och metoder

Celler

END-MSCs, WJ-MSCs, DP-MSCs, AD-MSCs, A549 och SK-Help erhölls från Russian Collection of Cell Cultures (Institute of Cytology, Saint-Petersburg, Ryssland). A549 och SK-Hjälp linjer autentiserades genom karyologi, tumörframkallande egenskaper, isoenzym (LDH och G6PD) tester och STR analys. Celler odlades i komplett medium DMEM F12 (Gibco BRL) kompletterat med 10 procent FBS (HyClone), 1 procent penicillin-streptomycin (Gibco BRL) och 1 procent glutaminsyra (Gibco BRL). Alla celler testades rutinmässigt för mykoplasmakontamination.

Åldrande- och stressframkallande tillstånd

För oxidativ stress-inducerad senescens behandlades END-MSCs/WJ-MSCs med 200 uM/100 uM HO(Sigma) under 1 timme. För doxorubicin-inducerad senescens behandlades DP-MSCs/A549 med 1 μM doxorubicin (Veropharm) i 3 dagar. I varje fall ansågs cellerna senescenta inte tidigare än 14 dagar efter behandling. För replikativ senescens identifierades AD-MSC tidigare än den 4:e passagen som kontrollceller och senare än den 10:e som senescenta. För etoposid-inducerad senescens A549/END-MSCs/SK-Help behandlades med 2 uM/5 uM/3 uM etoposid (Veropharm) i 3 dagar och analyserades inte tidigare än 7 dagar efter senescensinduktion. I det här fallet sammanföll behandlingsdesignen helt med de som beskrevs i studien från vilken RNA-seq-data härrörde (Wang et al., 2017). Två hjärtglykosider vi applicerade som senolytiska föreningar — Ouabain (Sigma) och Bufalin (Calbiochem).

För att jämföra stressresistens mellan kontroll och senescent END-MSC eller A549, behandlades celler antingen med 400/800 uM H O2(Sigma) under 1 timme eller med 0,3/1 uM staurosporin (Sigma). Cellviabilitet analyserades 48 timmar efter stressinduktion.

För att blockera MCL-1-aktivitet förbehandlades END-MSC med 10 uM A-1210477(Sigma) i 3 dagar.

Flödescytometrianalys

Mätningar av cellviabilitet, proliferation, cellstorlek, autofluorescens, apoptoshastigheter, kaspas 3/7-klyvning, mitokondriell membranpotential och membrandepolarisering utfördes med flödescytometri. Flödescytometri utfördes med hjälp av CytoFLEX (Beckman Coulter) och de erhållna data analyserades med CytExpert-programvara version 2.0. Vidhäftande celler sköljdes två gånger med PBS och skördades genom trypsinisering. Frigjorda celler slogs samman och återsuspenderades i färskt medium och räknades sedan och analyserades för autofluorescens. För att få tillgång till cellviabilitet tillsattes 50 ug/ml propidiumjodid (Life Technologies) till varje prov strax före analys. Cellstorleken utvärderades genom cytometrisk framåtriktad ljusspridning av PI-negativa celler. Apoptosinduktion verifierades med hjälp av Annexin-V-APC (Invitrogen) och DAPI (Sigma) samfärgning enligt tillverkarens instruktioner. Kaspasaktiviteten utvärderades med CellEventTM Caspase-3/7 Green Flow Cytometry Assay Kit (Invitrogen) enligt tillverkarens protokoll. Förlust av mitokondriell membranpotential utvärderades med det ratiometriska färgämnet JC-1 (Invitrogen). Färgningsproceduren utfördes i enlighet med tillverkarens protokoll. För membrandepolarisering använde vi en DiBAC4 (3) fluorescerande sond (Invitrogen).

Åldringsassocierad -galaktosidasfärgning

Senescensassocierad -Galactosidase (SA- -Gal)-färgning utfördes med användning av ett senescens-galaktosidasfärgningskit (Cell Signaling Technology) enligt tillverkarens instruktioner. Kvantitativ analys av bilder producerades med tillämpning av MatLab-paketet, enligt algoritmen som beskrivits tidigare[41]. För varje experimentell punkt analyserades inte mindre än 50 slumpmässigt utvalda celler.

