Totala glykosider och polysackarider av Cistanche Deserticola förhindrar osteoporos

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Fujiang Wang 1, Pengfei Tu, Kewu Zeng *, Yong Jiang **

ABSTRAKT

Etnofarmakologisk relevans:Traditionell kinesisk medicin Cistanche deserticola YC Ma har effekten att "tonifiera njure och stärka ben". De specifika aktiva extrakten av C. deserticola och mekanismerna för behandling av osteoporos är dock inte klara.

Syfte med studien:Vi ville identifiera de effektiva komponentextrakten av C. deserticola för behandling av osteoporos och de potentiella mekanismerna.

Material och metoder:Vår grupp undersökte extrakten av C. deserticola med anti-osteoporotisk aktivitet, inklusive totala glykosider (TGs), polysackarider (PSs) och oligosackarider (OSs) i senescensaccelererade musbenägna 6 (SAMP6) möss. Goldner's Trichrome, Van Gieson's (VG), Safranin O-Fast Green-färgning och von Kossa-färgning utfördes för att undersöka benstrukturbildning och kalciumavlagringar. Serum uppsamlades för att detektera biokemiska markörer. Benmikroarkitektur detekterades med mikro-CT. Uttryck av benmorfogenetiskt protein-2 (BMP-2), osteokalcin (OCN), osteoprotegerin (OPG), receptoraktivator av nukleär faktor-K B-ligand (RANKL), p-glykogensyntetaskinas{{11 }} (p-GSK-3) och p- -catenin analyserades med western blotting och immunhistokemi.

Resultat:TGs och PSs förbättrade benhistopatologiska skador, främjade bildningen av nytt ben, kollagenfiber och kondrocyter och accelererade kalciumavlagringarna. Dessutom förändrade de anmärkningsvärt biomarkörerna för benomsättning och förbättrade effektivt benmikroarkitekturen. Den ytterligare mekanismstudien visade att TG:er och PS:er signifikant minskade uttrycken av RANKL, p- -catenin, samt uppreglerade uttrycket av BMP-2, OCN, OPG och p-GSK{{ 4}} (Ser9).

Slutsats:Resultaten av denna studie tyder på att TG och PS kan främja osteoklastogen benbildning och förbättra benmikrostrukturskada hos SAMP6-möss, och deras terapeutiska effekt på osteoporos är via aktivering av Wnt/-catenin-signalvägen.

Cistanche kanfrämja osteoklastogent benbildande och förbättraskada på benets mikrostruktur.

1. Introduktion

Osteoporos är en vanlig sjukdom hos äldre individer som allvarligt äventyrar mänsklighetens hälsa (Ye et al., 2020). Osteoporospatienter kan vara helt asymtomatiska före frakturer, därför är effektiv förebyggande och behandling av osteoporos av största vikt (Tella och Gallagher, 2014).

Forskning visar att ökad benresorption och minskad benbildning ger upphov till en obalans i benombyggnaden, vilket leder till osteoporos (Sims och Gooi, 2008). Osteoblaster och osteoklaster är två celltyper som är kritiska för benbildning och resorption. Wnt/-catenin-vägen är väsentlig för tillväxt, utveckling och underhåll av benvävnad (Cadigan och Nusse, 1997), och spelar också en nyckelroll för att reglera differentiering av benmärgsstromaceller (BMSC) från beaglehundar (Jing et al. , 2018). GSK-3 förhindrar nedbrytningen av -catenin. -Catenin kommer därefter in i kärnan, och sedan kan det associeras med T-cellsfaktorn/lymfoidförstärkarbindningsfaktorn och reglerar uttrycket av Wnt-målgener. Under tiden har det visat sig att Wnt/-catenin-signalering minskar osteoklastdifferentiering genom att stimulera produktionen och utsöndringen av OPG (Glass et al., 2005), som är en naturlig antagonist till RANKL (Lacey et al., 1998). OPG spelar en viktig reglerande roll vid benbildning och benresorption. I alla fall ökar deletion av -catenin i osteoklaster osteoklastantal och benresorption och minskar benmassa (Wei et al., 2011). Benresorptionsinhibitorer och benbildningspromotorer används huvudsakligen vid behandling av osteoporos. Med tanke på att biverkningarna av de för närvarande använda läkemedlen i kliniska studier med exakt effekt också är uppenbara, är det angeläget att leta efter läkemedlen med färre biverkningar.

