Tumörceller kan inte presentera MHC-II-begränsade epitoper härledda från onkogener till CD4+ T-celler

CD4+ T-celler spelar en avgörande roll i antitumörimmunitet genom igenkänning av peptidantigener som presenteras på MHC klass II (MHC-II). Även om vissa fasta cancerformer kan induceras att uttrycka MHC-II, är det oklart i vilken utsträckning detta möjliggör direkt igenkänning av tumörspecifika CD4+ T-celler. Vi isolerade och karakteriserade T-cellsantigenreceptorer (TCR) från naturligt primade CD4+ T-celler specifika för 2 onkoproteiner, HPV-16 E6, och den aktiverande KRASG12V-mutationen, från patienter med skivepitelcancer i huvud och hals respektive pankreatiskt duktalt adenokarcinom och bestämde deras förmåga att känna igen autologa eller humana leukocytantigenmatchade antigenuttryckande tumörceller. Vi fann i båda fallen att TCR:erna kunde känna igen peptidladdade målceller som uttrycker de relevanta MHC-II- eller B-cellantigenpresenterande cellerna (APC) när antigenerna uttrycktes endogent och riktades till den endosomala vägen men misslyckades med att känna igen tumören celler som uttrycker källproteinet även efter induktion av yt-MHC-II-expression av IFN- eller transduktion med CIITA. Dessa resultat tyder på att priming och funktionell igenkänning av både ett nukleärt (E6) och ett membranassocierat (KRAS) onkoprotein är övervägande begränsade till korspresenterande APC snarare än via direkt igenkänning av tumörceller inducerade att uttrycka MHC-II.

Fördelarna med cistanche tubulosa-Antitumor

Introduktion

Malign transformation av somatiska celler initieras av verkan av aktiverade onkogener som dysregulerar celltillväxtvägar och leder till okontrollerad proliferation (1). När det gäller HPV-associerade cancerformer bidrar uttrycket av de tidiga HPV-generna E6 och E7 till onkogenes genom att hämma tumörsuppressorgenerna p53 respektive Rb (2). Alternativt kan konstitutiv onkogenaktivering ske genom somatisk mutation i gener som reglerar celltillväxt och proliferationsvägar, såsom RAS-familjen. Faktum är att aktiverande KRAS-mutationer som KRASG12V är vanliga hos patienter med cancer i bukspottkörteln, tjocktarmen och lungcancer (3). Även om onkogener främjar sjukdom, kan de också tillhandahålla mål för värdens immunsystem. På senare år har immunsystemets roll för att kontrollera HPV-associerade cancerformer blivit allmänt erkänd. CD8+ och CD4+ T-celler som känner igen HPV E6 och E7, såväl som andra HPV-proteiner, har identifierats i både det perifera blodet och tumörinfiltrerande lymfocyter (TIL) från patienter med HPV-associerade cancerformer (4–6). Immunterapier riktade mot dessa antigener, inklusive terapeutiska cancervacciner och adoptiv cellterapi (ACT) med TILs eller TCR-konstruerade T-celler, är ett aktivt område för preklinisk och klinisk undersökning (2). T-cellssvar mot onkogena mutationer har också beskrivits brett (7–9). Dessutom finns det direkta kliniska bevis för att ACT med TILs riktade mot mutant KRAS kan främja objektiva svar (10). Även om CD8+ T-celler som känner igen epitoper härledda från onkogener medierar direkt cytotoxicitet mot tumörceller (11–13), är CD4+ T-cellers roll i antitumörimmunitet mindre välkänd. Nyligen genomförda studier har belyst en undergrupp av CD4+ T-celler som uttrycker cytotoxiska markörer, såsom granzym B (GrzmB), i humana cancerformer (14, 15). Antigenspecificiteterna för dessa celler, och därmed deras terapeutiska potential, förblir emellertid i stort sett okända. Dessutom, för att dessa cytotoxiska CD4+ T-celler ska känna igen och döda tumörceller, måste inte bara tumörcellen uttrycka MHC-II, utan också de relevanta antigenerna måste riktas till lämplig presentationsväg. I denna studie undersökte vi kapaciteten hos CD4+ T-celler specifika för onkoproteinerna HPV-16 E6 och KRASG12V att känna igen antigenuttryckande tumörceller. Även om båda TCR:er kunde direkt känna igen endogent bearbetade och presenterade antigener riktade till den endosomala avdelningen av HLA-matchade B-celler, var ingen av dem kapabel att känna igen antigenuttryckande tumörceller med inducerat uttryck av MHC-II. Sammantaget tyder våra resultat på att endast vissa antigener presenteras direkt på MHC-II+-tumörceller, vilket kan begränsa poolen av CD4+ T-celler som direkt kan känna igen och eliminera tumörceller.

