Förbättra top-down proteomik i hjärnvävnad med FAIMS del 3

En omedelbar och uppenbar observation är att ju högre abundanspercentilen är, desto högre är sannolikheten för identifiering med TDP. Med andra ord, TDP identifierar mestadels mycket rikliga proteiner.

När vi åldras upplever många att deras minne har försämrats. Detta är ett vanligt fenomen, särskilt efter att vi har upplevt långvarig psykisk stress, sömnbrist och obalanserad kost.

Men visste du att ett sätt att hjälpa oss att förbättra vårt minne är att öka intaget av protein i högt överflöd? Protein i hög överflöd är rikt på aminosyror, som kan syntetisera en molekyl som kallas neurotransmittor i hjärnan och även främja tillväxten och aktiviteten hos nervceller. Neuroner är de mest grundläggande enheterna i hjärnan och är nyckeln till vår inlärnings- och minnesförmåga. Därför kan protein med hög överflöd förbättra vårt minne genom att förbättra neuronernas funktion.

Forskning har också visat sambandet mellan protein och minne. Till exempel fann en studie att jämfört med en proteinrik kost, ledde en lågproteindiet till en försämring av hjärnans funktion, inklusive uppmärksamhet och minne.

Så om du vill förbättra ditt minne kan du lika gärna lägga till lite proteinrik mat till din kost, såsom kyckling, fisk, nötkött, ägg, tofu, etc. Naturligtvis bör du också vara uppmärksam på balansen och mångfald av din kost, och du kan inte bara äta en sorts mat.

Kort sagt, protein i högt överflöd kan hjälpa till att förbättra vårt minne. Om du vill ha ett bättre minne kan du lika gärna börja med din kost och försöka äta så mycket proteinrik mat som möjligt! Detta visar att vi behöver förbättra vårt minne, och Cistanche kan förbättra minnet avsevärt eftersom det också kan reglera balansen av signalsubstanser, som att öka nivåerna av acetylkolin och tillväxtfaktorer, som är mycket viktiga för minne och inlärning. Dessutom kan Cistanche också förbättra blodflödet och främja syretillförseln, vilket kan säkerställa att hjärnan får tillräckligt med näring och energi, och därigenom förbättra hjärnans vitalitet och uthållighet.

Klicka på vet kosttillskott för att öka minnet

Ungefär hälften av generna som identifierades från top-down-datauppsättningarna (med eller utan FAIMS) fanns i de översta 20% av överflödsfack för bottom-up-analysen (Figur 6A). Omvänt kunde 71 gener endast hittas i thetop-down datamängder ("NA" bin) (Figur 6A).

Dessa gener verkade representera relativt korta proteiner (<150 AA) and contained numerous basic Lys/Arg residues which, presumably, precluded their ability to be detected by bottom-up analysis. 

Till exempel inkluderades histonproteiner som H3C1, H4C1, H1–4 och H2BC12 i den enda uppifrån-och-ned-behållaren. Som förväntat fann vi att FAIMS kunde förbättra identifikationer i lägre rikliga percentiler över "Inga FAIMS", vilket ökade djupet av det observerbara proteomet.

Genom att bestämma förhållandet mellan FAIMS och "Inga FAIMS" över alla percentiler, är en märkbar ökning av identifikationer under den 40:e percentilen uppenbar inom CV:er i intervallet -40 till -50 (Figur 6B).

Men när man överväger det absoluta antalet gener, är det största bidraget till FAIMS fördel genom att bredda spektrumet av identifiering över alla abundanspercentiler.

Förhållandet mellan FAIMS CV och Transmission of Proteoforms

Med FAIMS noterade vi också en trend mellan FAIMS CV och proteoforms molekylvikt (Figur 7). Vid -50 CV är medianmassan för proteoformen ~5 kDa och ökar till ~15 kDa vid -20CV.

Baserat på dessa massfördelningar (Figur 7) verkar CVs mindre än -50 V vara väl lämpade för top-down eller middle-down proteomic experiment, medan CVs större än -50 V kanske gynnar peptidomic eller bottom-up experiment.

Den observerade molekylviktstrenden sträcker sig förmodligen över -20 CV; dock begränsade vi vår sökning till -20 CV baserat på nedgången i proteoform- och genidentifikationer, vilket ledde till minskande avkastning i proteomsekvenstäckningen per körning.

Vi bör notera att ett tidigare arbete med FAIMS fann +40 CV vara den idealiska spänningen för att överföra en NIST mAb tung kedja (~51kDa) och -20 CV var bäst för motsvarande lätta kedja (~23 kDa), vilket stöder idén att trenden vi observerar sträcker sig till positiva FAIMS CV.45

Intressant nog, även om många spektra som identifierade en enda proteoform var begränsade till att hittas inom ett 10V-intervall (3599 av 5165), fanns det sju proteoformer som observerades över hela CV-intervallet från -50 till -20. Förmodligen kan detta tillskrivas deras höga förekomst i provet, särskilt i fallet med ubiquitin (UBB), myelinbasprotein och acylCoA-bindande protein.

