Trunkerat glykoprotein E från Varicella-zoster-virus är ett idealiskt immunogen för Escherichia coli-baserad vaccindesign

Varicella-zoster-virus (VZV) är ett mycket smittsamt ämne som är ansvarigt för både varicella och herpes zoster-sjukdom. Trots hög effektivitet kvarstår säkerhets- och tillgänglighetsproblem med de licensierade vaccinerna. Här försökte vi producera ett VZV gE-immunogen med användning av ett E. coli-expressionssystem. Vi fann att det lösliga uttrycket och utbytet av gE-protein kunde förbättras via C-terminala trunkationer till proteinet, och därigenom underlätta en robust och skalbar reningsprocess för vaccintillverkning. Det blystympade gE (aa 31–358), hädanefter kallat tgE, var en homogen monomer i lösning och visade utmärkt antigenicitet. Slutligen utvärderade och jämförde vi immunogeniciteten av tgE med kommersiellt vodka LAV och Shingrix-vaccin. Vi fann att aluminiumadjuvanserad tgE var immunogen jämfört med vodka LAV. När den adjuvanserades med AS01B visade en tvådosimmunisering av tgE jämförbar eller bättre styrka i antikroppssvar och cellmedierad immunitet med dem av Shingrix-vaccinet vid samma dos, särskilt när det gäller andelen IFN- -som uttrycker CD4+ T-celler. Sammanfattningsvis erbjuder denna metod för E. coli-medierad tgE-uttryck en kostnadseffektiv och skalbar strategi för att generera ett idealiskt VZV gE-immunogen för utveckling av både varicella- och zostervacciner.

cistanche tubulosa-förbättra immunförsvaret

varicella-zoster-virus, glykoprotein E, Escherichia coli, vaccin

INTRODUKTION

Varicella-zoster-virus (VZV) är ett patogent, humant alfa-herpesvirus som inducerar två huvudkategorier av sjukdomar: primär infektion med varicella, en mycket smittsam sjukdom som kännetecknas av blåsliknande utslag på huden och milda systemiska symtom som feber och sjukdomskänsla främst hos barn; och herpes zoster (HZ), den latenta reaktiveringen av viruset som svar på ett försvagat cellulärt immunsystem orsakat av åldrande som orsakar ett smärtsamt, lokaliserat vesikulärt utslag (HZ) med eller utan flera andra komplikationer (Cohen, 2013; Heininger och Seward, 2006; Zerboni et al., 2014). Varicella och HZ kan båda förebyggas med levande-attenuerade virusvacciner (LAV). Den första LAV för förebyggande av varicella utvecklades av Takahashi et al. (1974) baserad på vOka-virusstammen och licensierades senare som Varivax för rutinbruk i USA. Detta följdes av utvecklingen och licensieringen av Zostavax för att förebygga HZ (Tseng et al., 2011). Tyvärr, under de 10 åren sedan inokulering med Varivax började, har nästan 1/3 av HZ-fallen bekräftats vara associerade med vOka-stammen (Galea et al., 2008), vilket tyder på att vOka kan infektera och etablera latens, som en vild -typ virus och återaktivera sedan för att orsaka HZ. Dessutom är effekten av Zostavax omvänt proportionell mot patientens ålder vid administreringstillfället, med ökad ålder förknippad med lägre effekt (Oxman et al., 2005). Tidigare studier har visat att VZV-glykoprotein E (gE) är det vanligaste virala glykoproteinet på virionhöljet och den infekterade cellytan. GE är också en av de viktigaste VZV-skyddande antigenerna som kan inducera cellulär och humoral immunitet under naturlig varicellainfektion såväl som efter vOka-vaccination (Arvin, 1992; Oliver et al., 2016). Nyligen godkändes ett rekombinant HZ-subenhetsvaccin, Shingrix (HZ/su), för att förebygga HZ och associerad postherpetisk neuralgi (PHN) hos vuxna äldre än eller lika med 50 år (Shah et al., 2019; Syed, 2018). I kliniska prövningar inducerade Shingrix en effektiv, VZV-specifik, cellmedierad immunitet (CMI), med en total vaccineffektivitet på 97,2 % bland deltagarna över eller lika med 50 år och en skyddsgrad på 91,3 % hos deltagarna större än eller lika med till 70 år. Dessa fynd indikerar tillsammans en signifikant minskad risk för HZ hos vaccinerade individer oberoende av ålder, och därmed ett mer potent vaccinalternativ jämfört med ZOSTAVAX (Lal et al., 2015; Shah et al., 2019).