cistanche fördelar för män stärker immunförsvaret

Klicka här för att se produkter från Cistanche Enhance Immunity

【Be om mer】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Resultat

Identifiering av HPV-16 E6-specifik CD4+ och CD8+ T-cellssvar från TILs av skivepitelcancer i huvud och hals. Vi screenade en serie individuella TIL-kulturer isolerade från 2 till 4 mm tumörfragment från en patient (Hu-56) med HPV-16+ skivepitelcancer i huvud och hals (HNSCC) (kompletterande tabell 1; kompletterande material tillgänglig online med den här artikeln; https://doi.org/10.1172/jci.insight.165570DS1) av IFN-ELISPOT-analyser för att identifiera T-cellssvar riktade mot HPV-16 virala onkoproteiner E6 och E7, med hjälp av peptidpooler som omfattar överlappande 15-merer som spänner över längden av E6- och E7-proteinerna. Särskilt, TIL-fragment 12 och 29 genererade ett betydande antal fläckar över bakgrunden när de återstimulerades med E6-peptidpoolen och innehöll både CD4+ och CD8+ T-celler (Figur 1A och tilläggsfigur 1A). För att identifiera de relevanta T-cellsundergrupperna analyserade vi dessa TIL-kulturer med hjälp av en cytokinsekretionsanalys. Detta avslöjade TIL-fragment 29 (F29) innehöll E6-reaktiva CD8+ T-celler, medan fragment 12 (F12) innehöll både CD4+ och CD8+ T-celler som kan igenkännande av E6-peptidpoolen (Figur IB). Ingen av CD4+ T-cellerna producerade IL-5 som svar på E6-återstimulering, vilket validerade en Th1-liknande fenotyp. För att bestämma TCR-klonaliteten för E6-specifika TIL, sorterade vi enstaka IFN- –utsöndrande CD4+ T-celler från F12 och CD8+ T-celler från F12 och F29. TCR-sekvensering avslöjade en enda TCR uttryckt av IFN- – utsöndrande CD4+ T-celler (n=31 av 31 sekvenserade celler), såväl som en enda TCR-klon delad av IFN- – utsöndrande CD{{53 }} T-celler från både F12 och F29 (n=40 av 41 respektive 37 av 38 celler sekvenserade) (kompletterande tabell 2). Dessa resultat indikerar att monoklonala CD-4+- och CD-8+-T-celler som är reaktiva mot E6 finns i TIL från denna patient. HLA-A*02:01–begränsade CD8+ T-celler från TILs känner igen E6 som presenteras av en patienthärledd tumörcellinje. TILs från F29 producerade IFN- när de återstimulerades med E629-38-peptiden, vilket tyder på att F29 TCR kände igen denna tidigare beskrivna HLA-A*02:01-begränsade epitop (kompletterande figur 1B) (11). Detta bekräftades av tetramerbindningsstudier med E629-38/HLA-A*02:01 för att märka TCR-defekta J76-celler som uttrycker human CD8 och med användning av en tidigare beskriven E628-38-specifik TCR som en positiv kontroll (Figur 2A) (11). Båda TCR:erna uppvisade liknande nivåer av funktionell aviditet, vilket visas genom uppreglering av den akuta aktiveringsmarkören CD69 på J76 efter stimulering med autologa B-lymfoblastoidcellinjer (B-LCL) pulsade med titrerade koncentrationer av E629-38-peptid (Figur 2, B och C). Dessa data validerar närvaron av en CD8+ T-cellsklon specifik för en känd epitop av E6 med liknande funktionella egenskaper som en TCR som har testats i en klinisk miljö (16). Vi försökte sedan avgöra om den E6-specifika CD8+ TCR kunde känna igen endogent uttryckta antigener och därigenom förmedla antitumörcytotoxicitet. För att göra detta använde vi en välkarakteriserad HLA-A*02:01+ HPV-16+-tumörlinje, CaSki, samt en autolog tumörcellinje, HNSCC-56, genererad genom cellulär omprogrammering av primär tumörvävnad som tidigare beskrivits (17) för in vitro cytotoxicitetsanalyser. RNA-Seq-analys validerade uttrycket av HPV-16 tidiga gener, inklusive E6, av både det primära tumörprovet och den autologa cellinjen (kompletterande figur 1C). Primära humana CD8+ T-celler som uttrycker F29 TCR kan förmedla celldöd av både CaSki och HNSCC-56 vid en rad effektor-till-mål-förhållanden in vitro (Figur 2, D och E). Tillsammans validerar dessa data att F29 TCR känner igen endogent uttryckt E6-antigen. Identifiering av en HLA-DQ-begränsad, E6-specifik CD4+ T-cell från TILs. För att utöka E6-specifika TILs för ytterligare funktionell analys använde vi det tidigare beskrivna protokollet för snabb expansionsodling med OKT-3 och bestrålade allogena PBMCs för att expandera TIL från F12. Även om den primära F12-kulturen ursprungligen innehöll både CD8+ och CD4+ T-celler med E6-reaktivitet, innehöll den slutliga cellprodukten efter snabb expansion 99 % CD4+ T-celler, varav cirka 38,33 % visade reaktivitet mot E6, vilket visades genom intracellulär cytokinfärgning för IFN- (Figur 3A).

