Tolerans mot NADH/NAD plus obalans förutser åldrande och anti-aging interventioner

Vänligen kontaktaoscar.xiao@wecistanche.comför mer information

SAMMANFATTNING

Redox-par samordnar cellulär funktion, men konsekvenserna av deras obalans är oklara. Detta är något förknippat med begränsningarna i deras experimentella kvantifiering. Här kringgår vi dessa svårigheter genom att presentera ett tillvägagångssätt som kännetecknar fitnessbaserade toleransprofiler för att redoxa parobalanser med hjälp av en silikonpresentation av metabolism. Med fokus på NADH/NAD1 redoxparet i jäst, visar vi att reduktiva ojämvikt genererar metabola syndrom jämförbara med de som observeras i cancerceller.cistanche extrakt fördelarJästmutanters tolerans mot redoxojämvikt kan också förklara 30 procent av variationen i deras experimentellt uppmätta kronologiska livslängd. Dessutom, genom att förutsäga betydelsen av vissa metaboliter för att motstå obalanser, identifierar vi korrekt de näringsämnen som ligger bakom patologimekanismer, livslängdsskyddande molekyler eller kalorirestriktionsmimetika. Tolerans mot redoxobalanser blir på detta sätt ett ljud som ger ett ramverk för att känna igen egenskaperna hos åldrandefenotypen samtidigt som det överensstämmer med ett biologiskt skäl för att bedöma anti-aging-interventioner.

INTRODUKTION

Forskningen om redoxhomeostas har expanderat avsevärt under de senaste två decennierna, och kontinuerligt omskapat klassiska föreställningar om oxidativ cellulär skada (Halliwell och Gutteridge, 2015). Bland de mest paradigmatiska molekylära medlen som ligger bakom denna homeostas framträder förhållandena mellan redoxpar, som de för de konjugerade formerna av glutation, NADPH och NADH. Både glutation och NADPH fungerar som väsentliga rensande mekanismer för reaktiva syrearter (ROS) i mitokondrier, medan NADPH och NADH kopplar anabola respektive katabola vägar med cellens redoxtillstånd.

Klicka här för att veta mer

Trots det fortsätter nya mekanismer som länkar NADPH/NADP*- och NADH/NAD*-par till redoxhomeostas att kännas igen. Till exempel förklarar balansen av NADPH/NADP plus delvis de pro-överlevnadskonsekvenser av AMP-aktiverat proteinkinas (She et al., 2014). Den associerar också dygnsrytmtidtagning med redoxtillstånd (Rey et al., 2016). NADH/NAD plus-förhållandet tros för närvarande vara involverat i koordineringen av mitokondriell och nukleär funktion, den epigenetiska regleringen av DNA-reparation och cellulär identitet, och inställningen av energimetabolism till miljövariabler (Canto et al., 2015; Gomes et al. al. 2013). I icke-patologiska tillstånd fluktuerar NADH/NAD*-förhållandet med syrespänningen, med hypoxiska tillstånd och högre syretillgänglighet som i motsvarande grad förekommer samtidigt med reduktiva och oxidativa avvikelser (Clanton, 2007; Graef et al., 1999).

Men det växande intresset för redoxparförhållanden kommer främst från deras implikationer i patologi.cistanche genghis khanUppkomsten av ROS i både de reduktiva (hypoxiska, NADH-benägna) och de oxidativa (hyperoxiska, NAD plus benägna) sinnen har relaterats till avvikelser från en optimal redoxpotential som säkerställer bästa prestanda hos mitokondrierna (Aon et al., 2010) Clanton, 2007). När det gäller cancer kan minskad NADH/NAD plus ligga bakom dödligheten av glioblastom (Gujar et al., 2016) och främja koloncancerprogression (Hong et al., 2019), men det kan också rädda vissa friska fenotyper i olika grader i celler från andra tumörtyper (Garrido och Djouder, 2017).

Cistanche kan anti-aging

NADH har också blivit en intressant plats i Torontos biologi. I detta sammanhang resulterade ökningen av NAD plus-poolen i en partiell vändning av åldrande och andra relaterade patologiska fenotyper över organismer (Das et al., 2018; Mendelsohn och Larrick, 2014; Wei et al., 2017; Zhu et al. , 2017), och senescenta och neoplastiska celler har visat sig uppvisa obalanser i förhållandet NADH/NAD plus (Braidy et al., 2011; Schwartz och Passonneau, 1974; Wiley et al, 2016). Dessutom är de nyupptäckta rollerna för NADPH och det framväxande konceptet NADH/NADH som en masterregulator av redoxhomeostas och senescens alla i linje med den metaboliska stabilitetsteorin om åldrande (Demetrius, 2004). Denna teori föreslår att orsaken till åldrande är sårbarheten hos steady-state-nivåerna av redoxpar för slumpmässiga miljöstörningar på enzymreaktionshastigheter, och gör flera intressanta förutsägelser som gäller för människor.