cistanche växthöjande immunförsvar

Shingrix är designad av ett rekombinant gE-antigen uttryckt i kinesisk hamster-ovarieceller (CHO) och ett liposombaserat adjuvantsystem (AS01B) innehållande 3-Odesacyl-4′-monofosforyllipid A (MPL) och Quillaja saponaria Molina, fraktion 21 (QS21) (Dendouga et al., 2012). Rekombinanta CHO-celler kräver dock en lång produktionscykel och är förknippade med en komplex reningsprocess som resulterar i en hög tillverkningskostnad och ett begränsat utbud. Som sådan är Shingrix inte en idealisk vaccinationslösning för utbredd användning, särskilt i utvecklingsländer (Kim et al., 2012). Mikrobiella expressionssystem erbjuder flera fördelar jämfört med däggdjursexpressionssystem, inklusive snabb tillväxt, enkel odling och lägre produktionskostnader (Overton, 2014), och används därför i stor utsträckning vid uttryck och produktion av många bioläkemedel (Adkins och Wagstaff, 1998; Monie). et al., 2008; Wu et al., 2012). Flera svårigheter under produktionen måste dock övervinnas för ett framgångsrikt uttryck av rekombinanta eukaryota proteiner i prokaryota system, såsom felaktig veckning och avsaknad av post-translationell modifiering (Singh och Panda, 2005). Trots dessa svårigheter kan mikrobiella expressionssystem erbjuda ett idealiskt system för utbredd, kostnadseffektiv vaccintillverkning, och det kräver därför att man undersöker antigener från ett E. coli-expressionssystem för VZV-vaccindesign. I tidigare arbete visade vi det framgångsrika uttrycket av ett rekombinant gE (rgE) protein i insektsceller och erhöll renade proteiner för musimmunisering och mAb-produktion (Liu et al., 2015). Med utgångspunkt i detta arbete undersöker vi här om gE-proteinet kan uttryckas i E. coli. Vi undersökte det icke-fusionslösliga uttrycket av gE-kandidatantigener med en C-terminal trunkering (hädanefter kallad trunkerad gE (tgE) eller tgE) i E. coli och karakteriserade de renade tgE-proteinerna. Vi visar att det renade tgE är antigent liknande det naturliga gE och kan inducera höga antikroppstitrar med vOka-neutraliserande aktivitet hos möss. När vi jämför immunogeniciteten hos tgE-antigenet som genererats i vår studie med LAV och Shingrix, finner vi att vårt antigen inte bara uppvisar ett effektivt humoralt svar utan också inducerar en antigenspecifik CMI. Sammantaget kan vår E. coli-strategi för produktion av tgE-protein bana väg för ett alternativt industriellt framställt immunogen för både varicella- och HZ-vaccination.

cistanche fördelar för män stärker immunförsvaret

Klicka här för att se produkter från Cistanche Enhance Immunity

【Be om mer】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

RESULTAT

Uttryck och rening av rekombinant tgE i E. coli

DNA-sekvenser som kodar för den extracellulära VZV gE-domänen framställdes som konstruktioner med olika N- eller C-terminala trunkationer och klonades in i pTO-T7-vektorn för proteinuttryck i E. coli. Den extracellulära domänen i full längd av gE tenderade att bilda inklusionskroppar i E. coli under expression, och detta skulle kunna förbättras med en C-terminal trunkering. Av de olika trunkerade proteinerna uppnåddes den bästa lösligheten med gE (aa 31–358) konstruktionen (Figur 1A), hädanefter kallad trunkerad gE eller tgE. Kandidaten tgE uttrycktes framgångsrikt som ett lösligt rekombinant protein och renades från supernatanten av bakterielysat med hjälp av trestegskromatografi i labbskala för vidare bedömning och utveckling som ett potentiellt vaccin. Stark anjonbyteskromatografi användes för infångning följt av keramisk hydroxiapatit och hydrofob kromatografi (Figur IB). På varandra följande steg av reningsprocessen såg en ökning av renheten av tgE på SDS-PAGE (Figur 1C). tgE migrerade som ett cirka 40 kD band och visade god reaktivitet med den specifika antikroppen 1B11 (Figur 1D). Det totala utbytet var ca 500 ug renat tgE per gram bakterier.