Kinesisk ört cistanche växt-Antitumor

Förutom IFN- kunde stimulerade E6-specifika CD4+ TILs utsöndra TNF- men inte IL-2 (tilläggsfigur 2A). Även om den totala frekvensen av GrzmB+-celler inte ökade med antigenstimulering, visade gating på TNF-utsöndrande celler att E6-specifika CD4+ TILs innehöll mer lagrade intracellulära GrzmB än icke-specifika TIL (kompletterande figur 2B) ). IFN- –utsöndrande CD4+ TILs uttryckte också den samhiberande markören programmerad celldöd 1 (PD-1), i överensstämmelse med publicerade signaturer av tumörreaktiva CD4+ TILs (tilläggsfigur 2C) ( 18, 19). E6-specifika CD4+ TILs visade en hög funktionell aviditet eftersom dessa celler kunde utsöndra cytokiner vid peptidkoncentrationer mindre än 1 ug/ml (Figur 3B). För att bestämma specificiteten för F12 TIL-kulturen pulserade vi autologa B-LCL med individuella peptider motsvarande var och en av de 37 peptiderna som fanns i den ursprungliga E6-poolen (kompletterande tabell 3). CD4+ TIL från F12 utsöndrade IFN- när de stimulerades med peptiderna E61-15 och E65-19, som delar en kärnsekvens på 11 aminosyror (kompletterande figur 2D). Samodlingsexperiment i närvaro av HLA-blockerande Abs avslöjade signifikant minskad IFN-sekretion av TILs när B-LCLs blockerades med anti-HLA-DQ Abs men inte anti-HLA-DR eller isotypkontroll Abs (Figur 3C). För att bestämma vilka HLA-DQ-alleler som är ansvariga för presentationen av denna epitop pulserade vi B-LCL som uttrycker kända HLA-DQ-alleler (kompletterande tabell 4) med E61-15 och fann att KAS011-celler som uttrycker HLA-DQA1*01 :02 och DQB1*05:02, men inte Hu-195 B-LCL som uttrycker DQA1*05:05 och DQB1*03:01, skulle kunna presentera antigen för TIL på ett jämförbart sätt som autologa Hu{{63} } B-LCL (Figur 3D). Slutligen försökte vi verifiera att den tidigare identifierade TCR-sekvensen verkligen var ansvarig för E6-igenkänning. Expression av F12 TCR i primära humana friska donator-CD4+ T-celler var tillräckligt för att främja igenkänning av E61-15-peptiden, vilket framgår av uppregleringen av CD69 och PD-1 (Figur 3E ). Sammantaget visar dessa resultat identifieringen av en HLA-DQ-begränsad epitop av E6 som känns igen av monoklonala CD4+ TILs. E6-specifika CD4+ T-celler känner inte igen eller dödar inte autologa tumörceller som uttrycker MHC-II. Nyligen genomförda studier har identifierat genetiska signaturer av cytotoxiska CD4+ TILs i vissa humana cancerformer (14, 15). Huruvida cytotoxiska CD4+ T-celler spelar en roll i HPV-drivna cancerformer är dock okänt. För att avgöra om E6-specifika CD4+ T-celler från TILs direkt kunde känna igen HNSCC-56, undersökte vi först dess MHC-II-uttrycksstatus. Även om tumörcellerna inte uttryckte någon detekterbar yta MHC-II i kultur, var behandling med IFN- under 72 timmar tillräcklig för att inducera uppreglering av MHC-II (Figur 4A). Därefter odlade vi HNSCC-56 med CD4+ F12 TILs. Viktigt är att MHC-II+-tumörceller förkonditionerade med IFN- inte kunde stimulera CD4+ TILs mätt med IFN-sekretion (Figur 4B).

