Tubulosid B från Cistanche Salsa räddar PC12-neuroncellerna från 1-metyl-4-fenylpyridiniumjoninducerad apoptos och oxidativ stress

Introduktion

Patologiskt kännetecknas sporadisk Parkinsons sjukdom (PD) typiskt av en förlust av katekolaminerga neuroner, särskilt dopaminerga neuroner från substantia nigra pars compacta (SNc), och närvaron av karakteristiska intraneurona| inneslutningar som kallas Lewy-kroppar i drabbade hjärnregioner. Trots en mängd olika faktorer som har varit inblandade i patogenesen av PD, är mekanismerna involverade i initieringen och progressionen av PD fortfarande osäkra. Även om orsaken till PD fortfarande är besvarad, tyder flera bevis starkt på involveringen av oxidativ stress, vilket slutligen leder till till neuronal död eller apoptos genom överdriven generering av fria radikaler. Det faktum att det nigrala dopaminerga systemet kan producera höga nivåer av fria radikaler och har relativt låga nivåer av oxidativt försvarssystem stödjer ytterligare denna hypotes. Både in vivo och in vitro-studier visade oxidativ stress-medierad neurotoxicitet av MPP ＋, en aktiv metabolit av l-metyl-4-fenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) på dopaminerga neuroner. Inblandningen av fria radikaler överdrivet producerade av oxidativ stress som den närmaste orsaken till neurodegenerativa störningar som PD antyder en central roll för antioxidanter. Tubulosid B (fig. l) var en av de fenyletanoidföreningar som isolerats från stjälkar av Cistanche salsa. Tidigare studier hade funnit att många fenyletanoider inklusive tubulosid B visade en stark rensning av fria radikaler.

Med tanke på dessa fynd undersökte vi i denna studie effekten av tubu]nside B på MPP+-inducerad neurotoxicitet in vitro, med hjälp av den sympatiska nervens feokromocytomcellinje PC12 som framgångsrikt har använts under åren för att studera neuronal funktion.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR FÖREBYGGANDE AV PARKINSONS SJUKDOM PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Material och metoder

Material

Tubuloside B från Cistanche Salsa levererades vänligt av Dr Li Lei (Department of Natural Products, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Peking, Kina). Renheten hos föreningen var mer än 98 % enligt HPLC-analys. Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM), hästserum och fetalt kalvserum köptes från GIBCO BRL, 1-methyl~-phenylpyridi onium ion (MPP+), poly-L-lysin, 3-(4,{ {8}}dimetyltiazol-2 -yl)-2,5- difenyltetrazoliumbromid (MTT), propidiumjodid (PI), RNas A, proteinas K och 2; 7'-diklorfluoresceindiacetat (DCFH-DA) köptes från Sigma.

Cell kultur

PCI2-celler bibehölls i DMEM kompletterat med 10% hästserum, 5% fetalt kalvserum, 100 U/ml penicillin och 100 ug/ml streptomycin. Cellerna odlades i en fuktad inkubator luftad med 95 % luft och 5 % CO2 vid 37 grader. Alla experiment utfördes 24-48 timmar efter att celler såddes. Cellerna skördades rutinmässigt genom trypsinisering 0,25 % när cellerna närmade sig det subkonfluenta stadiet och ströks ut i 25 cm odlingskolvar delade i 1:8.

Analys av cellviabilitet

Cellviabiliteten bestämdes med hjälp av en modifierad MTT-analys som beskrivits tidigare [10], i korthet såddes PC12-celler i 96-brunnsplattor med en densitet av I × 104 celler per brunn. Kulturerna odlades i 48 timmar och sedan byttes mediet till det som innehöll olika koncentrationer av burnside B eller MPP＋. Efter inkubation i upp till 48 timmar och 72 timmar sattes MTr-lösning (5 mg/ml i DMEM) till 96-brunnsplattorna och cellerna fick inkubera i 4 timmar vid 37 grader. Efter att mediet hade avlägsnats var cellen och färgkristallerna lösliga genom att tillsätta 200 μL DMSO, och absorptionen mättes vid 570 nm (540 nm som referens) med en modell 550 mikroplattläsare (Bio-Rad). Cellviabilitet analyserades också med användning av trypanblått-uteslutningsmetoden. Cellerna uppsamlades, pelleterades försiktigt och färgades med en 0,6% lösning av trypanblått under 3 regn. Procentandelen icke-färgade celler bedömdes därefter i tio slumpmässigt utvalda mikroskopfält. Som ett positivt läkemedel användes 100 ng／ml epidermal tillväxtfaktor (EGF).

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR FRI RADIKALSÄNDNINGSAKTIVITET PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Detektion av apoptos genom flödescytometri

Apoptotiska celler detekterades genom flödescytometri med propidiumjodid (PI) [11]. Kortfattat skördades cirka 1 × 106 celler inkuberade med testsubstanser genom centrifugering och tvättades en gång med PBS. Celler fixerades med 70 % etanol under 24 timmar vid - 20 grad och tvättades en gång med PBS. Cellerna återsuspenderades sedan i 300 μL PBS innehållande 0,5 mg/ml RNaseA och 0,5 mg/ml PI. Efter ytterligare inkubation under 30 minuter i mörker utfördes flödescytometri med en FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg, Tyskland).