Karakterisering av det trunkerade gE

Högpresterande storleksuteslutningskromatografi (HPSEC) och analytisk ultracentrifugering (AUC) användes för att analysera homogeniteten och sedimenteringskoefficienterna för renade proteiner. rgE-protein renat från insektscellsystemet (Liu et al., 2015) användes som kontroll. I HPSEC uppträdde tgE som en skarp topp vid den övervägande retentionstiden på 16,1 min (Figur 2A), vilket återspeglar hög homogenitet för de renade tgE-proteinerna. I AUC-experiment observerades en dominerande sedimentationstopp vid ~2,3 S (Figur 2B), vilket motsvarar ~39,4 kD, vilket indikerar att tgE presenteras som en monomer i lösning. Differential scanning kalorimetri (DSC) användes för att testa den termiska stabiliteten hos tgE-proteinet genom att övervaka värmekapaciteten under den termiska utveckningsprocessen. DSC-profilerna visade endast en termisk övergång under proteinutveckling vid ett värde för övergångstemperatur (Tm) på 63,80 grader för tgE, jämförbart med det för rgE (63,64 grader) (Figur 2C). För att undersöka konformationsintegriteten hos de renade tgE-proteinerna analyserade vi antigeniciteten hos tgE med hjälp av en ELISA-analys, med renade rgE-proteiner uttryckta i insektsceller som kontroller. Nio mAbs som kunde känna igen konformationella epitoper (mAb 1B11, 4G4, 14G1) eller linjära epitoper (4A2, 11B11, 11B12, 6H6, 10H6, 11E3) användes i ELISA-testet (Figur 3). Vi hittade liknande medianvärden för effektiv koncentration (EC50, ng mL−1) för tgE- och rgE-proteiner för de flesta av antikropparna förutom 1B11, som hade en nästan 10-faldigt lägre reaktivitet, vilket tyder på deras liknande antigenicitet. Dessa resultat tyder på att nyckelepitoper på rgE är väl bevarade i tgE-proteinet.

Figur 1 (Färg online) Uttryck och rening av proteinerna. En schematisk representation av tgE-konstruktionsdesign. E. coli-celler transformerades med rekombinanta plasmider som bar den trunkerade genen gE (aa 31–358). B, Schematisk representation av tgE-reningsprocessen. tgE renades från lyserad supernatant med användning av trestegskromatografi. C, SDS-PAGE-profil för tgE under reningsprocessen. Molekylvikten för tgE är ungefär 40 kD. M: molekylviktsmarkör. Spår 1: supernatant separerad från cellysat; bana 2: fraktion innehållande tgE från Q-FF-kromatografen; bana 3: fraktion innehållande tgE från CHT-kromatograf; bana 4: fraktion från butylkromatografen, innehållande tgE-proteinet med hög renhet. D, Immunoblotting av det renade tgE.

Analys av immunsvar inducerade av tgE i möss

För att jämföra immunogeniciteten hos tgE med rgE formulerade vi proteinerna med två adjuvans som vanligtvis används för forskningsarbete: aluminiumbaserad adjuvans Al-001 och Freunds adjuvans. Möss immuniserades tre gånger i veckorna 0, 2 och 4 med en dos på 1 ug för både adjuvansad tgE och rgE. gE-specifika antikroppstitrar och T-cellssvar vid vecka 5 efter den första immuniseringen användes för att bestämma immunogeniciteten hos olika adjuvansformuleringar. Möss immuniserade med tgE-vaccinet formulerat med Al-001 visade liknande antikroppsprofiler som möss i rgE-gruppen, och Freunds adjuvans visade en bättre stimuleringseffekt när de formulerades med tgE än med rgE (Figur 4A). Neutraliseringstitrar visade inga skillnader hos möss immuniserade med tgE- eller rgE-vaccin, med neutraliserande titrar på ~103 för tgE formulerade med de olika adjuvanserna (Figur 4B). I analysen av CD4+ T-celler från splenocyter genom intracellulär cytokinfärgning (ICS), framkallade emellertid både tgE- och rgE-vacciner liknande nivåer av gE-specifik IFN- jämfört med saltlösningsgruppen (Figur 4C, ~{ {22}},1 % för antingen vaccingrupper eller saltlösningsgrupp), och endast en måttlig simulering av gE-specifik IL{{20}} (Figur 4D, ~0,2 % för vaccingrupper kontra ~0,1 % för saltlösningsgruppen). Sammantaget visar dessa resultat att tgE/Al-001 och tgE/Freunds adjuvans framkallar gE-specifika immunsvar jämförbara med de som framkallas av rgE, med ett särskilt starkt humoralt svar.

