Behandling av diabetisk nefropati: kolmonoxid

för mer information:ali.ma@wecistanche.com

Del II.: Kolmonoxid lindrar åldrandet vid diabetesnefropati genom att förbättra autofagi

Guibin Meil; Chunjie Jiang; Xueer Cheng; & på al.

ABSTRAKT

Mål: Senescens, kännetecknad av permanent cykelstopp, spelar en viktig roll idiabetisk nefropati(DN). Mekanismen för njursenescens är dock fortfarande oklar, och behandlingen som riktar sig mot den återstår att undersöka ytterligare.

Material och metoder: DN (diabetisk nefropati) möss inducerades av HFD och STZ, och 3 typer av njurceller behandlades med hög glukos (HG) för att upprätta in vitro-modell. Senescensrelaterade och autofagirelaterade markörer detekterades av qRT-PCR och Western blot. Vidare användes autofaghämmare och samimmunutfällning för att klargöra mekanismen förKolmonoxid(CO). Dessutom undersöktes det specifika förhållandet mellan autofagi och senescens genom immunofluorescens trippel samlokalisering och ELISA.

Resultat: Vi avslöjade att senescens inträffade in vivo och in vitro, vilket kunde vändas av CO (Kolmonoxid). Mekaniskt visade vi att CO (Kolmonoxid) hämmade dysfunktionen av autofagi i DN (diabetisk nefropati) möss delvis genom dissociering av Beclin-1-Bcl-2-komplexet. Ytterligare resultat visade att autofaghämmare blockerade förbättringen av CO (Kolmonoxid) om åldrande. Dessutom avslöjade uppgifterna att autofagi reglerade nedbrytningen av senescensrelaterad sekretorisk fenotyp (SASP) inklusive-1β, Il-6, Tgf-βoch Vegf. Slutsatser: Dessa resultat tydde på att CO (Kolmonoxid) skyddar DN (diabetisk nefropaty) möss från njursenescens och funktionsförlust via förbättrad autofagi delvis medieras genom dissocierande Beclin-1-Bcl-2-komplex, vilket möjligen tillskrivs nedbrytningen av SASP. Dessa resultat ger nya idéer för förebyggande och behandling av DN (diabetisk nefropati) och regleringen av åldrande.

Klicka till Cistanche DHT för njurfunktion

KLICKA HÄR TILL DEL I.

4 | DISKUSSION

Ackumulerande senescenta celler anses alltmer vara maligna zombieceller som är resistenta mot döden, med förmågan att inducera vävnadsdysfunktion och driva åldersrelaterade sjukdomar. Forskare rapporterade att transplantation av senescenta prekursorfettceller till 6 månader gamla möss orsakade en dosberoende minskning av kroppsfunktionen.2 Omvänt förbättrade avlägsnandet av senescenta celler en rad åldersrelaterade sjukdomar såsom T2D,30osteoarthritis31 och Alzheimers sjukdom.32Våra resultat visade förekomsten av senescens i DN (diabetisk nefropati) möss och tre typer av njurceller som exponerats för HG. Dessa resultat och tidigare forskning föreslog konsekvent förekomsten av åldrande i DN (diabetisk nefropati). Intressant nog var njursenescens bland de 9 typerna av vävnad hos 27 månader gamla SD-råttor den tidigaste och allvarligaste, vilket indikerar att njuren var mottaglig för åldrande.33 Baserat på dessa fynd spekulerade vi i att terapierna riktade mot senescenta celler kan skydda mot DN (diabetisk nefropati). Nyligen begränsade bevis visade att CO (Kolmonoxid) lindrade läkemedelsinducerad senescens av endotelceller. På samma sätt tillhandahöll vi resultat som CO (Kolmonoxid) avsevärt nedreglerat en hel del senescent fenotyp och därefter återvunnen njurfunktion i DN (diabetisk nefropati) möss. Medan CO (Kolmonoxid) har visat sig utöva renoskydd mot ischemi-reperfusion och njurtransplantationsmöss via antiinflammatorisk, antiapoptos och andra klassiska vägar,4 vår studie föreslog en ny mekanism som CO (Kolmonoxid) ger förbättring från njursenescens av DN (diabetisk nefropati) möss.