Med tanke på alla dessa implikationer har många studier undersökt fenomenologin för redoxparförhållanden antingen genom att passivt rapportera deras nivåer eller genom att aktivt modifiera dem. Experimentella manipulationer är dock utmanande. De mest traditionella anklagar djupa experimentella varningar (Sun et al., 2012) och nyare missar fortfarande vissa biologiska omständigheter på grund av att de är begränsade till temperatur- och pH-intervall (Hung et al., 2011; Zhao et al., 2015). Dessutom är det experimentellt dyrt att övervaka det breda utbudet av fenotyper efter förändring av koenzympooler genom metabolittillskott (Hou et al., 2010) och mutationer eller överuttryck av NAD(H)-konsumerande enzymer (Bait al., 2011; Felipe et al., 1998). Det finns således ett behov av alternativa strategier för att hantera kontrollen av redoxhomeostas genom manipulering av redoxpar, såväl som vår förståelse av de biologiska konsekvenserna av denna kontroll.

In silico-modeller blir en praktisk forskningsstrategi när experimentella tillvägagångssätt är begränsade, med fördelen att möjliggöra en fullständig mekanistisk redogörelse för de observerade fenomenen. Genom-skala metaboliska modeller, som kan studeras genom flödesbalansanalys (FBA) (Orth et al, 2010) har blivit en standard inom systembiologi för att studera konsekvenserna av metabola störningar på cellulär funktion (metoder S1). Bland andra bidrag har de hjälpt till med upptäckten av nya antibiotika och kemoterapeutika, utformningen av bakteriestammar optimerade för industriell produktion av ämnen av intresse och bättre förståelse av mänskliga metabola sjukdomar (Burgard et al., 2003; Pagliarini et al. 2016; Raman et al., 2009). Användningen av FBA har den ytterligare fördelen att ge insikt i metaboliska fenomen utan påverkan av icke-metaboliska störande faktorer (genetiska, epigenetiska, mekaniska, etc.). Således är metaboliska modeller i genomskala särskilt väl lämpade för att undersöka de metabola konsekvenserna av avvikelser från redoxhomeostas.

Här använder vi FBA för att undersöka balansen mellan redoxpar på en genomskalig rekonstruktion av den encelliga eukaryoten Saccharomyces cerevisiae, varvid vi karakteriserar de metaboliska och livslängdsrelaterade konsekvenserna av en kontrollerad störning av tillgänglig NADH/NAD plus flöde över olika genetiska bakgrunder. Mer specifikt avslöjar våra resultat att tolerans mot denna obalans leder till en specifik metabolisk omdirigering som påminner om patologi och förklarar också mer än en fjärdedel av den intraspecifika variationen i post-mitotisk livslängd. Dessutom hjälper detta ramverk oss att skissera ett beräkningsprotokoll (som vi även tillämpar på djur- och mänskliga metaboliska modeller) för att identifiera metaboliter och enzymer med potential som terapeutiska mål i samband med åldersrelaterade patologier.

RESULTAT

En konditionsbaserad toleransprofil kännetecknar redoxparstörningar

För att representera en obalans mellan de konjugerade formerna av ett redoxpar, inkorporerade vi en artificiell reversibel reaktion - "obalansreaktionen" - i genomskalekonstruktionen av motsvarande metaboliska nätverk (STAR-metoder). Reaktionen oxiderar eller reducerar paret samtidigt som man beaktar specifika cellulära avdelningar (t.ex. cytosol, mitokondrier, etc.), och dess aktivitet kan fixeras till vilket önskat hastighetsvärde som helst. För vilket som helst av dessa värden kan man beräkna en tillväxthastighet ("fitness") som fungerar som en proxy för jästcellens tolerans för det specifika tillståndet. Slutligen definieras en toleransprofil genom att beräkna tillväxthastigheten för ett område av obalansvärden (Figur 1A; observera att reduktiva/oxidativa förhållanden är representerade i blått/rött respektive i hela manuskriptet).