Utvärdering av tgE varicellavaccinkandidat jämfört med LAV

Vi utvärderade sedan antikroppsproduktion och beständigheten av aluminiumadjuvanserade tgE-proteiner i BALB/c-möss. Två grupper av möss (n=5 per grupp) immuniserades tre gånger i veckorna 0, 2 och 4 med olika doser av 0.5 ug och 5 ug tgE/Al{{ 8}} (Figur 5A och B). Antikroppssvarsprofilerna visade att den primära inokuleringen av tgE-proteinet framkallade höga antikroppstitrar, med en ihållande ökning efter de två boosterimmuniseringarna vid vecka 2 och 4, och nådde en maximal nivå vid vecka 6 innan den långsamt sjönk till mer än 1{{ 20}}4 under övervakningsperioden. Olika dosgrupper delade liknande antikroppstiterprofiler under övervakningsperioden, med liknande höga neutraliserande titrar vid vecka 6. Immunogeniciteten av tgE utvärderades och jämfördes med vodka. Den halveffektiva dosen (ED50) i möss användes som ett mått på serokonversion, med en lägre ED50 som tyder på bättre immunogenicitet. Balb/c-möss separerades i grupper och immuniserades intraperitonealt med aluminiumadjuvanserad tgE (1, 0.5, 0.25, {{50}}.125, {{ 54}}.0625, eller 0.03125 ug; n{{30}}) eller vOka-vaccin (1,000, 500, 250, 125 eller 62,5 pfu; n=6) i serieutspädningar. Sera uppsamlades efter 4 veckor och testades med användning av ELISA. Serokonvertering analyserades enligt Reed and Muench-metoden (Figur 5C). I åldersgrupperna hade möss serokonversionsfrekvenser på 83 %, 100 %, 100 %, 100 %, 50 % och 17 % för doser på 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625 respektive 0,03125 ug. I vodkagrupperna hade möss lägre serokonverteringsgrader på 67 %, 50 %, 33 %, 17 % och 0 % för doser på 1,000, 500, 250, 125 respektive 62,5 pfu. ED50-värdena var 0,063 ug för tgE och 449,425 pfu för vOka, vilket indikerar att immunogeniciteten för tgE vid en lägre dos på 0,3 ug var ekvivalent med den som uppnåddes med en engångsdos av varicellavaccin innehållande vOka (vanligtvis över 2,{{78} } pfu per dos).

Figur 2 Karakterisering av tgE- och rgE-proteiner. A, HPSEC-profiler för det renade tgE. Retentionstiden för gE anges. B, Sedimentationshastighetsanalys av det renade tgE-proteinet. Sedimenteringskoefficienten och molekylvikten för tgE bestämdes med c(s)- och c(M)-metoder oberoende av varandra. I (A) och (B) visas tgE i svart och rött i blått. C, differentiell skanningskalorimetriprofiler för det renade tgE- och rgE-proteinet.

Figur 3 Reaktiviteter av tgE och rgE med mAbs. mAbs serieutspäddes och reagerade med belagda tgE- eller rgE-proteiner i en ELISA-analys. Reaktioner detekterades med användning av HRP-märkta anti-mus-antikroppar. Duplikatbrunnar mättes på samma platta för varje utspädning. EC50-värden beräknades genom sigmoid-trendanpassning med GraphPad Prism-programvara.

Figur 4 Immunogenicitet av tgE och rgE testade i BALB/c-möss 1 vecka efter tre-dosimmunisering. A, Antikroppsproduktion hos möss för tgE och rgE formulerade med olika adjuvans. B, Neutraliserande antikroppstitrar i möss för tgE och rgE formulerade med olika adjuvans. C och D, Utvärderingar av gE-specifika IFN- och IL-2-svar inducerade av tgE- eller rgE-vacciner.

Figur 5 Immunogenicitetstester av aluminiumformulerat tgE-vaccin i BALB/c-möss. A och B, Antikroppsbeständighet och neutraliserande antikroppssvar av tgE/Al-001. Titrar övervakades i upp till 16 veckor. C, ED50 i möss för aluminiumformulerad tgE och vodka.