Med undantag för de allmänt erkända p53 / p21- och p16-vägarna har senescens beskrivits för att regleras av autofagi positivt. Dessa resultat och tidigare forskning föreslog konsekvent förekomsten av åldrande i DN (diabetisk nefropati) I överensstämmelse med detta konstaterades minskningen av autofagi i njurar med åldrande.5 Dessutom fanns det ett negativt samband mellan Atg5 och njuråldring av DN (diabetisk nefropati) möss, vilket tyder på potentialen för anti-senescens av autofagi i DN (diabetisk nefropati). Våra resultat visade att dysfunktionen av autofagi och autofagi flöde in vivo och vitro var positivt associerad med ackumulerade senescenta celler. Intressant nog, CO (Kolmonoxid) har ansetts vara en effektiv autofagiaktivator. I vår studie, CO (Kolmonoxid) aktiverad autofagi men minskade autofagosomer. De ytterligare data som visade att CO (Kolmonoxid) förbättrades lysosomal funktion och autofagiflöde genom transfektion av RFP-GFP-LC3. Dessutom hindrade autofaghämmare och siAtg7 förbättringen av åldrandet av CO (Kolmonoxid) in vitro, till stöd för denna CO (Kolmonoxid) bromsade åldrandet via autofagi.

Inte bara det, dissociationen av Beclin-1-Bcl-2-komplexet av CO (Kolmonoxid) observerades i DN (diabetisk nefropati) möss. Såvitt vi vet fungerar Beclin-1 som en autofagi initiator när den dissocieras från Bcl-2. Störningen av komplexet kan vara ett potentiellt mål för autofagi aktiverad av CO (Kolmonoxid). Dessutom aktiverade utslagning av Beclin-1- och Bcl-2-bindningsställena inte bara autofagi utan förbättrade åldrandet och mössens livslängd,21 vilket tyder på den komplexa koordinatreglerade autofagi och senescens. Våra experiment visade att detta komplexa dissociationsmedel ABT737 ytterligare förbättrade aktiveringen av autofagi och förbättring av åldrandet av CO (Kolmonoxid) in vitro. I överensstämmelse med våra resultat påverkar störningen av interaktionen mellan Beclin-1-Bcl-2-komplexet positivt flera sjukdomar, inklusive skydd mot hjärtskador hos diabetiska kardiomyopatimöss3 ° och utövande av renoskydd på möss som utmanas av ischemi-reperfusion.37 Dessa observationer indikerade att CO (Kolmonoxid) kan aktivera autofagi genom att dissociera Beclin-1-Bcl-2-komplexet för att lindra åldrande och njurskador.

FIGUR 5 Aktiverad autofagi kan försämra SASP i DN (diabetisk nefropati) möss.

A, Immunohistokemiska bilder och kvantifiering av p65-uttryck och kärntranslokation (n = 3). Skalstång: 50 μm. B, Western blot analys av GATA4 (n = 3).

C, Representativa immunofluorescensbilder av mTOR, LC3 puncta och LAMP2 samlokalisering i njuren. Skalstång: 25 μm.

D-G, Representativa immunofluorescensbilder visade den tredubbla samlokaliseringen av IL-1β, IL-6, TGF-β och VEGF med LC3 och LAMP2 (de röda pilarna) och de vita pilarna indikerade platsen med LC3. Skalstång: 25 μm.

H, Den totala VEGF-proteinnivån (celllysat och supernatant) i HPC behandlad med olika formuleringar (HG, ABT737: 1 mmol / L, rapamycin: 10 nmol / L och CORM-2).