Cistanche deserticola YC Ma (C. deserticola) är en av ursprungsväxterna till den allmänt använda toniska traditionella kinesiska medicinörten Cistanches Herba, Roucongrong på kinesiska, för behandling av flera sjukdomar, såsom njurbrist, kvinnlig infertilitet och senil förstoppning för mer än 1000 år i Kina (National Pharmacopoeia Committee, 2020). Enligt teorierna om traditionell kinesisk medicin (TCM), "njurdominerande ben" och "tonifierande njurstärkande ben", användes C. deserticola för att behandla benskörhet. Studier visade att C. deserticola kan förbättra serumnivåerna av alkaliskt fosfatas (ALP), osteokalcin och kalciumjoner, främja uttrycket av BMP-2 i osteoblaster hos råttor (Gang et al., 2018). Dessutom har studier visat att C. deserticola utövade skyddande effekter mot RANKL-inducerad osteoklastogenes (Zhang et al., 2019). Även om C. deserticola har en terapeutisk effekt på osteoporos, är dess specifika aktiva komponenter inte särskilt tydliga. Det är av stor betydelse att utforska de effektiva komponenttyperna av C. deserticola för behandling av osteoporos och relaterade mekanismer.

Därför genomförde vi denna studie för att avgöra om det fanns några fördelaktiga effekter av extrakten som innehåller olika typer av kemiska beståndsdelar från C. deserticola på SAMP6-möss. Resultaten kan ge exakta riktlinjer för klinisk tillämpning av C. deserticola samt avslöja den materiella grunden för C. deserticola för behandling av osteoporos.

2. Material och metoder

2.1. Kemikalier och reagens

Cistanche deserticola YC Ma köptes från Mandela Biotechnology Co., Ltd (Alashan, Inre Mongoliet, Kina), och sedan identifierade en person från författarna dem (PF Tu). TGs, PSs och OSs bereddes som den tidigare nämnda metoden (Gao et al., 2015). Beståndsanalys av varje extrakt utfördes med användning av HPLC enligt rapporten. (Li et al., 2019; Wang et al., 2020). H&E, Goldners trikromfärgning, Van Giesons (VG) färgning och Safranin O-Fast Green-kit köptes från Boster (Hubei, Kina). Kanin-anti-mus BMP-2 (ab14933), OCN (ab93876), OPG (ab183910) och RANKL (ab216484) köptes från Abcam (Cambridge, Storbritannien). Cell Signaling Technology var källan till kanin-anti-mus p-GSK-3 (Ser9) (#5558), GSK3 (#12456), -catenin (#13727) och p- -catenin (# 4176). Sekundära antikroppar köptes från Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Peking, Kina).

Högkvalitativt cistancheextraktfrånChengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd

2.2. Djur

5-månadsgamla kvinnliga åldringsaccelererade mus/resistenta 1 (SAMR1) och SAMP6-möss erhölls från Vital River Laboratory Animal Technology (Peking, Kina). Alla djurmanipulationer utfördes i enlighet med riktlinjerna utfärdade av den institutionella kommittén för djurvård och användning vid Peking University Health Science Center.

2.3. Drogadministration

Mössen separerades slumpmässigt i följande fem grupper: SAMR1-grupp (normal koksaltlösning, n=10); SAMP6-grupp (normal koksaltlösning, n =10); TGs-grupp (400 mg/kg, n=10); PSs-grupp (400 mg/kg, n=10) och OSs-grupp (400 mg/kg, n=10) (Gao et al., 2015). Alla läkemedel administrerades ig och dagligen i 12 veckor.

2.4. Goldners trikromfärgning, H&E-färgning, SafraninO-Fast Green-färgning och Van Giesons (VG)-färgning

Efter 12 veckor avlägsnades lårbenen snabbt och fixerades med 10 procent etylendiamintetraättiksyra (EDTA) i 7 dagar vid 4 ◦C. Därefter sektionerades lårbenen i en skiva (5 μm) och färgades med Goldner Trichrome, Van Gieson (VG), SafraninO-Fast Green och H&E-färgning enligt tillverkarens instruktioner. Bilderna observerades med ett ljusmikroskop (Leica, Solms, Tyskland).