Utvärdering av tgE Zoster-vaccinkandidat jämfört med Shingrix

För att jämföra immunogeniciteten hos vårt tgE-vaccin med Shingrix, formulerades lyofiliserat tgE-protein med Shingrix-adjuvansen, AS01B. C57BL/6-möss immuniserades med två doser av tgE/AS01B eller Shingrix intramuskulärt i tibialismuskeln vid vecka 0 och 4. Antikroppsnivåerna efter den första immuniseringen antydde att immunisering med Shingrix var tillräcklig för att inducera höga nivåer av anti-gE-antikroppar, betydligt högre än de som produceras av tgE/AS01B; efter den andra immuniseringen fanns det emellertid ingen signifikant skillnad i antikroppsproduktion mellan de två grupperna (Figur 6A). När det gäller nivåerna av neutraliserande antikroppar ledde en endosimmunisering av tgE/AS01B till produktionen av försumbara mängder neutraliserande antikropp, signifikant lägre än den som produceras av Shingrix. Men igen, efter boosterimmuniseringen, kunde vi inte se någon signifikant skillnad i termer av neutraliserande antikroppsproduktion mellan de två grupperna (Figur 6B). För att verifiera hur immunisering påverkar CMI, detekterades gE-specifika IFN- och IL-2-nivåer efter den första och den andra immuniseringen med hjälp av analysen enzymkopplad immunosorbentfläck (ELISPOT) och intracellulär cytokinfärgning. tgE/AS01B-immuniseringen inducerade ett dåligt humoralt immunsvar jämfört med en enstaka dos av Shingrix men visade jämförbar styrka vad gäller inducering av IFN- - och IL-2-producerande splenocyter (Figur 6C). Efter den andra immuniseringen detekterades faktiskt ett betydande antal gE-specifika cytokinproducerande celler i tgE/AS01B-gruppen jämfört med saltlösningskontrollgruppen, som också var jämförbara med eller bättre än den för Shingrix-gruppen (Figur 6D) ). Liknande resultat observerades i flödescytometrianalysen, med observationer av liknande proportioner av IFN- -uttryckande CD4+ T-celler (Figur 6E), IL-2-uttryckande CD4+ T celler (Figur 6F) och IFN- -CD8+ T-celler (Figur 6G) mellan de tgE/AS01B- och Shingriximuniserade mössen, oavsett en engångs- eller boostdosimmunisering. Dessa resultat visar att tgE-proteinet som härrör från det bakteriella expressionssystemet kan inducera både humorala och cellulära immunsvar när de formuleras med lämpliga adjuvans, och kan således betraktas som en kandidatantigen för generering av ett vaccin mot VZV.

Figur 6 Immunogenicitet av tgE i C57BL/6-möss. Doser på 5 ug tgE formulerade med 50 μL AS01B adjuvans administrerades. Detta var 1/10 av dosen av Shingrix-vaccinet. Immunisering utfördes vid veckorna 0 och 4. A, Jämförelse av antikroppsproduktion inducerad av tgE/AS01B-vaccin jämfört med Shingrix. Serumtitrar bestämdes genom ELISA-analys med användning av rgE-belagda plattor. B, Jämförelse av det neutraliserande antikroppssvaret mot vOka efter vaccination med tgE/AS01B-vaccin eller Shingrix. Neutralisationstitrarna för antiserum vid vecka 2 (vänster panel) och vecka 6 (höger panel) uttrycks som den reciproka av serumspädningen, vilket resulterar i 50 % inhibering. C, Utvärdering av gE-specifika IFN- och IL-2-svar inducerade av tgE/AS01B-vaccin eller Shingrix vid vecka 2. Antalet IFN- - och IL-2-producerande splenocyter beräknades från ELISPOT-analys efter restimulering med en pool av gE-peptider. D, Utvärdering av gE-specifika IFN- och IL-2-svar inducerade av tgE/AS01B-vaccin eller Shingrix vid vecka 8. Antalet IFN- - och IL-2-producerande splenocyter beräknades från ELISPOT-analys efter restimulering med en pool av gE-peptider. E–G, flödescytometrianalyser för gE-specifika cytokinuttryckande CD4+- och CD8+-celler. Andelen IFN- -producerande CD4+ T-celler, IL-2-producerande CD4+ T-celler och IFN- -producerande CD8+ T celler bland splenocyter bestämdes.

DISKUSSION

VZV gE är ett huvudmål för det humorala och cellmedierade immunsvaret under naturlig varicellainfektion och efter VZV Oka-vaccination. Shingrix (GSK) är ett rekombinant subenhetsvaccin som innefattar ett VZV gE uttryckt i CHO-celler och det liposombaserade adjuvansen AS01B. Annat arbete har försökt undersöka subenhetsvacciner mot HZ med användning av gE-proteiner genererade från CHO eller insektsceller formulerade med nya adjuvans (Cao et al., 2021; Lee et al., 2020; Luan et al., 2022a, Luan et al., 2022b; Wang et al., 2021; Wui et al., 2019; Wui et al., 2021). Här undersökte vi och visade att gE-proteinet kunde uttryckas lösligt och renas från E. coli, och sedan formuleras som en subenhetsvaccinkandidat med ett lämpligt adjuvans för att framkalla inte bara en robust neutraliserande titer utan också ett starkt CMI-svar.

cistanche växthöjande immunförsvar

E. coli som uttryckssystem erbjuder flera fördelar: snabb celltillväxthastighet, billiga odlingsförhållanden och ett effektivt och mångsidigt verktyg för att producera rekombinanta proteiner. Herpesvirus-associerad antigenforskning har haft flera framgångar med användning av det E. coli-baserade expressionssystemet. En neutraliserande linjär epitop gE (aa 121–135) har fusionerats med 149 aa av hepatit B-viruskärnproteinet (HBc) för att producera chimära VLP:er som kan inducera VZV-specifika neutraliserande antikroppar hos möss (Zhu et al., 2016). I en annan studie uttrycktes ett homologt gE-protein från Simian varicellavirus (SVV) i E. coli med användning av en GST-fusionsmärkning för att generera gE-antiserum (Gray et al., 2001). Hittills har det inte förekommit några rapporter om ett VZV gE-protein utan en fusionsmärkning renad från E. coli som en vaccinkandidat.