Toleransprofiler uppvisar vanligtvis en maximal tillväxt runt nollobalanspunkten, med ungefär vilken avvikelse som helst (dvs reaktionens värde som inte är noll) som leder till minskad kondition. Detta understryker det faktum att för att metabolism ska fungera måste aktiviteten hos reaktionerna som ställer in ett redoxparförhållande i en mening vara proportionell mot aktiviteten hos de som ställer in det i den andra. Mer specifikt, cytosoliska obalanser av NADH/NADt i S.cistanche livslängdcerevisiae som växer på glukos och aeroba förhållanden ger en profil med en maximal tillväxt som signifikant förskjuts mot den oxidativa sidan på en punkt i obalansprofilen där ~50 mmol/DW/timme NADH omvandlas till NADH (Figur 1B). När vi istället övervägde obalansen i mitokondrierna, observerade vi ett maximum vid punkten av noll obalans (Figur 1C), ett mönster som vi på liknande sätt observerade i andra profiler (Figur S1). I allmänhet blir reducerande villkor

Figur 1. En toleransprofil kännetecknar svaret på redoxobalanser

(A) Överst. Vi introducerade en artificiell reaktion i den metaboliska rekonstruktionsmodellen av en organism (i detta fall jäst) för att interkonvertera de två konjugerade formerna av ett redoxkoenzym (här NADH/NADH-paret). Under var och en av en serie obalansförhållanden, dvs. hastighetsvärden för den artificiella reaktionen, tillämpar vi flödesbalansanalys för att beräkna tillväxthastigheten. Botten. De förutsagda värdena för tillväxt plottas mot hastighetsvärdena för obalans som avgränsar toleransprofilen; en proxy för metabolismens tolerans när den står inför den valda störningen.cistanche nz(B) Toleransprofil i jäst associerad med obalanser i cytosolen.

(C) Toleransprofil i jäst associerad med obalanser i mitokondrierna. Blå/röd skuggning representerar reducerade respektive oxiderade obalansregimer, och grå prickar indikerar värden som motsvarar ingen obalans eller extrema reduktiva/oxidativa obalanser som inte ger någon tillväxt. skadliga och dödliga snabbare än oxidativa regimer. I två fall (de konjugerade paren av cytosoliskt NADH eller mitokondriellt tioredoxin), förbättrar mild artificiell oxidation av paret tillväxten (Figur S1).

NADH/NAD*-störningar orsakar metabola syndrom som påminner om patologi

Jästs energimetabolism utan obalans motsvarar en karakteristisk aerob metabolism i närvaro av glukos (de odlingsförhållanden som studerats) där glykolys är kopplat till trikarboxylsyracykeln (TCA) och oxidativ fosforylering. Pentosfosfatvägen oxiderar glukos och tillhandahåller ribos-5P för nukleotidsyntes och NADPH-född reduktiv kraft för anabolism, medan anaplerotiska vägar lämnar TCA-cykeln, liknande de för glutaminmetabolism, används måttligt för att primärt mata pyrimidin och aminosyrasyntes. FBA gör det möjligt för oss att kvantifiera förändringar i dessa vägar och hur de så småningom detaljerar de metaboliska egenskaper som ligger bakom en viss obalansregim.

Specifikt visar figur 2A hur reduktiva obalanser av cytosoliskt NADH/NADH producerade en ökning av glykolytiskt flöde, en minskning av aktiviteten hos TCA-cykeln och elektrontransportkedjan och en ökning av glutaminmetabolismen. Denna pseudohypoxiska metaboliska signatur - i närvaro av syre - liknar anaerob metabolism, där glykolys är kopplat till alkohol- eller mjölksyrafermentering till skada för mitokondriella vägar; den syrehaltiga delen av pentosfosfatvägen stängs av och glutaminmetabolismen, en mer aktiv, kan omdirigeras för att producera pyruvat förutom att bidra till anabolism. Särskilt fångar denna fenotyp några egenskaper hos paradoxala utbytesmetabolismer som observerats i olika typer av cancerceller (Warburg-effekten) (Potter et al., 2016).

Figur 2. Fluxer av de viktigaste vägarna för energihantering som ligger bakom toleransprofilen i jäst (A) Cytosolisk NADH/NAD-obalans (överst) och flödesvärden för fem representativa vägar (nederst); i/glykolys (Glykolys, kärna), ii/Krebs cykel (TCA, rosa), ili/pentosfosfat (Penphos, grön), iv/oxidativ fosforylering (Oxphos, grå) och glutaminmetabolism (Glutamin, lila). De representerade flödesvektorerna är resultatet av ett medelvärde av flödet av alla reaktioner i den speciella vägen.

(B) Samma som (A) med avseende på mitokondriell obalans. Notera närvaron av negativa flöden i glykolys (panel A, botten) representerar ökad glukoneogenes. Se huvudtexten för detaljer.