I, VEGF-proteinuttryck i supernatanten av HPC behandlas annorlunda. J, VEGF-proteinfrisättningsförhållande för HPC (supernatant / totalt lysat) (n = 6). *P< .05,="" **p="">< .01,="" ***p=""><>

Dessutom kräver det specifika förhållandet mellan autofagi och senescens ytterligare belysning. Autofagi är en rengöringsprocess för att leverera slutna beståndsdelar till lysosomen för nedbrytning. Forskare bevisade att autofagi minskade utsöndringen av Il-1β, en viktig SASP-komponent, genom den nedbrytande vägen. Överraskande observerades samlokaliseringen av IL-1β, LC3 puncta och LAMP2 i njurarna, vilket tyder på nedbrytning av IL-1β av CO (Kolmonoxid) behandling i DN (diabetisk nefropati) möss. Dessutom är intracellulär I-6, TGF-β respektive VEGF samlokaliserad med LC3 puncta och LAMP2, vilket indikerar skärningspunkten mellan autofagi och nedbrytningen av SASP. Konsekvent visade sig den läkemedelsaktiverade autofagin minska utsöndring av IL-6 i kondrocyter,3 " medan undertryckandet av autofagi genom att radera Atg7 orsakade ökad export av IL-16. IL-6 och IL-8 i adipocyter och bröstcancerceller.0 IL-1α rapporterades dock inte vara ett direkt substrat för autofagisk eliminering i makrofager,1 vilket tyder på att SASP delvis försämrades av autofagi.

Anmärkningsvärt observerade vi att SASP samlokaliserade med autofagosomer i njuren i DN (diabetisk nefropati) möss (figur 5D-G, den vita pilen), vilket indikerar att SASP kan uppslukas av autofagosomer men undkomma lysosomer. Detta kan potentiellt hänföras till sekretorisk autofagi genom att autofagosomer inte levereras till lysosomer utan istället smälter direkt med plasmamembranet, vilket leder till frisättning av cytosoliska komponenter (SASP) till det extracellulära utrymmet. Samlokaliseringen av SASP och autolysosomer ökade dock kraftigt i normal och CO (Kolmonoxid)-intervenerade möss (figur 5D-G, den röda pilen). Den möjliga förklaringen till detta fenomen är att både autofagimedierad utsöndring och nedbrytning deltar i SASP-transport.3 Även om regleringen av divergensen mellan utsöndring kontra nedbrytning av det intracellulära innehållet återstår att förstå fullt ut, fann vi både CO(Kolmonoxid)och autofagiagonister blockerade exporten av VEGF i HPC behandlad med HG, vilket tyder på att aktiverad autofagi bidrog till SASP-nedbrytning. Dessutom rapporterades den försämrade lysosomala funktionen orsaka frisättning av autolysosommaterial i mikrogliacellen.4 Således CO(Kolmonoxid)-inducerad aktivering av autofagi och återställande av lysosomal funktion kan leda till mer nedbrytning av SASP än sekretion.

Mycket bevis visade att utsöndrad SASP spelade en negativ roll i vissa sjukdomar. Till exempel rapporterades SASP underlätta retinala vaskulära skador genom att överföra åldrande hos retinopatimöss,4 inducera senescens och skada på icke-senescenta gallceller.46 Det är dock okänt om SASPis är ansvarig för DN (diabetisk nefropati) progression. Omics resultat visade att inflammatoriska cytokiner var uppreglerade i tidigt och särskilt i sen DN (diabetisk nefropati).7Konsekventiellt fann vi att massor av SASP utvecklades i DN (diabetisk nefropati) möss, bland vilka IL-1β ökade mest signifikant jämfört med normala möss och VEGF samlokaliserades med autolysosomer mest uppenbart i normala och CO (Kolmonoxid)-ingrep möss. Och behandlingen av anti-IL-β lgG-försvagade njurskador inklusive fibros hos db/db-möss.48 Raderingen av VEGF-B skyddad mot DN (diabetisk nefropati) genom att minska ackumuleringen av njurlipid, medan överuttrycket av VEGF-A hos vuxna möss förvärrade njurdysfunktion och strukturförändring.50 Ovanstående data om reglering av SASP föreslog vidare SASPin DN: s nyckelroll (diabetisk nefropati). Vår studie visade också att administrering av CO (Kolmonoxid) hämmade uttrycket och utsöndret av SASP och förbättrade därefter njurfibros och strukturella förändringar. Därför drog vi slutsatsen att blockåldern för SASP-medierade senescens genom nedbrytningsvägen för autofagi kan vara en av de mekanismer genom vilka CO (Kolmonoxid) skyddar HFD+ STZ-inducerat DN (diabetisk nefropati).