Det är emellertid också troligt att de olika laddningstillstånden för dessa proteoformer antar flera gasfaskonformationer beroende på deras protonisomerisering, vilket påverkar deras rörlighet.42

Dessa sju proteoformer tillät oss att undersöka hur laddningstillståndshöljet överförs differentiellt genom moduleringen av CV. Som en proxy för laddningstillståndsfördelningen vid varje CV, använde vi medianladdningstillståndet baserat på proteoform-spektrum-matchningar (PrSMs) identifierade vid varje CV och spårade hur detta värde förändrades som en funktion av CV från -50 CV.

MS1-skanningarna i figur S3 visar hur median-PrSM-laddningstillståndet spårar laddningstillståndsfördelningen för UBB. Av dessa sju proteoformer följde fyra ett omvänt förhållande, med medianvärdet för observerat laddningstillstånd som ökade när CV minskade (Figur 8).

Det är värt att notera att denna trend generellt sett har observerats med peptider och småproteiner.56,62–64 Överraskande nog visade tre proteoformer det motsatta förhållandet där minskande CV minskade medianladdningstillstånden som observerades (Figur 8).

En översiktlig undersökning av medelprekursormassan mellan de två grupperna tyder på att större prekursorer är mer benägna att gynna högre laddningstillstånd när CV minskar.

För att validera dessa samband ytterligare utökade vi denna analys till att inkludera proteoformer som identifierades inom ett mer blygsamt, men fortfarande brett, 20–30 CV-intervall (n=256 proteoformer). Här, proteoformer vars medianladdning skiftade mer än en laddning över hela CV-sortimentet samlades in i två olika grupper beroende på riktningen för skiftet.

De som flyttade mindre än en avgift ansågs vara "neutrala" när det gällde att byta CV. I likhet med de tidigare resultaten, var större prekursorer signifikant mer sannolikt att vara associerade med ett omvänt förhållande mellan observerade laddningstillstånd och CV (tabell S2).

Med sjunkande CV verkade majoriteten av proteoformerna sända vid lägre laddningstillstånd (n=177) jämfört med de som föredrog högre laddningstillstånd (n=39). Resten (n=40) ansågs vara "neutrala" beträffande ändringar i CV.

Proteoformsbinned inom den neutrala gruppen visade en genomsnittlig prekursormassa mellan de omvända och direkta grupperna, vilket återigen antyder att massan av proteoformen är naturligt kopplad till detta beteende.

Andra primära sekvensbaserade parametrar som basisk/sur aminosyrasammansättning och alifatiskt index var dock inte signifikant korrelerade (tabell S2).

Även om proteinerna som introduceras i gasfasen förmodligen är denaturerade, kan faktorer som typiskt är associerade med naturliga proteiner såsom dipolmoment eller kollisionstvärsnitt ha bättre prediktivt värde mot detta fenomen.64–66 Våra resultat visar hurCV kan användas för att filtrera proteiner av olika massor och hur ett proteins laddningstillståndshölje också kan överföras differentiellt genom FAIMS.

Användbarhet av proteinfragment i TDP-experiment

Överraskande nog var ett betydande antal proteoformer vi identifierade fragment av större proteiner. Vi fann att endast 25% av de unika proteoformerna som identifierades täckte mer än hälften av proteinets sekvens från vilken de härrörde.

Dessa 25 % hade en medelmassa på 11,4 kDa jämfört med de återstående 75 % som hade en medelmassa på 5,7 kDa. Flera faktorer kan bidra till denna observation, av vilka några är oberoende av FAIMS.

Till exempel kan dessa fragment själva vara proteolytiska klyvningsprodukter producerade under normala homeostatiska förhållanden som en del av det cellulära "degradomet",67 eller trots de olika försiktighetsåtgärder som vidtagits, införda under obduktionsintervallet och provhanteringen.

Det centrala nervsystemets vävnad är en rik källa av signalpeptider, kända som "neuropeptider", som också vanligen härrör från mycket större prekursorproteiner.68

Genom att korsrefera våra proteoformidentifieringar med en etablerad neuropeptiddatabas (NeuroPedia),69 kunde vi identifiera flera sådana neuropeptider inklusive vasostatin-1, sekretoneurin, kolecystokinin-58 desnonopeptid och neuropeptid y och många icke-kanoniska sekvensvarianter härrörande från de kända neuropeptidproducerande generna.

Utöver biologiska faktorer kan vissa instrumentparametrar också påverka observationen av proteinfragment. Till exempel kan låga "fragmenterings"-spänningar i källan (mellan 10 och 20 V) vanligtvis användas för att avlägsna addukter och desolvata proteinjoner, medan högre spänningar kan producera källinducerad dissociation.

Emellertid kan amidbindningarnas känslighet för dissociation variera mycket, och när storleken på ett protein ökar ökar också sannolikheten för att det innehåller labila amidbindningar som Xaa-Pro.70–73, eftersom b- och y-joner kan produceras oavsiktligt genom detta mekanism, även vid låga källspänningar, bestämde vi oss för att undvika att applicera källspänning för att minska risken för att introducera fragmentjoner i instrumentet.