Däremot uppvisade energimetabolismen som ligger till grund för oxidativ tolerans (med avseende på cytosolen, figur 2A) en mer aerobisk konfiguration men med egenheter, såsom en särskilt aktiv polyaminmetabolism; och extrema egenskaper, inklusive ökad glukoneogenes, oxidativ fosforylering och TCA-cykelaktivitet, såväl som ett mycket högt (upp till 12-faldig normal nivå) flöde genom pentosfosfatvägen. Det senare kan ändå vara en artefakt av skillnader i biomassans pseudo-reaktion, under mycket hög (efter 55 mmol/gDW/h) oxidativ obalans (se metoder S1).

När obalansreaktionen är lokaliserad i mitokondrierna producerade minskningen av NADH igen ett visst pseudohypoxiskt beteende, med en skillnad (Figur 2B). Fluxet genom glykolys och glutaminmetabolism ökade, med en åtföljande förlust av delarna av TCA-cykeln och pentosfosfatvägen. Men till skillnad från i det cytosoliska fallet ökade oxidativ fosforylering signifikant. Å andra sidan var den oxidativa sidan av mitokondriella profilen mer idiosynkratisk: glykolytisk aktivitet ökade parallellt med den i TCA-cykeln, men oxidativ fosforylering fungerade för det mesta på lägre nivåer än normalt, och glutaminmetabolismen var av liten betydelse,

Metabola syndrom är resultatet av en kompromiss mellan redoxbalans, biomassaproduktion och en ATP/NADH-avvägning

Vi identifierade flera nyckelelement på spel som formade de tidigare syndromen.cistanche penis storlekDen oxidativa störningen möttes av ett förvärrat aerobt svar som en kompromiss mellan att bibehålla tillväxten och buffra störningen av obalansen. Detta innebar omdirigering av flöde genom maximalt möjliga antal reaktioner som minskade NAD plus samtidigt som en global flödesfördelning som kunde generera biomassabeståndsdelar bibehölls. Dessa två mekanistiska element (perturbationsbuffring och biomassamaximering) är de mest relevanta kraven för optimeringsproblemet och tillräckliga för att beskriva toleransprofilens oxidativa regim.

Figur 3. Konkurrerande mekanismer orsakar det pseudohypoxiska beteendet hos jäst

(A) Balans mellan NADH-, ATP- och biomassaprekursorproduktion gynnar reaktionsmoduler som producerar så mycket ATP och så lite NADH som möjligt för att kompensera för konsekvenserna av reduktiva regimer, t.ex. användningen av glykolys till TCA. Notera här att lila pilar representerar ATP-produktion, gula pilar representerar NAD(H)-produktion och vita cirklar indikerar generering av biomassaprekursorer, (B) En NADH-benägen NADH/NADt-störning (x-axel) överlappas med en artificiell ADP fosforyleringsreaktion (y-axel) som kraftfullt introducerar reduktiv kraft i form av ATP i den obalanserade ämnesomsättningen. En grön färggradient representerar förhållandet mellan glykolytiskt och Krebs-cykelflöde normaliserat med dess normala värde (upp till 100-faldigt). Det kan inses att ADP-fosforylering minskar den pseudohypoxiska fenotypen och fördröjer viloläget.

Den reduktiva sidan krävde dock ytterligare en insikt. Eftersom mer och mer NADH binds till NADH-reaktioner som använder NADt och är direkt eller indirekt nödvändiga för att producera biomassabeståndsdelar blir mer och mer begränsade, så energimetabolism måste omdirigeras för att möjliggöra en förhöjd omvandling av NADH till NAD'och för att begränsa minskning av NAD' till NADH. Detta är fortfarande otillräckligt för att möta störningen, eftersom den mesta reduktionskraften i form av NADH är väsentligen värdelös för många metabola mål, reaktioner och tillväxt: energin som lagras i NADH måste omfördelas till ADP. Således måste metabolismen prioritera reaktionsmoduler som producerar så mycket ATP och så lite NADH som möjligt; den måste förlita sig på shuntar och vägar som har ett högt ATP/NADH-utbyte, t.ex. glykolys och oxidativ fosforylering.

Dessa resulterar bland annat i minskad TCA-cykel och ökat glykolytiskt flöde (Figur 3A). För att ytterligare utforska effekten av denna ATP/NADH-avvägning överlappade vi en reduktiv NADH/NAD-störning med en artificiell reaktion som tillåter fosforylering av ADP . Simuleringarna visade att det förhöjda förhållandet mellan glykolys och TCA-cykelflöde som kännetecknar reduktiv metabolism är beroende av ATP/NADH-utbytet

Figur 4. Toleranspoäng som en prediktor för kronologisk livslängd i jäst

(A) Toleransprofiler erhållna för jästmutanter; blå/röda sektorer av kurvan representerar den reduktiva/oxidativa regimen för NADH/NADH-ojämvikten.