Western blotting

Western blotting utfördes som beskrivits tidigare [41]. SDS-PAGE-elektrofores, överföring till ett nitrocellulosamembran och immunblotting med ECL (Thermo Scientific)-detektion utfördes enligt tillverkarens standardprotokoll (Bio-Rad Laboratories). Antikroppar mot följande proteiner användes: glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH)(klon 14C10), fosfo-p53(Ser15), p21(klon 12D1), fosfo-Rb (Ser807/811) , HMGB1 (klon D3E5), såväl som pepparrotsperoxidas-konjugerad get-antikanin-IgG. Spädningshastigheten var 1:1000 för alla primära antikroppar och 1:7000 för sekundära. Alla antikroppar köptes från Cell Signaling. Scion Image 4.0 (Scion Corporation) användes för att välja och bestämma den bakgrundssubtraherade densiteten för banden i alla geler och blöts.

Transkriptomisk analys

Prover från följande tre Gene Expression Omnibus (GEO)RNA-seq-datauppsättningar användes i analysen: GSE102639(GSM2742113-GSM2742114 och GSM2742121-GSM2742122för kontroll- och senescentA549-celler, följaktligen); GSE122081(GSM3454482-GSM3454484 och GSM3454500-GSM3454502 för kontroll- och senescent IMR-90-celler, i enlighet därmed); och vår datauppsättning GSE160702 (GSM4877895-GSM4877898 och GSM4877907-GSM4877910 för kontroll- respektive senescent END-MSCs). Data för alla datamängder behandlades på samma sätt.

Raw-läsdata genomgick kvalitetsfiltrering och adaptertrimning via FilterByTile- och BBDuk-skript från BBtools-paketet (version 38.75) med standardalternativen. De återstående läsningarna filtrerades och trimmades dessutom med hjälp av ett trimesterskript från FastqPuri-paketet (version 1.0.7).cistanche StorbritannienTrimningsoperationen tillämpades för båda ändarna av avläsningarna om de innehöll N eller deras kvalitet var under kvalitetströskeln som satts till 27, alla avläsningar kortare än 25 baser kasserades. Kvalitetskontrollen av trimningen hölls med FastQC-mjukvaran (version 0.11.7) och FastqPuri-skript. Avläsningarna, efter att ha klarat alla operationer, omfattar inte mindre än 90 procent av den initiala datan.

Transkriptionsmängder uppskattades med hjälp av lättviktsmapping från Salmon (version 1.1.0) som kördes i det selektiva inriktningsläget. Listan över lockbeten genererades baserat på Gencodes mänskliga referensgenom GRCh38.p13 (release 33) och användes vidare för att bygga indexet på sammanlänkade transkriptom- och genom Gencode-referensfiler (release 33) med en kmer-storlek på 21. Kartläggningsoperationer kördes med ytterligare flaggor——numBootstraps 30——paljetter——gcBias——validera mappningar. De resulterande kartläggningshastigheterna var runt 70 procent.

Ytterligare databehandling utfördes med R-version 3.6.3 med Tidyverse-samlingen av paket (version 1.3.0). Uppskattade genantal, metadata och transkriptintervall laddades in i R och sammanfattades till en gennivå med användning av tximeta (version 1.4.5). Den resulterande räkningsmatrisen filtrerades för att innehålla rader med minst 5 uppskattade räkningar över alla prover, den resulterande matrisen innehöll 20 400 gener.

För PCA- och heatmap-representationen normaliserades läsantalet med hjälp av loggtransformation från DESeq2-paketet (version 1.26.0).cistanche wirkungVärmekartor konstruerades med användning av genfilter (version 1.38.0) och heatmap(version 1.0.12)R-paket. Validering av delningsprover efter senescensvariabel utfördes genom att underställa normaliserade läsvärden av gener relaterade till Gene Ontology-termen "Cellular senescence" (GO 0090398). Differentiell uttrycksanalys och uppskattning av log-faldiga förändringar beräknades med hjälp av DESeq2 för den sista variabeln i designformeln som kontrollerar cellernas åldersstatus, ouabainbehandlingsreaktion och interaktion mellan de angivna faktorerna. För att stärka testning av differentiella uttryck, användes korrigering av logvikningsändring med en kombination av adaptiv krympningsuppskattning från palmpaketet (version 1.8.0) och angivande av ytterligare ett tröskelvärde för logveckändring lika med 0,667. De resulterande krympta uppskattningarna användes ytterligare för genrankning och körning av Gene Set Enrichment Analysis med användning av klusterprofil (version 3.14.3) och fuse (version 1.12.0) R-paket med p-värden justerade för flera jämförelser enligt Benjamin-Hochberg-metoden. Affymetrix-mikroarrayprover för kontroll- och senescent AD-MSCs erhölls från GEO-databasen (GSE66236) och bearbetades med Phantasus webbapplikation med log2- och kvantilräkningsnormalisering. Genuppsättningsanrikningsanalys utfördes med användning av en säkring (version 1.12.0)R-paket.