gE består av tre regioner: en 544-aa hydrofil ektodomän med en signalpeptid (aa 1–30), en 17-aa hydrofob transmembranregion och en 62-aa cytoplasmatisk svansregion. Vi undersökte flera kandidatmolekyler med olika trunkationer vid de N- eller C-terminala regionerna av gE-ektodomänen och fann att det exogena uttrycket av dessa proteiner i E. coli var bäst med användning av den trunkerade delen (data visas inte). En intakt gE-ektodomän utan en fusionsmärkning tenderar att bilda inklusionskroppar när den uttrycks av E. coli och är svår att rena. Bland de testade trunkeringskandidaterna visade gE (aa 31–358) protein högt lösligt uttryck med minimala svårigheter i dess rening, såväl som hög renhet och hög homogenitet (Figur 1), sålunda ansågs denna trunkeringskonstruktion vara en idealisk kandidatvaccin antigen. Denna trunkeringsstrategi kunde ha haft en potentiell effekt på proteinets egenskaper, särskilt dess antigenicitet. Vi hade tidigare uttryckt rekombinant gE i insektsceller och renat denna konstruktion för att immunisera BALB/c-möss och erhålla 70 gE monoklonala antikroppar för epitopanalys (Liu et al., 2015). Genom vår analys identifierade vi aa 1-194 som den immundominanta regionen (data visas inte). Liknande resultat erhölls på andra ställen, med gE-specifika mAbs som pekade på aa 109–123 och 160–316 regioner som är de regioner som är ansvariga för antikroppsstabil antikroppsbindning bland variantisolat (Vafai, 1994). I en annan studie, med användning av rekombinant hybrid gE-fragment-VLP, identifierade författarna resterna 1–134 som den mest antigena regionen av gE-protein och visade att C-terminalen av gE (resterna 303–623) som innehöll flera cysteinrester misslyckades med att producera partiklar i jäst (Fowler et al., 1995), vilket tyder på att heterologt uttryck av gE inte bara bör beakta antigeniciteten utan också lättheten att uttrycka. Här optimerade vi längden på gE-proteinet för dess effektiva lösliga uttryck med minimal minskning av antigenicitet. tgE visade liknande reaktivitet som de flesta av antikropparna i figur 3 som rgE producerat i insektsceller, vilket tyder på att nyckelepitoper är välbevarade i tgE-proteinet renat från E. coli. En studie visade dock att de immundominanta CD4+ T-cellsepitoper som kändes igen av Shingrix-vaccindonatorer var dispergerade i gE-proteinet (Voic et al., 2020). Immunogeniciteten för tgE i vår studie var identisk med den som hittades för gE härrörande från CHO-celler i Shingrix när antigen kombinerats med AS01B-adjuvans, med liknande effektiva humorala svar och CMI-svar, som visas i figur 5. Dessa resultat indikerade att det trunkerade gE härrörande från det prokaryota systemet var lika bra som den intakta gE-ektodomänen från det eukaryota systemet vad gäller antigenicitet.

cistanche tubulosa-förbättra immunförsvaret

Det finns avsevärda skillnader mellan gE-proteiner härledda från olika expressionssystem. De mest framträdande skillnaderna noteras med posttranslationella modifieringar, särskilt glykosylering. O-länkade glykaner från membranglykoproteiner har relevans när det gäller T-cells- och antikroppsigenkänning av virala glykopeptidepitoper, och denna igenkänning har potential av hög biomedicinsk betydelse i våra försök att förmedla immunskydd mot virus med hjälp av subenhetsvacciner. Avlägsnande av glykanerna i gE producerade i CHO-K1-celler resulterade i en 17% minskning av reaktiviteten med VZV-positiva sera. Däremot kan O-glykosylering störa immunreaktiviteten hos B-cellsepitoper: vissa viktiga epitoper blockeras av ytterligare O-länkade glykaner (Nordén et al., 2019). I vår studie verkar tgE som genereras från E. coli bete sig lika bra som insektscellshärledd rgE när det gäller dess immunreaktivitet och immunogenicitet, vilket tyder på att det "nakna" tgE-proteinet har lovande som en vaccinkandidat. Vacciner med tgE som antigen kommer sannolikt inte bara att inducera höga IgG-titer, vilket indikerar dess potential som ett underenhetsvaricellavaccin utan en potentiell risk för viruslatens, utan också hög CMI, vilket också tyder på dess potential som zostervaccin. Sammantaget erbjuder gE-antigenet som härrör från det bakteriella expressionssystemet i denna studie en mycket mer ekonomisk strategi för utvecklingen av VZV-vacciner.