(B) Samband mellan normaliserad toleranspoäng (proportionell mot bredden av obalansvärdena vid både oxidativa och reduktiva regimer, STAR-metoder) och kronologisk livslängd. Korrelationen förklarar ~30 procent av den totala variansen (R'= 0). 29, p-värde=3.2x 10-4, N= 41).

(C) Som ett alternativt sätt att se denna association fick vi ett histogram av regressionslutningsvärden erhållna från tiotusen slumpmässigt genererade associationer mellan toleranspoäng och livslängd. Från det här urvalet hittar vi endast 3 fall där sambandet mellan toleranspoängen och livslängdsdata är starkare än det som hittades (indikeras av den röda vertikala linjen).

(Figur 3B). Kraftig fosforylering av ADP minskar denna pseudohypoxiska signatur även vid mycket starka NADH-benägna obalanser.

Tolerans förklarar experimentella kronologiska livslängdsskillnader mellan olika jästmutanter

Vi frågade bredvid i vilken utsträckning toleransprofilen skulle kunna fungera som en prediktor för livslängd, med tanke på att redoxpar har diskuterats som potentiella livslängdsbestämningsfaktorer. Ett sätt att studera detta är att beräkna pro-filen i olika mutanter (Figur 4A) och sedan kvantifiera hur den motsvarar exakta livslängdsmått, normaliserade kronologiska livslängder (CLS), tillgängliga från experimentellt uppmätta mutantöverlevnadskurvor (Garay et al., 2014). CLS beräknas från dessa mutantöverlevnadskurvor som ökningen av överlevnad i stationär fas i förhållande till vildtypen.

I FBA simuleras mutationer i specifika gener genom att begränsa flödet av reaktionerna förknippade med dem genom booleska regler som relaterar varje kemisk reaktion till ORF som översätter för reaktionens enzym (STAR-metoder). För var och en av dessa mutanter beräknade vi en mutanttoleransprofil (Figur 4A) och använde summan av de absoluta obalansvärdena vid vilka tillväxthastigheten halveras (både i de reduktiva och oxidativa regimerna) som en skalär poäng för tolerans (STAR) metoder).

Vår mutantuppsättning begränsades dock av vissa restriktioner (STAR-metoder). Noterbart var vi oförmögna att urskilja skillnader i tolerans under 10 ppm av vildtypens värde utan att nå oöverkomliga beräkningstider, och många mutanter presenterade både försumbara skillnader i livslängd och försumbara skillnader i tolerans. Dessutom anses det allmänt att FBA är oförmöget att karakterisera förstärkning av funktionsdeletioner och, helt förutsägbart, översteg inga mutanttoleranser den för vildtypen.

Utöver dessa begränsningar kunde in silico-toleransprofilerna förklara -30 procent av den experimentellt uppmätta livslängdsvariabiliteten (Figur 4B, R2= 0.29, N=41,p-värde{{5 }}.2x 10-) med stor betydelse:10,000 randomiseringar av dataparen ledde till endast 3 instanser med en större regressionslutning(Figur 4C).

Konventionella näringsämnen möjliggör tolerans mot NADH/NADH-obalanser

Slutligen undersökte vi om specifika dietmetaboliter var särskilt avgörande för svaret på redoxobalans. I detta syfte använde vi ytterligare en funktion hos FBA-modeller, som är möjligheten att få tillgång till användningen av en viss metabolit (definierad som konsumtionshastigheten i STAR-metoderna vid steady-state). Vi undersökte hur denna hastighet förändrades med ökande värden på reduktiv och oxidativ NADH/NAD plus obalans.

Användningen var ganska linjär på båda sidor av profilen och för de flesta metaboliter. Således anpassade vi detta föränderliga mönster till en linjär modell och betraktade den (absoluta) lutningen som en skalär representant för motsvarande metabolitens relevans för att tolerera redoxobalans (Figur 5A). Bland de mest känsliga näringsämnena i iAZ900 märkte vi dietmetaboliter som är kända för att spela en avgörande roll för att reglera jästens livslängd, såsom acetat (Burtner et al., 2009), såväl som många som ökar livslängden experimentellt i jäst, maskar, eller till och med mänskliga celler (Madeo et al., 2018; Mishur et al., 2016) inklusive malat, hydroxibutyrat, spermidin eller oxaloacetat (figur 5B-5D, tabell S1).