Figur 1. Identifiering av E6-reaktiv CD4+ och CD8+ TIL från HPV-16+ HNSCC. (A)

Figur 2. Funktionella egenskaper hos en HLA-A*02:01-begränsad, E6-specifik TCR från Hu-56 TIL. (A)

Emellertid kunde IFN-behandlade tumörcellinjer pulsade med E61-15 före tillägget av TILs stimulera ett T-cellssvar, vilket indikerar att ytuttryck av de begränsande HLA-DQ-allelerna i en cellinje som endogent uttrycker E6 var inte tillräckligt för tumörigenkänning men krävde exogen laddning av målpeptiden. Samma krav på exogen målpeptidladdning observerades med CIITA-transducerade tumörceller (HNSCC -56 CIITA), som konstitutivt uttrycker höga nivåer av yt-MHC-II (Figur 4B). För att testa om CD4+ TILs kunde känna igen en endogent bearbetad och presenterad version av E6-epitopen på en APC, transducerade vi retroviralt autologa B-LCLs med en expressionskonstruktion som kodar för de första 50 aminosyrorna av E6 smält till MHC- I-transmembrandomän (E6-MITD), som inducerar lokalisering av den sammansmälta aminosyrasekvensen till plasmamembranet och stödjer presentation på MHC-II via endosomal trafik (20). B-LCL som uttrycker E6-MITD-konstruktionen skulle kunna stimulera E6-specifika CD4+ TIL, vilket indikerar att peptidepitopen som känns igen av dessa TIL kan bearbetas naturligt och presenteras på MHC-II när riktad till lämplig väg (Figur 4C).

Figur 3. Funktionella egenskaper hos klonalt expanderade, HLA-DQ-begränsade, E6-specifika CD4+ TIL. (A)