RNA-extraktion, omvänd transkription och realtids-PCR

RNA-extraktion, omvänd transkription och realtids-PCR utfördes som beskrivits i vår tidigare studie [32]. Reagens för RNA-extraktion (ExtractRNA-reagens), omvänd transkription (MMLV RT-kit) och realtids-PCR (HS SYBR-kit) erhölls från Evrogen. Genuttrycksnivåer utvärderades med realtids-PCR BioRad CFX-96-förstärkaren (BioRad) med följande körprogram för alla undersökta gener: 40 cykler av smältning i 10 s vid 95 grader, glödgning i 15 s vid 57,5 ​​grader , och syntes i 15 s vid 72 grader. Analys av smältkurvor användes för att kontrollera reaktionernas specificitet. Följande analys av de erhållna data utfördes med hjälp av Bio-Rad CFX Manager-mjukvaran (BioRad) med standard 2deltaCt-kvantifieringsmetoden med användning av GAPDH-uttryck som referens. Primersekvenser listas i tabell 1.

Statistisk analys

För att få signifikans i skillnaden mellan de två grupperna användes Students t-test eller Welchs t-test. För flera jämförelser mellan grupper användes ANOVA med Tukeys HSD. Om inte annat anges visas alla kvantitativa data som medelvärde±SD och asteriskerna indikerar signifikanta skillnader enligt följande: ns, inte signifikant,*p<0.05,><><0.001. statistical="" analysis="" was="" performed="" using="" r="">

Resultat

H2O2-behandlade END-MSC:er går in i den för tidig åldrande

Inom den aktuella studien använde vi mänskliga mesenkymala stamceller isolerade från desquamered endometrium (END-MSCs), som uppfyller de minimikriterier som föreslås av ISCT för att definiera hMSCs [41]. Tidigare har vi utvecklat en tillförlitlig experimentell modell för att studera olika aspekter av den för tidig åldrande av END-MSCs [30]. Vi har nämligen visat att END-MSCs utsatta för subletal oxidativ stress gradvis förvärvade alla typiska egenskaper hos åldrande celler, inklusive ihållande DNA-skada-härdar och aktivt DNA-skadesvar, irreversibel cellcykelstopp medierad av den klassiska p53/p21/Rb väg, proliferationsförlust, cellhypertrofi, uppkomst av SA- -Gallfärgning och utveckling av senescensassocierad sekretorisk fenotyp [30, 32, 42]. Här tillämpade vi den designade modellen för att studera senolytisk effekt av ouabain samt för att avslöja de underliggande intracellulära förändringarna i jonhomeostas. Inledningsvis, genom att uppskatta de vanligaste parametrarna, bekräftade vi att engångsdos (1 timme, 200 μM) HO-behandling var tillräcklig för att inducera senescens i END-MSCs. Viktigt är att stressade END-MSCs ansågs åldrande två veckor efter den oxidativa stressen; därför utvärderades alla senescensmarkörer inte tidigare än 14 dagar efter H-Oz-behandling. H-Oz-behandling av END-MSC ledde faktiskt till proliferationsblockering, cellhypertrofi som indikeras av den ökade cellstorleken, ackumulering av lipofuscin som detekteras genom förhöjd autofluorescens, uppkomst av SA- -Gal, aktivering av p21/Rb-väg och förlust av HMGB1 stöder tillsammans åldrande etablering under de valda experimentella förhållanden (Fig. ac, e, f).