Analys av DNA-fragmentering genom elektrofores

Vi tillämpade Moores protokoll [12] som isolerade endast fragmenterat DNA och experiment normaliserades genom att använda lika många kulturer från varje testgrupp. Kortfattat tvättades 3 × 106 neuroner från vart och ett av de behandlade proverna i Hanks balanserade saltlösning (1000g i 10 minuter), och pelletsen som bildades i botten av röret homogeniserades med 1 ml lyseringsbuffert (10 mM Tris vid pH 7,4. 5 mM EDTA, 1 % Triton X-100) under 20 minuter på is. Efter centrifugering vid 11,000 g för 20 regn vid 4 grader, avlägsnades supernatanter innehållande fragmenterat DNA och digererades med 20 mg/ml RNas A vid 37 grader i 1 timme och 0,1 mg/ml proteinas K vid 56 grader i ytterligare 1 timme. Det fragmenterade DNA:t extraherades med hjälp av fenol och kloroform och centrifugerades vid 1O, 000g under 1 regn vid 4 C. Vattenfasen överfördes till ett nytt Eppendorf-rör, blandades med 2 volymer iskall etanol och sedan placeras vid 20 grader i minst 1 timme för att fälla ut DNA. Efter centrifugering vid 15,000g i 20 minuter vid 4 grader, avlägsnades supernatanter och DNA-pellets tvättades med 80 % etanol en gång (15 000 g under 15 minuter vid 4 grader), lufttorkades och löstes i 20 μL TE-buffert vid pH 7,6. Hela provet underkastades sedan elektrofores på en 1,5 % agarosgel i 1 timme vid 85 V. Gelén undersöktes och fotograferades av ett Ultra Violet Products Gel Documentation System (GELDOC-2000, Bio-Rad, USA).

Mätning av intracellulär ROS-bildning

Bildandet av intracellulära peroxider detekterades med ett konfokalt skanningslasermikroskop med användning av en icke-fluorescerande förening, 2"7"-diklorfluoresceindiacetat (DCFH-DA) [13], som avförestras i celler av endogena esteraser till det joniserade fria. syra, 2;7"-diklorfluorescein. 2",7-Diklorfluorescein kan oxideras till fluorescerande 2"7"-diklorfluorescein (DCF) av hydroantioxidanter. Celler inkuberades med 10 μM DCFH-DA i 30 minuter vid 37 grader. Kulturer tvättades två gånger med Hanks balanserade saltlösning och avbildades i samma medium. Avbildning gjordes med ett konfokalt skanningslasermikroskop, DCF exciterades vid 488 nm och emissionsfiltret var ett 510 nm barriärfilter. För att ge en giltig jämförelse användes samma insamlingsparametrar för alla observationer. Den optimala vertikala positionen i mitten av cellerna ställdes in, och sedan skannades fältet snabbt. Eftersom belysning vid excitationsvåglängden 488 nm orsakade ökad fluorescens på grund av oxidation av detta färgämne, exponerades varje fält för ljus under samma tid. Baslinjevärden från ostimulerade celler användes som kontrollvärden för att jämföra med MPP＋ behandlade celler i närvaro eller frånvaro avtubulosid B. Efter skanning kvantifierades den genomsnittliga relativa fluorescensintensiteten i 15-20 neuronala cellkroppar per mikroskopfält i fyra separata kulturer per behandlingstillstånd.

Statistisk analys

Alla erhållna värden uttrycktes som medelvärden ±SD. Den statistiska signifikansen av skillnader mellan grupperna bestämdes med Students t-test; Beräknade p-värden på mindre än 0.05 ansågs vara statistiskt signifikanta.

Resultat

Såsom visas i fig. 2 producerade MPP+ en dosberoende minskning av livsdugligheten hos PCI2-cellerna. Däremot producerade EGF, en välkänd neurotrofisk faktor, ett betydande skydd av cellviabilitet vid 100 ng/ml MPP＋-inducerade cytotoxiska effekter också försvagades i närvaro av tubulosid B (5, 10, 50 eller 100 ug-ml{{12} }), men med mindre styrka än referensen