Det är också möjligt att proteiner är mottagliga för fragmenteringshändelser när de passerar genom de elektriska fälten som skapas i FAIMS. Dessa fragment skulle dock inte förväntas ha samma rörlighet som moderjonen, med reservationen att detta sannolikt också beror på fragmentets storlek i förhållande till prekursorjonen.

Slutligen är det värt att påpeka några faktorer som kan påverka observationen av mindre proteoformer (<∼15 kDa). First and foremost is the signal spreading that occurs as the size of a proteoform increases.74 

Denna signalspridning kan till stor del tillskrivas laddningstillståndets envelopp och isotopfördelningar för varje laddningstillstånd. Specifik för vår experimentuppsättning var användningen av ett storlek 3K MWCO-filter som det sista filtreringssteget i vår provprep, som i det här fallet valdes för att säkerställa att mindre amyloid beta-proteoformer effektivt kunde fångas in om de fanns närvarande.

Allmänna instrumentella faktorer kan också skapa förskjutna små proteoformer, inklusive inställning av kvadrupolen, elektrodynamisk infångning och kollisioner med kvarvarande gasmolekyler i Orbitrap-cellen som leder till snabbare sönderfall av transienten för större molekyler.75 Oavsett dessa biaser eller exakt ursprung av fragmenten kan de fortfarande ge insikter i proteomet.

Dessa fragment är särskilt användbara i samband med neurodegenerativ sjukdom där störningar i proteostas vanligtvis är kopplade till patologi.76,77

Faktum är att fragment av tau ofta visar sig vara neurotoxiska och spela en roll i utvecklingen av tauopatier såsom AD.23–26. I allmänhet är de fragment vi observerar mycket större än tryptiska peptider, och i flera fall där det finns många fragment för ett visst protein , observerar vi betydande sekvenstäckning.

Detta exemplifieras genom att undersöka fragmenten som ger täckning för ~50 kDa tubulinalpha-1B-kedjan (TUBA1B) och ~70 kDa synapsinet-1 (SYN1), som visas i figur 9A, B, båda stora proteiner som annars skulle vara svåra att observera i sin fullängdsform i TDP av ett komplext prov.

Identifiering av proteoformer med relevans för neurodegenerativa sjukdomar

Användningen av FAIMS med vår top-down-analys möjliggjorde identifieringen av flera unika Swiss-Prot-skarvvarianter och TrEMBL-poster, med 267 unika skarvvarianter och 96 TrEMBL-poster (tabell S3).

Särskilt observerar vi flera PrSMs som otvetydigt identifierar en alternativ ORF-isoform (A{{0}}A0D9SF30) för neural celladhesionsmolekyl1 (NCAM1). Vi observerade också proteoformer härledda från gener som har kända roller i flera neurodegenerativa sjukdomar, särskilt -synuklein och PARK7.

I båda dessa fall innehåller de dominerande proteoformerna fullängdssekvensen. Intressant nog visade sig majoriteten av -synuklein, synuklein och (i mindre utsträckning) -synuklein PrSM innehålla en ~177 Da okänd massförskjutning nära C-terminalen (fullängds-synukleinspektrum med okänd modifiering, som visas i figur S4A) .

Denna massförskjutning har tidigare observerats i öppna databassökningar och återfinns vanligtvis vid Asp eller Gluresidues.78 En potentiell förklaring som nära matchar den genomsnittliga och monoisotopiska massan av modifieringen består av ett syre med tre järnatomer samt förlusten av sju väteatomer ( baserat på Unimod-tillträde #1971).

Jämförelse av de isotopiska topparna av ay242+-fragmentjonen från -synuklein (Figur S4B) med ett simulerat spektrum som innehåller de tidigare nämnda elementen som tros tillhöra den okända modifieringen (FigureS4C) visar likheten mellan de två isotopfördelningarna, med många av de isotopiska topparna i linje inom 2 ppm från varandra.

Det bör också påpekas att de isotopiska topparna längst till vänster är unika för naturligt förekommande järnisotoper, och frånvaron av dessa toppar är lätt uppenbar när spektrumet simuleras utan att innehålla de tre järnatomerna (Figur S4D), vilket starkt antyder att denna okända modifiering mycket troligt är sammansatt. av de föreslagna delarna.

Tidigare studier har också beskrivit den höga affiniteten för -synuklein för olika metalljoner, och regionen vi observerar innehålla denna modifiering överlappar med rester som är kända för att vara involverade i bindning - specifikt 119DPDNEA124-motivet (Figur S5).79–81

Våra data tyder också på att de C-terminala regionerna av -synuklein och -synuklein har liknande roller i metallbindning eftersom flera spektra med samma okända massförskjutning matchades till liknande sekvenser inom dessa proteiner.

Om mitokondriella proteinet PARK7 noterade vi ett ~116.0 Da-massskifte på dess enda aktiva plats Cys-rest, C106 (Figur S6). En potentiell förklaring med en liknande delta massis succinylering, en modifiering som tillskrivs mitokondriell stress och bildas på grund av Michaels tillsats av fumarat till en Cys tiolgrupp.82

For more information:1950477648nn@gmail.com