De mest skadliga effekterna av åldrande celler på vävnads- och organismnivå tros vara följden av deras långvariga vitalitet. I linje med denna punkt behöll HO?-behandlade END-MSCs hög viabilitet även i de sena stadierna av senescensutveckling (viabiliteten för senescerande END-MSCs bedömdes 17 dagar (14 dagar＋3 dagar) efter den initiala oxidativa stressen) (Fig.1d) ). Sammanfattningsvis är subletal HO2-behandling av END-MSCs den lämpliga modellen för för tidig åldrande och är relevant för att undersöka effekterna av senolytiska föreningar på END-MSC.

Hjärtglykosid ouabain har ingen senolytisk aktivitet mot åldrande END-MSCs i ett brett koncentrationsområde

Nya bevis tyder på att hjärtglykosider, inklusive ouabain, digoxin och bufalin, representerar en familj av föreningar med hemolytisk aktivitet [25,26]. Även om hjärtglykosider idag anses vara senolytiska med ett brett spektrum, saknas data om deras effekter på senescenta hMSCs. Därför testade vi här om ouabain har potential att inducera död selektivt i senescenta END-MSCs. För att göra det bedömde vi livsdugligheten för kontroll- och senescent END-MSC efter behandling med ouabain vid det breda koncentrationsintervallet (från 10-' till 10~ M). Intressant nog ledde ingen av de applicerade koncentrationerna till en märkbar minskning av livsdugligheten hos både kontroll- och senescentceller den första dagen efter applicering av ouabain (Fig.2 och Kompletterande Fig.S1).

Men på den tredje dagen efter ouabain-behandling avslöjade vi en signifikant dosberoende minskning av livskraften för kontroll END-MSCs (Fig. 2a och Kompletterande Fig. S1). Oväntat visade sig åldrande celler vara mer resistenta mot ouabain vid varje testad koncentration. I linje med detta resultat ledde10-M ouabain till mer benägen apoptotisk död i kontrollceller (20,75 procent An plus /PI- och 36,47 procent An plus /PI plus ) jämfört med åldrande (15,01 procent An＋/PI) -och 12,15 procent An plus /PI plus )(Fig.2b). Erhållna resultat visar tydligt att i samband med senescenta END-MSCs har ouabain ingen senolytisk aktivitet.

För att utesluta möjliga effekter associerade med variabilitet av åldringsinducerande stimuli på senolytisk verkan av ouabain, utförde vi ytterligare en uppsättning experiment. Vi behandlade nämligen END-MSCs med etoposid istället för oxidativ stress för att inducera för tidig åldrande.citrusbioflavonoiderEtoposid-behandlade END-MSCs visade alla egenskaper som är typiska för åldrande celler (Fig.3a-e).

Viktigt, ouabain hade ingen hemolytisk verkan mot etoposid-behandlade senescenta END-MSCs (Fig. 3f och Supplemental Fig. S2). Dessa data ger ytterligare bekräftelse för ovanstående resultat och bevis för att avsaknaden av ouabain-inducerad analys inte är konsekvensen av den konkreta åldrandeutlösaren som används för att inducera åldrande.

Fig. 1 Validering av oxidativ stress-inducerad END-MSCs modell för prematur åldrande. Åldrande END-MSCs a lös proliferation, b genomgår hypertrofi, c förvärvar förhöjd autofluorescens, bibehåller hög cellviabilitet d och e visar SA- -Gal-aktivitet jämfört med kontroll. f Fosforyleringsnivåer av p53 och Rb och expressionsnivåer av p21- och HMGBI-proteiner i kontroll- och senescent END-Ouabain har ingen hemolytisk verkan mot mänskliga mesenkymala stamceller av olika ursprung. För att bredda våra observationer angående frånvaron av ouabain-inducerad analys i END-MSCs , analyserade vi ouabain-effekter på hMSCs isolerade från andra källor inklusive fettvävnad, tandmassa och Whartons gelé. För att ytterligare stärka våra data använde vi olika modeller av åldrande——replikativ åldrande för AD-MSCs, doxorubicin-inducerad åldrande för DP-MSCs och oxidativ stressinducerad åldrande för WJ-MSCs (Fig.4a-f).