2.5. Mätning av nivåerna av BGP, BALP, P1NP, PICP, ALP, S-CTX, TRACP, U-CTX, U-NTX, D-Pyr och Pyr

Koncentrationerna av benglaprotein (BGP), benspecifikt alkaliskt fosfatas (BALP), prokollagen typ 1 N-terminal propeptid (P1NP), prokollagen typ I C-terminal propeptid (PICP), alkaliskt fosfatas (ALP), S–C -telopeptid av typ-I-kollagen (S-CTX), tatratresistent surt fosfatas (TRACP), U-C-telopeptid av typ-I-kollagen (U-CTX), U-N-telopeptid av typ-I- kollagen (U-NTX), D-pyridinolin (D-Pyr) och pyridinolin (Pyr) bestämdes genom enzymkopplad immunosorbentanalys (Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd, Jiangsu, Kina).

2.6. Von Kossa-färgning

Lårbensskivorna nedsänktes i 1 procent silvernitrat i 30 min under en intensiv solstråle och tvättades sedan tre gånger med avjoniserat vatten. Därefter tillsattes 5 procent natriumtiosulfat under 5 minuter för att avlägsna oreagerat silver. Kalciumfosfatsalterna visualiserades som svart färgning. För att kvantitativt analysera kalciuminnehållet i lårbenet användes Image-Pro Plus version 6.0 och Adobe Photoshop.

2.7. Mikrodatortomografianalys

Alla lårbensprover skannades vid 9 μm upplösning av en mikro-CT-skanner (PerkinElmer, MA, USA). Ytterligare analys utfördes med programvaran Analyze12.0 för att beräkna benmineraltätheten (BMD), benvolym/total volym (BV/TV), trabekulärt antal (Tb. N), trabekulär separation (Tb. Sp), trabekulär tjocklek (Tb. Th) och vävnadsmineraldensitet (TMD). Tredimensionella bilder rekonstruerades med CTVox programvara (PerkinElmer, MA, USA).

2.8. Ansamling av tetracyklin och kalcein

Varje djur gavs intraperitonealt 25 mg/kg tetracyklin och 5 mg/kg kalcein på den 13:e dagen respektive 3:e dagen före dödshjälp. Tetracyklin- och kalceinackumulering undersöktes med Vectra® Polaris™ Automated Quantitative Pathology Imaging System (PerkinElmer, MA, USA). Avståndet mellan tetracyklin och kalcein kan observeras av Image-Pro Plus programvara version 6.0.

2.9. Western blotting-analys

Femurvävnader homogeniserades och lyserades i RIPA-lysbuffert. Proteinkoncentrationen bestämdes med användning av ett bicinchoninsyra (BCA) proteinanalysreagenskit (Beijing TransGen Biotech, Peking, Kina). Totala proteiner laddades på 10 procent eller 12 procent SDS-PAGE-geler och överfördes sedan till ett nitrocellulosamembran. Membranet blockerades och inkuberades sedan över natten med primära antikroppar och GAPDH (Los Angeles, USA) vid 4 ◦C följt av inkubation med sekundär antikropp. Analysen av proteinband analyserades med användning av Tanon 5200 Multi (Shanghai, Kina).

2.10. Immunhistokemisk analys

Femurvävnadssektioner inkuberades med de primära antikropparna vid 4 ◦C. Polyklonala antikroppar mot BMP-2, OCN, OPG och RANKL späddes till 1:200 respektive 1:100. Sekundär antikropp mus anti-kanin IgG (1:200) vid 37 ◦C i 1 timme. Använder Vectra® Polaris™ Automated Quantitative Pathology Imaging System (PerkinElmer, MA, USA). För att kvantitativt analysera uttrycket av proteinet användes Image-Pro Plus mjukvaruversion 6.0 och Adobe Photoshop.