Referenser

Adkins, JC och Wagstaff, AJ (1998). Rekombinant hepatit B-vaccin: en översyn av dess immunogenicitet och skyddande effekt mot hepatit B. Biodrugs 10, 137–158.

Arvin, AM (1992). Cellmedierad immunitet mot varicella-zoster-virus. J Infect Dis 166, S35–S41.

Cao, H., Wang, Y., Luan, N. och Liu, C. (2021). Immunogenicitet hos varicella-zoster-virusglykoprotein E formulerat med lipidnanopartiklar och nukleinimmunostimulatorer hos möss. Vacciner 9, 310.

Chen, L., Liu, J., Wang, W., Ye, J., Wen, L., Zhao, Q., Zhu, H., Cheng, T., och Xia, N. (2014). Utveckling av en varicella-zoster-virusneutraliseringsanalys med användning av en glykoprotein K-antikroppsenzymkopplad immunosorbentfläckanalys. J Virol Methods 200, 10–14.

Cohen, JI (2013). Klinisk praktik: herpes zoster. N Engl J Med 369, 255– 263. Dendouga, N., Fochesato, M., Lockman, L., Mossman, S. och Giannini, SL (2012). Cellmedierade immunsvar mot ett varicella-zoster-virusglykoprotein E-vaccin med både en TLR-agonist och QS21 hos möss. Vaccin 30, 3126–3135.

Fowler, WJ, Garcia-Valcarcel, M., Hill-Perkins, MS, Murphy, G., Harper, DR, Jeffries, DJ, Burns, NR, Adams, SE, Kingsman, AJ och Layton, GT (1995). Identifiering av immundominanta regioner och linjära B-cellsepitoper av gE-höljesproteinet från varicella-zoster-viruset. Virology 214, 531–540.

Galea, SA, Sweet, A., Beninger, P., Steinberg, SP, LaRussa, PS, Gershon, AA, och Sharrar, RG (2008). Säkerhetsprofilen för varicellavaccin: en 10-årsöversikt. J Infect Dis 197, S165–S169.

Gray, WL, Mullis, LB och Soike, KF (2001). Uttryck av Simian varicella virus glykoprotein E. Virus Res 79, 27–37.

Heininger, U. och Seward, JF (2006). Vattkoppor. Lancet 368, 1365–1376.

Kim, JY, Kim, YG och Lee, GM (2012). CHO-celler i bioteknik för produktion av rekombinanta proteiner: nuvarande tillstånd och ytterligare potential. Appl Microbiol Biotechnol 93, 917–930.

Lal, H., Cunningham, AL, Godeaux, O., Chlibek, R., Diez-Domingo, J., Hwang, SJ, Levin, MJ, McElhaney, JE, Poder, A., Puig-Barberà, J., et al. (2015). Effekten av ett adjuvantat herpes zoster-subenhetsvaccin hos äldre vuxna. N Engl J Med 372, 2087–2096.

Lee, SJ, Park, HJ, Ko, HL, Lee, JE, Lee, HJ, Kim, H. och Nam, JH (2020). Utvärdering av glykoprotein E-subenhet och levande försvagade varicella-zoster-virusvacciner formulerade med en enkelsträngad RNA-baserad adjuvans. Immun Inflamm Dis 8, 216–227.

Liu, J., Zhu, R., Ye, X., Yang, L., Wang, Y., Huang, Y., Wu, J., Wang, W., Ye, J., Li, Y., et al. (2015). En monoklonal antikroppsbaserad kvantitativ analys av VZV-glykoprotein E och dess tillämpning på antigenkvantifiering i VZV-vaccin. Appl Microbiol Biotechnol 99, 4845– 4853.

Luan, N., Cao, H., Wang, Y., Lin, K. och Liu, C. (2022a). Joniserbara lipidnanopartiklar förstärkte den synergistiska adjuvanseffekten av CpG ODNs och QS21 i ett varicella-zoster-virus glykoprotein E subenhetsvaccin. Pharmaceutics 14, 973.

Luan, N., Cao, H., Wang, Y., Lin, K. och Liu, C. (2022b). LNP-CpG ODN adjuvanserad varicella-zoster-virusglykoprotein E inducerade jämförbara nivåer av immunitet med Shingrix™ i VZV-primade möss. Virol Sin 37, 731–739.