läkemedel (Fig.3). Tubulosid B vid dessa koncentrationer uppvisade cytoskyddande effekter på ett dosberoende sätt och föreningen ensam orsakade inte någon uppenbar cytotoxicitet (data visas inte). Gelelektrofores av DNA-extraktet från PCI 2-celler behandlade med 200 µM MPP+ under 48 timmar visade DNA-stegar. ett klassiskt kännetecken för apoptos, tubulosid B, vid doser på 10 och 100 μ g·ml -1utbildad bildning av DNA-stegen (fig. 4) . Fig. 5 visar typiska histogram av den flödescytometriska analysen av apoptotisk celldöd inducerad av MPP＋ i PC12-celler i närvaro eller frånvaro av tubulosid B. Kvantifiering av cellcykelprofilen med PI avslöjade antalet celler med subdiploida egenskaper (M1-region) tyder på apoptotisk DNA-fragmentering. I obehandlade celler var den apoptotiska subdiploida fraktionen minimal upp till 5．94％ av de totala 10 000 cellerna (Fig. 5 A). Efter 48 timmars exponering för MPP＋ ökade andelen apoptos till 43．02;j;(Fig．5 B)． När tillsatt till cellkulturen, tubulosid Bhämmad MPP+-inducerad apoptospå ett dosberoende sätt. Vid en koncentration på 10 ug·ml-1var skyddet av tubulosid B inte statistiskt signifikant, men vid 50 och 1 00ug·ml-1, en minskning med 45 ％ respektive 63 ．. var observerad. öka andelen överlevnadsceller (Fig．5D, E)．

Ackumulering av intracellulär ROS kan detekteras med användning av DCFH-DA．PC12-celler behandlade med 200 uM MPP＋ under 48 timmar visade intensiv fluorescens inuti cellen efter färgning med DCFH-DA-färgämne (Fig. 6)． Samtidig behandling med tubulosid B (vid doser på 10 och 100 ug·ml.) hämmade MPP＋一-inducerad ROS-produktion (reducerad procentandel var 24．52％ respektive 55．63％).

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR BEHANDLING AV PARKINSONS SJUKDOM PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Diskussion

Patogenesen av PD involverar stark oxidativ stress, minskade antioxidantnivåer och mitokondriella defekter. alla kända för att inducera apoptos i flera cellulära system. I synnerhet har fria radikaler visat sig utlösa aktiv celldöd i neuroner[14]. MPTP producerar ett irreversibelt och allvarligt Parkinson-liknande syndrom som orsakar selektiv degeneration av de nigrostriatala dopaminerga neuronerna hos människor. Detta neurotoxin har använts för att skapa. åt djurmodeller av PD[15]．MPTP omvandlas av monoaminoxidas B till Mpp＋, som ackumuleras i mitokondrier． där det hämmar mitokondriellt komplex I och det mitokondriella dys. funktion orsakar apoptos[16]. Därför har MPP+一inducerad neurotoxicitet i dopaminerga neuroner använts i stor utsträckning som en etiologisk modell av PD för screening av neuroprotektiva medel.

I denna studie har vi visat att MPP+-inducerad celldöd via oxidativ stress i PC12-celler reducerades av tubulosid B. Vidare visade vi att tubulosid B också skyddade på ett dosberoende sätt mot MPP{{ 3}}inducerad DNA-trappning och apoptos, mätt med DNA-gelelektrofores och flödescytometrisk analys. Dessutom inhiberade samtidig behandling med högre koncentrationer av tubulosid B MPP-inducerad ROS-produktion. Tubulosid B har således visat multifunktionellt neuroskyddande effekter. Flera mekanismer, separat eller i förening, kan vara involverade i verkningarna av tubulosid B. Antioxidanteffekten är en möjlig mekanism för tubulosid B-medierat neuroskydd. Xiong Q fann att tubulosid B visade en stark fria radikalfångande aktivitet på den 1,1-difenyl-2-pikrylhydrazylradikal och xantin]xantinoxidas-genererade superoxidanjonradikalen.

Flera fenyletanoider har nyligen rapporterats ha fria radikaler som avlägsnar egenskaper och skyddar oxidativ stress-inducerade toxiska skador. ROS producerat av MPP+ såsom väteperoxid, superoxidanjon och hydroxylradikal skadar lätt biologiska molekyler, vilket i slutändan kan leda till apoptotisk eller nekrotisk celldöd. Således kan tubulosid B ha direkta renande effekter mot ROS. Även om våra data inte fastställer den exakta platsen där tubulosid B verkar för att undertrycka ROS-ackumulering, tyder de på att den neuroprotektiva mekanismen involverar stimulering av antioxidantvägar. En studie av den molekylära strukturen hos tubulosid B indikerar också att den har en potent kapacitet förrensar bort fria radikaler(personlig kommunikation).

Andra mekanismer kan också vara relevanta. Till exempel kan tubulosid B ha kapacitet att motverka toxiciteten av MPP＋ genom att hämma öppningen av mitokondriella permeabilitetsövergångsporer och dysfunktion. Dessutom bör om tubulosid B har en direkt tillväxtfrämjande effekt på neuronala celler också övervägas. Den exakta mekanismen för den neuroprotektiva effekten av tubulosid B är fortfarande oklar. Ytterligare studier krävs för att belysa hela bilden av dess neuroprotektiva effekt.

Slutligen tubulosid B frånCistanche salsa extrakthar uppenbara skyddande effekter på MPP+-inducerad apoptos och oxidativ stress. Dess neuroprotektiva effekter mot MPP ＋ toxicitet kan vara viktiga och tyder på att det kan ha terapeutisk potential vid förebyggande och behandling av PD.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR BEHANDLING AV PARKINSONS SJUKDOM PHGS75% ECH 30% ACT 12%