2.11. Statistisk analys

Resultaten uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse. Envägs ANOVA utfördes när man jämförde de olika grupperna. SPSS-programvaruversion 22.0 användes för statistisk analys, och P < 0.05="" ansågs="" vara="" statistiskt="">

cistanche reddit

3. Resultat

3.1. TG:er och PS:er förbättrar benhistopatologiska skador och främjar bildning av kollagenfiber och kondrocyter hos SAMP6-möss

Den patologiska lårbensskadan kan observeras genom H&E-färgning. De histomorfologiska strukturerna hos ben i SAMR1-gruppen ordnas regelbundet. Emellertid skadades ovan nämnda benstrukturer i SAMP6-gruppen. Morfologiförändringarna i TG- och PSs-grupper var mindre än de i SAMP6-gruppen. OSs behandlingsgruppen visade dock ingen signifikant förbättring för morfologiförändringarna (Fig. 1A). Goldners Trichrome, Van Gieson's (VG) och Safranin O Fast Green-färgning gjordes för att avslöja benstrukturen. Resultaten visade att det nya benet, kollagenfibern och kondrocyterna i TG- och PSs-grupper förbättrades jämfört med SAMP6-gruppen. OSs behandlingsgruppen visade dock ingen signifikant förbättring för förändringar i benstrukturen (Fig. 1B-D).

Fig. 1. TGs och PSs förbättrar histopatologisk skada i SAMP6-möss.

3.2. TGs och PSs förändrar biomarkörer för benomsättning i SAMP6-möss

När osteoporos inträffade kommer nivåerna av benbildningsbiomarkörer att minska signifikant, såsom serum BGP och PICP. Däremot ökade biomarkörnivåerna associerade med benresorption anmärkningsvärt, inklusive serum TRACP och S-CTX (Fig. 2). Uppmuntrande nog kunde TGs och PSs grupper vända nivåerna av BGP, BALP, P1NP, PICP, ALP, S-CTX, TRACP, U-CTX, U-NTX, D-Pyr och Pyr, men OS kunde inte.

Fig. 2. Effekter av TG och PS på biomarkörer för benomsättning i SAMP6-möss.

3.3. TGs och PSs främjar ny benbildning och kalciumavlagring i SAMP6-möss

För att testa om benbildning och avsättning av fosfatmineraler kan främjas av TGs, PSs och OSs-behandling, utfördes tetracyklin-kalceinmärkning och Von Kossa-färgning. Resultaten visade att ny benbildning hos SAMP6-möss var signifikant lägre än hos SAMR1-möss, medan TGs och PSs signifikant främjade bildningen av nytt ben (Fig. 3A). Von Kossa-färgningen avslöjade att mycket kalcium deponerades i TGs och PSs behandlingsgrupper (Fig. 3B).

Fig. 3. TGs och PSs främjar ny benbildning och mineralavsättning i SAMP6-möss.

3.4. TGs och PSs förbättrar benmikroarkitekturen i SAMP6-möss

Benmikroarkitekturen detekterades med mikro-CT. Jämfört med SAMR1-möss hade SAMP6-möss mer försämrad mikroarkitektur, medan bentillståndet hos möss behandlade med TG och PS under 12 veckor förbättrades (Fig. 4). Vi fann också att indexen för BMD, BV/TV, Tb.N och Tb. Th reducerades och indexen för Tb. Sp och TMD ökade hos SAMP6-möss, jämfört med de hos SAMR1-möss. TG och PS ökade signifikant BMD, BV/TV, Tb. N, Tb. Th och minskade Tb. Sp och TMD jämfört med SAMP6-möss. Inga signifikanta förändringar observerades dock i OSs-gruppen.

3.5. TG:er och PS:er ändrar BMP-2-, OCN-, OPG- och RANKL-uttryck i SAMP6-möss

Vi undersökte proteinuttrycken för BMP-2, OCN, OPG och RANKL. TGs och PSs inducerade den anmärkningsvärda uppregleringen av BMP-2, OCN och OPG, medan uttrycket av RANKL nedreglerades (Fig. 5). Det fanns dock ingen signifikant skillnad i OSs-terapigruppen.

Fig. 4. Effekter av TG och PS på benmineraltäthet och benmikroarkitektur.