Vissa näringsämnen var mer relevanta för tolerans mot NAD-reduktion, andra för NADHoxidation och några för båda dessa regimer. De viktigaste dietmetaboliterna för reduktiv tolerans var i ordningen acetat, beta-hydroxibutyrat (BHB), glutamat och glutamin (Figur 5B), medan den viktigaste för att tolerera NADH-oxidation var acetat, NADP plus, putrescin och spermidin (Figur 5D). Bland de som deltog från tolerans på båda sidor av profilen var den mest relevanta i ordningen acetat, glutamat, oxaloacetat och oxoglutarat (Figur 5C).

Vi övervägde metaboliska modeller i andra organismer för att ytterligare bekräfta vilka näringsämnen som är avgörande för svaret på obalanser (metoder S1, se även figur S2 för hur flöden av huvudvägarna förändras). Alla dessa främsta bidragsgivare förändrades, om än inte brett, med alfa-ketosyror, redoxpar, vissa vitaminer och vissa aminosyror som var väsentligt nödvändiga för att kontrollera NADH/NADt-störningar i C.elegans och den mänskliga rekonstruktionen. Den vanligaste reaktionen på redoxobalans i dessa organismer hänför sig till metaboliter som medierar pH-homeostas, såsom acetat, bikarbonat, bifosfat, natrium, vatten och andra liknande. På liknande sätt skiljer relevansen av glutamat, glutamin, aspartat, treonin, serin och glycin dem från andra aminosyror och de flesta metaboliter. Medelstora, oxiderade syror som oxoglutarat, malat och oxaloacetat spelar också en roll i toleransen konsekvent, vilket tenderar att göra biotin och vissa folater (se tabell S1 för en fullständig lista).

DISKUSSION

Vi föreslår här ett alternativt tillvägagångssätt för att förstå de breda biologiska konsekvenserna av förändringar i redoxpar. Detta tillvägagångssätt är baserat på in silico metaboliska modeller och introducerar begreppet toleransprofil som ett mått som kvantifierar den cellulära motståndskraften mot dessa förändringar.

Figur 5. Homeostatiska näringsämnen i jäst

(A) Exempel på användningsprofil för ett näringsämne med dess motsvarande reduktiva (blå) och oxidativa (röda) linjära regression kännetecknad av sluttningar m respektive m (i absoluta värden). Vi inkluderade den cytosoliska toleransprofilen i bakgrunden som referens.

(B) Linjära regressionslutningar (m,) för de fyra bästa homeostatiska näringsämnena i reduktiv mening av NADH/NAD plus störning.

(C) Linjära regressionssluttningar för de topp4 näringsämnena som är homeostatiska i båda bemärkelserna av störningen; Blå: Reduktiv linjär regressionslutning; Röd: Oxidativ linjär regressionslutning.

(D) Linjära regressionssluttningar (m.) för de 4 bästa homeostatiska näringsämnena i oxidativ mening av NADH/NAD plus störning.

De metaboliska justeringarna som ligger till grund för profilen avslöjar närvaron av en pseudohypoxisk fenotyp associerad med de reduktiva NADH-regimerna. Denna fenotyp påminner om några uppenbarligen paradoxala energimetabolismer med låg avkastning som observerats i cancer (Warburg-effekten) och känns även igen i jäst (Crabtree-effekt) och bakterieceller (overflow-metabolism) (Basan et al., 2015; Mori et al., 2016; Potter et al.,2016). Möjligheten att detta beteende kan orsakas av resursallokeringsbegränsningar som uppstår vid jämförelsevis hög tillväxt eller glukosupptagningshastighet har framförts under de senaste åren (Basan et al, 2015; Mori et al, 2016). Den pseudohypoxiska fenotypen vi observerar är dock oberoende av tillväxthastighet och glukosupptag, och i själva verket förekommer den samtidigt med låga tillväxthastigheter (STAR-metoder). Vi har visat att dess orsak ligger i en grundläggande ATP/NADH-avvägning, en logik som stöds av en nyligen genomförd experimentell studie (Maldo-nado och Lemasters, 2014).

Dessutom tyder vår flödesanalys på att ATP-underhåll kan påverkas negativt av reduktiv NADH/NAD plus ojämvikt. Ökad NADH tros vara ett samband mellan minskad ATP-tillgänglighet, eftersom försämring av oxidativ fosforylering kan resultera i både en ökning av NADH/NAD plus och en minskning av ATP/ADP. Vi visar att extrinsiskt genererade NADH-obalanser kan vara en orsak till minskad energitillgänglighet genom ortogonala metaboliska mekanismer, även medan oxidativ fosforylering fungerar över normala nivåer. Detta är mycket betydelsefullt i samband med åldrandeforskning, eftersom minskad energitillgänglighet och ATP/ADP-förhållanden är ett bevarat kännetecken för cellulärt åldrande och åldersrelaterade patologier (Moreira et al., 2003; Pall, 1990; Yaniv et al., 2013 ) och kan främja ackumulering av giftigt avfall och förlust av proteostas (ett annat kännetecken för åldrande) genom att minska proteinomsättningen och därför öka proteinets halveringstid (Anisimova et al., 2018).