Monie, A., Hung, CF, Roden, R. och Wu, TC (2008). Cervarix: ett vaccin för att förebygga HPV 16, 18-associerad livmoderhalscancer. Biologics 2, 97–105.

Nordén, R., Nilsson, J., Samuelsson, E., Risinger, C., Sihlbom, C., Blixt, O., Larson, G., Olofsson, S., and Bergström, T. (2019). Rekombinant glykoprotein E från varicella-zoster-virus innehåller glykan-peptidmotiv som modulerar B-cellsepitoper till diskreta immunologiska signaturer. Int J Mol Sci 20, 954.

Oliver, SL, Yang, E. och Arvin, AM (2016). Varicella-zoster-virusglykoproteiner: inträde, replikation och patogenes. Curr Clin Microbiol Rep 3, 204–215.

Overton, TW (2014). Rekombinant proteinproduktion i bakterievärdar. Drug Discov Today 19, 590–601.

Oxman, MN, Levin, MJ, Johnson, GR, Schmader, KE, Straus, SE, Gelb, LD, Arbeit, RD, Simberkoff, MS, Gershon, AA, Davis, LE, et al. (2005). Ett vaccin för att förhindra herpes zoster och postherpetisk neuralgi hos äldre vuxna. N Engl J Med 352, 2271–2284.

Shah, RA, Limmer, AL, Nwannunu, CE, Patel, RR, Mui, UN och Tyring, SK (2019). Shingrix för herpes zoster: en recension. Hudterapi Lett 24, 5–7. Singh, SM och Panda, AK (2005). Solubilisering och återveckning av bakteriella inklusionskroppsproteiner. J Biosci Bioeng 99, 303–310.

Syed, YY (2018). Rekombinant zostervaccin (Shingrix®): en recension i herpes zoster. Läkemedel Åldrande 35, 1031–1040.

Takahashi, M., Otsuka, T., Okuno, Y., Asano, Y., Yazaki, T. och Isomura, S. (1974). Det levande vaccinet används för att förhindra spridning av varicella hos barn på sjukhus. Lancet 304, 1288–1290.

Tseng, HF, Smith, N., Harpaz, R., Bialek, SR, Sy, LS och Jacobsen, SJ (2011). Herpes zoster-vaccin hos äldre vuxna och risken för efterföljande herpes zoster-sjukdom. JAMA 305, 160–166.

Vafai, A. (1994). Antikroppsbindningsställen på trunkerade former av varicella zoster-virus gpl(gE)-glykoprotein. Vaccin 12, 1265–1269.

Voic, H., de Vries, RD, Sidney, J., Rubiro, P., Moore, E., Phillips, E., Mallal, S., Schwan, B., Weiskopf, D., Sette, A., et al. (2020). Identifiering och karakterisering av CD4+ T-cellsepitoper efter Shingrix-vaccination. J Virol 94, e01641-20.

Wang, Y., Qi, J., Cao, H. och Liu, C. (2021). Immunsvar mot varicella-zoster-virusglykoprotein E formulerat med poly(mjölk-koglykolsyra) nanopartiklar och nukleinsyraadjuvans i möss. Virol Sin 36, 122–132.

Wu, T., Li, SW, Zhang, J., Ng, MH, Xia, NS och Zhao, Q. (2012). Utveckling av hepatit E-vaccin: en 14-årig odyssé. Hum Vaccin Immunother 8, 823–827.

Wui, SR, Kim, KS, Ryu, JI, Ko, A., Do, HTT, Lee, YJ, Kim, HJ, Lim, SJ, Park, SA, Cho, YJ, et al. (2019). Effektiv induktion av cellmedierad immunitet mot varicella-zoster-virusglykoprotein E lyofiliserat med ett katjoniskt liposombaserat adjuvans hos möss. Vaccin 37, 2131–2141.

Wui, SR, Ko, A., Ryu, JI, Sim, E., Lim, SJ, Park, SA, Kim, KS, Kim, H., Youn, H. och Lee, NG (2021). Effekten av en TLR4-agonist/katjonisk liposomadjuvans på varicella-zoster-virusglykoprotein E-vaccinets effektivitet: antigenpresentation, upptag och leverans till lymfkörtlar. Pharmaceutics 13, 390.

Zerboni, L., Sen, N., Oliver, SL och Arvin, AM (2014). Molekylära mekanismer för patogenes av varicella zoster-virus. Nat Rev Microbiol 12, 197–210.

Zhu, R., Liu, J., Chen, C., Ye, X., Xu, L., Wang, W., Zhao, Q., Zhu, H., Cheng, T., och Xia, N. (2016). En mycket konserverad epitopvaccinkandidat mot varicella-zoster-virus inducerar neutraliserande antikroppar hos möss. Vaccin 34, 1589–1596.