3.6. TG:er och PS:er ändrar uttrycken p-GSK-3 (Ser9) och p- -catenin i SAMP6-möss

För att förstå mekanismerna för TGs och PSs som främjar osteoblastogenes, mättes uttrycken av p-GSK-3 (Ser9) och p- -catenin i SAMP6-möss benvävnader med hjälp av Western blotting (Fig. 6). Resultaten visade att TG- och PSs-behandlingar påtagligt förbättrade uttrycket av p-GSK-3 (Ser9) och minskade uttrycket av p- -catenin i lårbenet jämfört med SAMP6-gruppen. Emellertid visade OSs-behandlingsgruppen ingen signifikant förändring.

4. Diskussion

I det aktuella arbetet använder SAMP6 och SAMR1 möss för att hitta de effektiva komponenterna från C. deserticola mot osteoporos. Tre extrakt från C. deserticola användes för att utvärdera de terapeutiska effekterna, såväl som de möjliga mekanismerna. Dessutom analyserades uttrycken av RANKL, OPG, OCN och BMP-2 såväl som andra benresorptionsregulatorer. Jämfört med SAMP6-gruppen kan TG och PS förbättra den histopatologiska skadan av ben, samt främja bildningen av nytt ben, kollagenfiber, kondrocyter och kalciumavlagring. Under tiden kan båda förändra biomarkörerna för benomsättning och effektivt förbättra benmikrostrukturen. Emellertid observerades inga skyddande effekter för OSs-behandling.

Fig. 5. TG och PS främjar uttrycken av BMP-2, OCN och OPG och minskar uttrycket av RANKL.

TCM har använts i stor utsträckning för att lindra symtom på många sjukdomar som osteoporos. lindra olika symtom på sjukdomar inklusive osteoporos. Många anti-osteoporotiska bioaktiva föreningar har identifierats från dussintals naturliga kinesiska medicinska örter som vanligtvis används för att tonifiera njurar samt bevara njuressens (Xu et al., 2017; Liu et al., 2018). C. deserticola har en relativt hög säkerhet och ett brett utbud av terapeutiska funktioner för behandling av njurbrist. Många forskningsstudier har upptäckt de terapeutiska effekterna av extrakten av C. deserticola på osteoporos (Li et al., 2012; Liang et al., 2013; Song et al., 2018).

Benbildande osteoblaster och benresorberande osteoklaster, som kom från differentieringen av multipotentiella mesenkymala stamceller (MSC), är terminalt differentierade celler med kort livslängd (Teitelbaum och Ross, 2003). Båda behöver kontinuerligt ersättas med nya som kommer från stamceller (Long, 2011). Wnt/-catenin signalväg, som spelar en viktig roll i differentieringen av benvävnader, stimulerar osteoblastproduktion genom att främja orienteringen och differentieringen av multipotentiella MSC till osteoblaster (Rodda och McMahon, 2006). Dessutom förhindrar Wnts apoptos av mogna osteoblaster och förlänger därigenom deras livslängd genom både -catenin-beroende och oberoende vägar (Almeida et al., 2005). Därför spelar Wnt/-catenin-signalvägen en viktig roll för att klargöra patogenesen av osteoporos. I föreliggande experiment användes SAMP6-möss för att undersöka effektiviteten av anti-osteoporotika från olika C. deserticola-extrakt. TG:er och PS:er nedreglerade signifikant nivåerna av RANKL och p- -catenin och uppreglerade uttrycken BMP-2, OCN, OPG och p-GSK-3. Sammanfattningsvis var den terapeutiska effekten av TG och PS på SAMP6-möss huvudsakligen genom att aktivera Wnt/-catenin-signalvägen.

Eftersom överdriven absorption av osteoklaster är en viktig orsak till osteoporos, kan faktorerna kopplade till aktivering och differentiering av osteoklaster anses vara viktiga syften för att förhindra benförlust (Takatsuna et al., 2005). I vår studie var uttrycket av RANKL framträdande nedreglerat, samtidigt kunde nivån av OPG uppregleras av TGs och PSs. Det har dokumenterats väl att processen för benbildning och ombyggnad av osteoblastcelldifferentiering huvudsakligen kännetecknas av ökade uttryck av BMP-2 och OPN (Canalis, 2009). I denna studie fann vi att TG:er och PS:er av C. deserticola ökade BMP-2- och OPG-uttryck och förbättrade benmineralisering. Därför medierar TG och PS benbildning genom att uppreglera BMP-2 och OPN och nedgulera RANKL.