Som visas i Fig. 4g skilde sig olika typer av hMSCs i livsduglighet vid ouabain-behandling, till exempel var både kontroll- och senescent DP-MSCs mycket mer resistenta mot ouabain-verkan än WJ-MSCs (Fig. 4g och tilläggsbild S3b, c). Ändå kunde ouabain inte inducera senolys i någon av de olika typerna av åldrande hMSCs (Fig. 4g och Kompletterande Fig. S3). Tillsammans visar de erhållna data att frånvaron av ouabain-inducerad analys är ett vanligt drag för olika typer av hMSCs. MSC:er. De presenterade värdena är medelvärde±SD. För flera gruppjämförelser vid a och d användes enkelriktad ANOVA, n=3, ns inte signifikant,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="">

GAPDH användes som en laddningskontroll

Hjärtglykosidbufalin dödar inte senescent END-MSCS

För att verifiera frånvaron av senolytisk verkan av hjärtglykosider mot hMSCs applicerade vi bufalin, en annan förening med den angivna senolytiska aktiviteten som tillhör hjärtglykosiderfamiljen [25]. Bufalin hade nästan ingen effekt på kontrollens livsduglighet och H2O2-behandlade senescent END-MSCs i ett brett koncentrationsområde (från 10-7 till 10-5 M) (fig. 5a och tillägg Fig. S4a).

I likhet med vad vi observerade för ouabainbehandling, var frånvaron av analys på bufalin oberoende av åldrandeinducerande stimuli, eftersom livsdugligheten hos ESC: er som senescerade antingen som svar på oxidativ stress eller på etoposid var opåverkad (fig. 5a, b, tilläggsbild) S4a, b). Resultaten som beskrivits ovan bekräftar att hjärtglykosider visade sig vara ineffektiva för riktad dödsinduktion i senescenta END-MSCs. MSC:er. De presenterade värdena är medelvärde±SD. För flera gruppjämförelser vid a och d användes enkelriktad ANOVA, n=3, ns inte signifikant,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" um.="" gapdh="" was="" used="" as="" a="" loading="">

Hjärtglykosidbufalin dödar inte senescent END-MSCS

För att verifiera frånvaron av senolytisk verkan av hjärtglykosider mot hMSCs applicerade vi bufalin, en annan förening med den angivna senolytiska aktiviteten som tillhör hjärtglykosiderfamiljen [25]. Bufalin hade nästan ingen effekt på kontrollens livsduglighet och H2O2-behandlade senescent END-MSCs i ett brett koncentrationsområde (från 10-7 till 10-5 M) (fig. 5a och tillägg Fig. S4a).

I likhet med vad vi observerade för ouabainbehandling, var frånvaron av analys på bufalin oberoende av åldrandeinducerande stimuli, eftersom livsdugligheten hos ESC: er som senescerade antingen som svar på oxidativ stress eller på etoposid var opåverkad (fig. 5a, b, tilläggsbild) S4a, b). Resultaten som beskrivits ovan bekräftar att hjärtglykosider visade sig vara ineffektiva för riktad dödsinduktion i senescenta END-MSCs.

Fig.2 Ouabain har ingen hemolytisk aktivitet mot HO2-behandlade senescent END-MSC i ett brett koncentrationsområde. Relativ cellviabilitet (procent) av kontroll och senescent END-MSCs inom 3 dagar efter behandling med 1077,10~6,10-5 M ouabain. b Apoptosinduktion i END-MSC efter 10-6 M ouabain utvärderad med Annexin V/DAPI dubbelfärgning. n=3 oberoende experiment. Alla data motsvarar medelvärdet±SD. Statistisk signifikans bedömdes med Welchs t-test:ns inte signifikant,***s<>

Både hjärtglykosider ouabain och bufalin kan inducera celldöd selektivt i åldrande A549- och SK-Hep1-celler

Med hänsyn till det faktum att våra resultat inte överensstämmer med de nyligen publicerade bevisen om den bredspektrade senolytiska effekten av hjärtglykosider, beslutade vi att reproducera denna effekt med hjälp av den cellulära modellen som beskrivs i de relevanta studierna [25,26]. Således utförde vi en serie experiment med kontroll och åldrande A549 lungkarcinomceller. Åldrande i A549-celler inducerades genom etoposidbehandling. Etoposid-inducerad senescens av A549-celler är en ofta använd och därmed välkarakteriserad modell av terapiinducerad senescens [4]. Ouabain visade sig också selektivt döda etoposid-behandlade åldrande A549-celler[25]. För att bevisa åldrande i A549 bedömde vi proliferationshastighet, cellstorlek, ackumulering av lipofin, SA- -Galfärgning, aktiveringsstatus av p53/p21/Rb-vägen och expressionsnivån för HMGB1 (Fig. 6a-e).