Vi strävar efter att fastställa giltigheten av vårt ramverk som en prediktor för livslängd och för metaboliter i kosten som buffrar redoxobalanserna. Tolerans förutser cellulär livslängd, med vissa begränsningar på grund av tillgänglig datauppsättning. Med kontroll för dessa begränsningar (Garay et al., 2014) finner vi att de resulterande korrelationerna fortfarande är tillräckligt med bevis för ett samband mellan varianserna av tolerans och CLS.

Tvärtemot våra förväntningar är den mest tydliga lärdomen från vår analys av metaboliter i kosten att den huvudsakliga substansen som driver svaret på obalansen inte är särskilt beroende av NADt-räddningsnätverket. De översta "homeostatiska näringsämnena" är faktiskt mellanprodukter i TCA-cykeln och andra delar av central metabolism vars verkan är mycket mer genomträngande än NAD-prekursorer. Dessutom är relevansen av reaktioner som reducerade eller oxiderade NAD(H) samtidigt som de fungerade som broar mellan redoxparet och huvudmetaboliska vägar vida överlägsen den för NADt-räddningsbegränsande enzymer (såsom nikotinamidmononukleotidadenyltransferas).

Till exempel poängsätter oxaloacetat och oxoglutarat i jästmodellen bland de fyra mest effektiva metaboliterna som ligger till grund för tolerans i både reduktiva och oxidativa förhållanden, en konsekvent egenskap som bekräftar tidigare experimentella resultat (Chin et al., 2014; Williams et al., 2009) . Andra betydande metaboliter inkluderar hydroxibutyrat som konsekvent har visats öka livslängden, reglera NAD och förmedla svaret på svält (Edwards et al., 2014; Newman och Verdin, 2014), och spermidin, som tillhör familjen polyaminer och är känt för att spela roller i åldersrelaterade processer, autofagi och DNA-skydd (Eisenberg et al,2009; Minois et al.2011: Pietrocola et al.2015).

Vi använde C.elegans och mänskliga modeller för att stärka den tidigare utvärderingen och avslöjade en bredare bild som är centrerad kring pH-homeostas, redoxpar och TCA-cykeln. Detta tyder på att sätten på vilka pH (Burtner et al., 2009) och NADH-obalans (Ayer et al., 2014) bestämmer åldrande i celler är djupt sammanflätade. Utöver pH är de mest genomgripande och viktiga näringsämnena för att reglera NADH/NAD plus obalans alfa-keto-syrorna oxaloacetat och oxoglutarat, deras aminerade former och andra mitokondrierelaterade metaboliter som malat, pyruvat och fumarat, dvs. redoxbalanskontroll är TCA-cykeln.

Än idag är mekanismerna genom vilka aminosyror och TCA-cykelintermediärer påverkar livslängden i jäst och C. elegans oklara. Metaboliter som malat, oxaloacetat, fumarat, valin, serin eller treonin kan verkligen öka livslängden för organismer, men de processer som leder till dessa effekter är omdiskuterade och komplexa (Edwards et al., 2013, 2015). Våra resultat indikerar att en gemensam förklaring för alla dessa livslängdsfenomen ligger i näringsämnenas effekt på cellers förmåga att tolerera störningar i NADH/NAD plus-förhållandet.

Man skulle dock kunna hävda att vissa av metaboliterna som betraktas verkar självklara eftersom de trots allt är involverade i reaktioner som interkonverterar NADH och NAD plus . Frågan är då varför andra metaboliter som också ser a priori självklara ut inte kommer fram i våra resultat. Svaret ligger i mekanismerna som säkerställer realistiska förutsägelser i FBA. För att ett näringsämne ska vara "homeostatiskt" mot redoxobalans måste det inte bara öka NADH- eller NADt-produktionen utan stå centralt i en väg eller modul med ett högt ATP/NADH-utbyte och/eller kapacitet att tillhandahålla biomassabeståndsdelar.

Slutligen är ytterligare två insikter från våra resultat anmärkningsvärda. Å ena sidan föreslår de att som svar på redoxobalanser är metabola nätverk redo att i ökande grad producera och/eller konsumera vissa metaboliter som tolkas av signalnätverk som utesluter behovet av autofagi, antioxidant- och hormetiska svar, såväl som många som överskrider eller tillskott har visat sig öka livslängden och/eller på annat sätt efterlikna effekterna av kalorirestriktion (CR), på ett sätt som är beroende av signalvägarna som är inblandade i CR-medierad livslängdsförlängning. Detta förstärker tidigare bevis som kopplar CR och NADH/NADH-balans som en del av samma livslängdsförlängande och hälsofrämjande process (Lin et al., 2004).