Sammantaget tydde de aktuella resultaten på att CO (Kolmonoxid) lindrad njursenescens av DN (diabetisk nefropati) genom förbättring av autofagimedierad genom dissociering av Beclin-1-Bcl-2-komplexet, vilket delvis tillskrevs nedbrytningen av SASP. Vår studie belyser förebyggande och behandling av DN (diabetisk nefropati) och regleringen av njursenescens. Förväntansfullt är de specifika effekterna av åldrande på DN (diabetisk nefropati) är värda att undersökas närmare. Å andra sidan kan anti-senescensläkemedel bli ett genombrott i behandlingen av DN (diabetisk nefropati) och andra åldersrelaterade sjukdomar.

FIGUR 6 CO aktiverade autofagi delvis genom att dissociera Beclin-1-Bcl-2-komplexet.

A, Co (Kolmonoxid)-immunutfällning av Beclin-1 och Bcl-2 och kvantifiering av förhållandet mellan Beclin-1 och Bcl-2 i njurarna (n = 3).

B, Western blot-analys av en serie autofagproteiner (LAPM2, p62 och LC3) i HBZY-1 behandlade annorlunda (HG, CORM-2 och Beclin-1-Bcl2 komplexdissociationsmedel ABT737) (n = 5).

C, Kvantifiering av uttrycket av p53, p21 och p16 (n = 5 eller 6).

D, SA-β-gal-färgningsbilder av 3 typer av njurceller behandlade annorlunda och statistiska resultat (n = 3). Skalstång: 50 μm. *P< .05,="" **p="">< .01,="" ***p=""><>

REFERENSER

1. Alicia RZ, Rooney MT, Tuttle KR.Diabetisk njursjukdom: utmaningar, framsteg och möjligheter. Clin J Am Soc Nephrol. 2017;12(12):2032-2045.

2. Konsortium CKDP, Matsushita K, Vandervelde, et al. Associering av uppskattad glomerulär filtreringshastighet och albuminuri med allorsaks- och kardiovaskulär dödlighet i allmänna befolkningskohorter: en kollaborativ metaanalys. Lancet.2010;375(9731):2073-2081. 3. Baker DJ, Wijshake T, Tchkonia T, et al. Clearance av p16Ink4a-positiva senescenta celler fördröjer åldringsrelaterade störningar. Natur. 2011;479(7372):232-236.

4. Kitada K, Nakano D, Ohsaki H, et al. Hyperglykemi orsakar cellulär senescens via en SGLT2- och p21-beroende väg i proximala tubuler i det tidiga skedet av diabetisk nefropati. J Diabetes Complicat.2014;28(5):604-611.

5. Tsai Y-C, Kuo P-L, Kuo M-C, et al. Interaktionen mellan miR-378i-Skp2 reglerar cellsenescens vid diabetisk nefropati. J Clin Med. 2018;7(12):468.

6. Baker DJ, Childs BG, Durik M, et al. Naturligt förekommande p16 (Ink4a)-positiva celler förkortar den friska livslängden. Natur. 2016;530(7589):184-189.

7. Al-Douahji M, Brugarolas J, Brown PA, Stehman-Breen CO (Kolmonoxid), Alpers CE, Shankland SJ. Cyklinkinashämmaren p21WAF1/CIP1 krävs för glomerulär hypertrofi vid experimentell diabetesnefropati. Njure Int. 1999;56(5):1691-1699.