För att verifiera hemolytisk aktivitet av ouabain mot åldrande cancerceller, uppskattade vi först dosberoende cellviabilitet. I linje med våra resultat som beskrivs ovan kunde vi inte upptäcka någon signifikant minskning av antalet livsdugliga kontroll- eller senescenta A549-celler inom 24 timmar efter applicering av ouabain (tilläggsbild S5a). På 3 dagar efter behandling minskade ouabain emellertid avsevärt livsdugligheten för åldrande A549-celler på ett dosberoende sätt, medan antalet kontroll-A549-celler minskade i mycket mindre utsträckning (Fig.7a och Kompletterande Fig. S5a). Nämligen, ungefär 90 procent av kontrollcellerna bevarade livsduglighet vid 10- Mouabain jämfört med 50 procent av åldrande A549-celler behandlade med samma dos (Fig.7a). Åldrande A549-celler var dessutom mer benägna att bufalin-inducerad celldöd än deras kontrollmotsvarigheter (Fig. 7b) (Fig. 5b och Kompletterande Fig. S5b).

Enligt publicerade data utlöste ouabain kaspas-3-beroende apoptos i senescenta A549-celler [26]. Faktum är att vi avslöjade en signifikant ökning av den dubbla positiva och/eller PI-fraktionen i åldrande cancerceller behandlade med 10-6M ouabain (Fig.7c). Vidare, med användning av fluorescerande analys, observerade vi aktivering av kaspas-3 i ouabain-behandlade åldrande A549-celler (Fig. 7d). Sammantaget överensstämmer dessa resultat helt med data som beskrivs av andra författare och bekräftar den hemolytiska aktiviteten hos ouabain mot A549.

Dessutom använde vi doxorubicin istället för etoposid för att orsaka åldrande i A549 (Fig. 8a-e). Som väntat visade doxorubicinbehandlad senescent A549, såväl som etoposidbehandlad, högre känslighet både för ouabain och bufalin jämfört med deras kontrollmotsvarigheter (Fig. 8g och Kompletterande Fig. S6). Det senare bekräftar att senolytiska effekter av hjärtglykosider är oberoende av åldringsinducerande stimuli. Således har hjärtglykosider verkligen senolytiska

Fig.3 Ouabain kan inte inducera senolys i etoposidbehandlade senescenta END-MSCs. Validering av den episodinducerade senescensmodellen för END-MSC:er: a proliferationsförmåga, b-cellstorlek, c autofluorescensnivåer och d SA- -Gal-aktivitet, e-fosforyleringsnivå av Rb och expressionsnivåer av p21- och HMGBI-proteiner. f Relativ cellviabilitet (procent) av kontroll- och senescentceller efter behandling med 10-6 ouabain. Värdena är medelvärde±SD. För flera grupper användes jämförelser vid en enkelriktad ANOVA,n=3, ns inte signifikant,***p<0.001.for pair="" comparisons="" at="" b,c,d,f="" welch's="" t-test="" was="" used,="" n="3" for="" b,="" c,f="" n="50" for="" d,="" ns="" not="" significant,=""><0.05,><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" μm.="" gapdh="" was="" used="" as="" loading="" control="" activity="" towards="" a549,="" but="" these="" compounds="" turned="" out="" to="" be="" ineffective="" for="" targeted="" death="" induction="" in="" senescent="">

Slutligen bestämde vi oss för att reproducera analysexperiment på etoposid-behandlade levercancerceller SK-Help, en annan cellmodell med bevisade senolytiska effekter av hjärtglykosider enligt Guerrero et al. studie [25] (Fig. 9a-e). Etoposid-behandlad senescent SK-Help visade högre känslighet för båda medlen jämfört med deras kontrollmotsvarigheter, vilket bevisade den hemolytiska verkan av hjärtglykosider mot denna celltyp (Fig. 9f och Tilläggsbild S7).

Tillsammans visar dessa data att selektiviteten hos hemolys inducerad av hjärtglykosider beror mer på cellnatur än på den konkreta åldrandeutlösaren.

Den här artikeln är extraherad från Cellular and Molecular Life Sciences (2021) 78:7757–7776 https://doi.org/10.1007/s00018-021-03980-x