Å andra sidan visar vår studie att som svar på de förändrade förhållandena, använder ämnesomsättningen också i ökande grad vissa ämnen som kan skada cellen kemiskt, såsom acetat, putrescin eller acetaldehyd; såväl som några som kan främja tumörbildning genom metaboliska omledningar, såsom glutamin, succinat och fumarat (Sciacovell et al., 2016). Detta skulle då delvis kunna förklara patologierna kopplade till redoxobalans och de makroskopiska processer den är involverad i, såsom degenerativa och onkologiska sjukdomar: om redoxobalans måste buffras med substanser som är toxiska, så är dessa substanser troligen mekanismer för de patologier som samverkar. -förekommer med redoxobalans.

Vi inser att vårt förhållningssätt till redoxobalans kan förstås som en ovanlig variant av studiet av metaboliskt nätverks robusthet och att det kan anklaga vissa varningar som lämnar gott om utrymme för förbättringar. När det gäller robusthet, definierade studier som använder FBA traditionellt det som en förändring av den objektiva lösningen (typiskt tillväxt) som svar på varierande minskningar av reaktionshastigheterna, t.ex. (Edwards och Palsson, 2000), snarare än på en viss störning (redoxobalans) ) i metaboliterna som vi gör. När det gäller begränsningarna i vår analys, kan de kopplas till inneboende begränsningar av FBA själv, som frånvaron av regulatoriska gener. I slutändan beror tillförlitligheten av våra resultat på den prediktiva kraften hos de metaboliska rekonstruktionerna: de nuvarande jästmodellerna är prediktiva och avancerade, men de är inte perfekta (Heavner och Price, 2015), och fortfarande är de mycket bättre än till och med de mest exakta flercelliga rekonstruktioner tillgängliga. Trots alla dessa farhågor finns det gott om bevis som motiverar den ökande troheten hos metabola modeller till naturligt beteende.

För närvarande tenderar den rådande forskningen att ignorera de potentiella negativa konsekvenserna av att urskillningslöst minska NADH/NADH-förhållandet. Detta beror delvis på de lovande fördelarna som är ett resultat av de milda minskningarna som uppnåtts experimentellt, vilket inkluderar minskning av neoplastiska fenotyper, livslängd och förlängning av hälsan. Det finns dock framväxande bevis som rekommenderar extrem försiktighet när det gäller dessa positiva resultat (Gujarat al., 2016; Hong et al., 2019), såväl som en solid, experimentellt upprätthållen teoretisk ram som förutsäger negativa konsekvenser av minskande NADH/NADH-förhållanden utöver en tröskel (Aon et al.,2010). Våra NADH/NADt obalanstoleransprofiler tillgodoser denna framväxande bild, eftersom milda oxidativa avvikelser kan vara fördelaktiga, men högre är lika skadliga som den motsatta ytterligheten.

Mer specifikt antyder våra toleransprofiler att utöver att orsaka kemiska eller fysiologiska problem, måste både låga och höga NADH/NADH-förhållanden också mötas med rena metaboliska nackdelar, inklusive minskad energitillgänglighet och/eller biosyntetisk produktion. Dessutom, och som vi har påpekat, verkar de begränsade experimentella observationer som finns tillgängliga på några av de frågor vi tar upp påminna om de resultat vi redovisar här.

Studiens begränsningar

Resultaten som presenteras här skulle förbättras när de använda modellerna förfinas ytterligare. Vårt arbete lider också av de inneboende begränsningarna hos FBA som teknik. Till exempel är dynamisk information avstängd, med tanke på att de för närvarande tillgängliga versionerna av dynamisk flödesanalys är för begränsade i omfattning. På liknande sätt minskar bristen på implicita energibegränsningar i flödesbalansen dess förutsägbarhet för höga tillväxthastigheter. Denna svaghet har motiverat tillägget av tekniker som CAFBA, som vi ansåg i manuskriptet. Slutligen skulle det vara intressant att få tillgång till regulatorisk information, som enkelt kan kontrolleras och slås på eller av. För närvarande finns det inga standardiserade metoder för att implementera genreglering i FBA. Tillämpningen av reaktionsaktivitetspoäng på begränsningsgränser är lovande i detta avseende.

Den här artikeln är extraherad från iScience 24, 102697, 23 juli 2021