8. Wolf G, Schanze A, Stahl RAK, Shankland SJ, Amann K. p27 (Kip1) Knockout möss är skyddade från diabetisk nefropati: bevis för p27 (Kip1) haplotypinsufficiens. Njure Int. 2005;68(4):1583-1589.

9. BharathLP, Agrawal M, McCambridge G, et al. Metformin förbättrar autofagi och normaliserar mitokondriell funktion för att lindra åldringsassocierad inflammation. Cell Metab.2020;32(1):44-55.e6. 10. Ma Y, Qi M, An Y, et al. Autofagi kontrollerar mesenkymala stamcellsegenskaper och åldrande under benåldring. Åldrande cell. 2018;17(1):e12709.

11. Garcia-Prat L, Martinez-Vicente M, Perdiguero E, et al. Autofagi upprätthåller stamhet genom att förhindra åldrande. Natur. 2016;529(7584):37-42.

12. Hartleben B, Gödel M, Meyer-Schwesinger C, et al. Autofagi påverkar glomerulär sjukdomskänslighet och upprätthåller podocythomeostas hos åldrande möss. J Clin Invest.2010;120(4):1084-1096.

13. Tagawa A, Yasuda M, Kume S, et al. Nedsatt podocytautofagi förvärrar proteinuri vid diabetisk nefropati. Diabetes. 2016;65(3):755-767.

14. Motterlini R, Otterbein LE. Den terapeutiska potentialen hos kolmonoxid. Nat Rev Drug Discov.2010;9(9):728-743.

15. Abe T, Yazawa K, Fujino M, et al. Kolmonoxid med högt tryck bevarar råtta njurtransplantat från apoptos och inflammation. Lab Invest.2017;97(4):468-477.

16. Kim D-S, Song L, Wang J, et al. Kolmonoxid hämmar ö-apoptos via induktion av autofagi. Antioxid Redox Signal. 2018;28(14):1309-1322.

17. Lee S, Lee S-J, Coronata AA, et al. Kolmonoxid ger skydd vid sepsis genom att förbättra beclin 1-beroende autofagi och fagocytos. Antioxid Redox Signal.2014;20(3):432-442.

18. WS J, Li Y, Yang P, Huang Y, Lu S, Xu F.Romanroll avkolmonoxidför att förbättra neurologiskt resultat efter hjärtstillestånd hos äldre råttor: involvering av inducerande mitokondriell autofagi. JAm Hjärta AssoC.2019;8( 9):e011851.

19. Zheng M, Chen Y, ParkJ, et al.Kolmonoxid) förbättrar endotelsenescensen inducerad av 5-fluorouracil genom SIRT1-aktivering. Arch Biochem Biophys.2019;677:108185.

20. Jiang C, Zhang S, Li D, et al. Nedsatt ferritin ophagy flöde inducerad av hög fetthalt diet förmedlar hepatisk insulinresistens via endoplasmatisk retikulum stress. Mat Chem Toxicol.2020;140:111329.

21. Fernandez AF, Sebti S, Wei Y, et al. Störning av beclin 1-BCL2 autofagi regleringskomplex främjar livslängd hos möss. Natur. 2018;558(7708):136-140.

22. Liu M, Liang K, Zhen J, et al. Sirt6-brist förvärrar podocytskada och proteinuri genom att rikta Notch-signalering. Nat Commun.2017;8( 1):413.

23. Sturmlechner I, Durik M, Sieben CJ, Baker DJ, van Deursen JM. Cellulär senescens vid njuråldring och sjukdom. Nat Rev Nephrol. 2017;13(2):77-89.

24. Bird TG, Müller M, Boulter L, et al. TGFβ-hämning återställer ett regenerativt svar vid akut leverskada genom att undertrycka parakrin senescens. Sci Transl Med.2018;10(454):eaan1230.

25. Stolz A, Ernst A, DikicI. Lastigenkänning och handel med selektiv autofagi. Nat Cell Biol.2014;16(6):495-501.

Not:ovanstående är inte en fullständig referenslista