Benbildningsmarkörer återspeglar aktiviteten hos benbyggande celler, samma benresorptionsmarkörer återspeglar aktiviteten hos osteoklaster. Mikroarkitekturen försämras som ett resultat av förändrade benomsättningsmarkörer. I vår studie reducerades benresorptionsmarkörer (S-CTX, TRACP, U-CTX, D-Pyr, U-NTX, Pyr) signifikant i TGs och PSs-grupperna, tvärtom benbildningsmarkörerna (BGP, BALP , P1NP, PICP, ALP) ökar anmärkningsvärt. Därför kan man se att TG och PS från C. deserticola främjar återuppbyggnaden av benskörhet.

Wnt/ -catenin-vägen stimulerar uttrycket av osteoblastdifferentieringsmarkörer och mineralisering, samtidigt som det aktiverar uttrycket av master-osteogena faktorn BMP-2 i osteoblaster (Zhang et al., 2013). Dessutom ökar -catenin uttrycket av OPG i osteoblasten, vilket indirekt undertrycker osteoklastdifferentiering genom att hämma benresorption (Baron och Kneissel, 2013). Vår nuvarande studie visar att TG och PS signifikant uppreglerar p-GSK-3 och nedreglerar nivån av p- -catenin. Dessa resultat stöder slutsatsen att funktionen av TGs och PSs på anti-osteoporotiska regleras genom att aktivera Wnt/-catenin-signalvägen.

Vår tidigare HPLC-analys visade att fem fenyletanoidglykosider inklusive echinakosid, cistanosid A, acteosid, isoacteosid och 2′-acetylacteosid var huvudkomponenterna i TGs (Li et al., 2019; Shi et al., 2019). Strukturerna för ovanstående fem fenyletanoidglykosider var alla rika på fenoliska hydroxylgrupper, som är ansvariga för antioxidantegenskaperna hos C. deserticola (Chen et al., 2016). Det har rapporterats att en förbättring av antioxidantsystemet kan förhindra benförlust, så dessa fenyletanoidglykosider kan vara de potentiella aktiva komponenterna i C. deserticola som är ansvariga för den anti-osteoporotiska aktiviteten. Det finns rapporter om att echinakosid och acteosid kan förbättra de typiska patologiska egenskaperna för osteoporos, såsom förbättrad benkvalitet och total lårbens-BMD, främja benbildning och hämning av benresorption (Chen et al., 2020). Dessutom har echinakosid en slående anti-osteoporotisk effekt (Li et al., 2013). Tidigare studier visade att cistanosid A kunde främja benbildning och förhindra benresorption genom att hämma NF-KB och aktivera PI3K/Akt-vägar (Xu et al., 2017). Den anti-osteoporotiska effekten av C. deserticola polysaccharides har inte rapporterats. Andra studier har dock visat att astragalus-polysackarider kan undertrycka uttrycket av RANKL, öka serum OPG-nivån och slutligen blockera osteoklastdifferentiering (Huo och Sun, 2016; Hwang et al., 2018). OS av C. deserticola består huvudsakligen av mannitol, betain, fruktos, glukos och sackaros (Shi et al., 2019), som inte har någon rapport för den anti-osteoporotiska aktiviteten, därför har OSs ingen terapeutisk effekt på osteoporos. Sammanfattningsvis är TG och PS de aktiva komponenterna i C. deserticola för effekten av anti-osteoporos.

Cistanche herba kompletterar pulverhar enanti-osteoporos effekt.

För mer information, klicka här.

5. Slutsatser

Sammanfattningsvis kan TG och PS från C. deserticola förbättra benbildningen hos SAMP6-möss genom att reglera Wnt/-catenin-signalvägen men inte OS. I framtiden kan TG och PS bli lovande benskyddande terapeutiska medel för osteoporos.