Därefter försökte vi avgöra om de F12 E6-specifika CD4+ TILs var kapabla till direkt tumörcytotoxicitet. I enlighet med data från våra igenkänningsanalyser kunde E6-specifika CD4+ TILs inte begränsa tillväxten av HNSCC-56-tumörceller, som inte uttrycker MHC-II (Figur 4D) . Dessutom växte HNSCC-56 CIITA-tumörceller också ohämmade i närvaro av CD4+ TIL. Tillväxten av HNSCC-56 CIITA-tumörceller pulserade med E61-15-peptid hämmades dock på ett effektorcellsdosberoende sätt. Sammantaget tyder dessa data på att även om HNSCC-56 kan presentera E6-epitoper för CD8+ T-celler, kan E6-specifika CD4+ TILs inte direkt känna igen och lysera MHC- II+ autologa tumörceller. Gener involverade i antigenpresentation muteras ofta i cancer, vilket kan förhindra igenkänning av T-celler (21). För att avgöra om HNSCC-56-tumörceller innehöll några somatiska mutationer som utesluter antigenpresentation på MHC-II, utförde vi helexomsekvensering av tumörceller och PBMC från Hu-56 som ett referensprov. Av de 104 identifierade icke-synonyma somatiska mutationerna fanns det inga uppenbara mutationer i komponenter i MHC-II-presentationsvägen, inklusive HLADMA, HLADMB och CD74 (kompletterande tabell 5). Identifiering av en HLA-DRB5*01:01-begränsad, KRASG12V-specifik TCR från blodet från en patient med pankreatiskt ductalt adenokarcinom. Efter dessa resultat bestämde vi oss för att bestämma om oförmågan hos tumörceller att presentera antigen på MHC-II var sant för andra onkogener. Med tanke på att cirkulerande tumörspecifika T-celler har identifierats hos mänskliga patienter med cancer (8, 22), stimulerade vi PBMC från en patient (Hu-66) med pankreatiskt duktalt adenokarcinom (kompletterande tabell 1) med en pool av peptider motsvarande vanliga onkogena mutationer (kompletterande tabell 6) i 14 dagar före restimulering med individuella peptider för att identifiera relevanta T-cellssvar av ELISPOT. Dessa resultat indikerade närvaron av ett T-cellssvar riktat mot KRASG12V, vilket framgår av ett ökat antal IFN-fläckar över bakgrunden som svar på KRASG12V-aminosyrorna 1-15 (Figur 5A). För att identifiera de relevanta TCR som är associerade med detta svar använde vi återigen cytokinsekretionsanalysen för att sortera IFN---utsöndrande celler. Cytokinsekretionsanalysen avslöjade specifik produktion av IFN- av CD4+ T-celler som svar på restimulering med KRASG12V (Figur 5B). Att jämföra TCR-kedjorna från sorterade IFN---utsöndrande celler med de som finns i oexpanderade PBMC från denna patient avslöjade en enda TCR-klonotyp närvarande med den högsta frekvensen bland båda populationerna (Figur 5C och tilläggstabell 2). Dessa resultat indikerar att frekvensen av denna T-cellklon utökades vid baslinjen i PBMC, vilket tyder på ett naturligt uppkommande in vivo-svar snarare än in vitro-priming i vår expansionskultur. För att verifiera antigenspecificiteten för denna TCR uttryckte vi den i primära humana CD4+ T-celler genom retroviral transduktion och odlade dessa celler med autologa B-LCL pulsade med antingen den mutanta KRASG12V eller motsvarande WT-peptid. Konstruerade T-celler utsöndrade IFN- när de stimulerades med den mutanta, men inte WT, KRAS-peptiden, vilket verifierar att denna TCR är specifik för KRASG12V (Figur 5D). I överensstämmelse med våra resultat från E6 TCR kunde konstruerade T-celler som uttrycker den KRASG12V-specifika TCR också känna igen B-LCL som uttrycker ett fragment av KRASG12V, men inte WT KRAS, riktat till endosomen genom inkludering av en MITD, vilket tyder på att detta TCR känner igen endogent bearbetat och presenterat antigen (Figur 5D).

Figur 4. Autologa tumörceller uppvisar inte endogent E61-15 på MHC-II till CD4+ T-celler. (A)

Figur 5. Identifiering av en HLA-DRB5*01:01–begränsad, KRASG12V-specifik TCR från blodet från en patient med pankreatiskt ductalt adenokarcinom. (A)

För att identifiera den begränsande HLA-allelen upprepade vi dessa peptidstimuleringsexperiment med B-LCL som uttrycker olika kombinationer av HLA-gener. B-LCL som uttrycker den vanliga HLA-B7-DR15-DQ6-haplotypen kan stimulera de konstruerade T-cellerna, medan B-LCL utan dessa alleler inte kunde (Figur 5E). I slutändan verifierade stimulering av dessa celler med peptidpulsad IHW03304, en mus DAP3-cellinje transfekterad med human HLA-DRB5*01:01, detta som den begränsande HLA-molekylen (Figur 5F). MHC-II+ NCI-H2444 och DAN-G tumörceller presenterar inte KRASG12V-härledda epitop till CD4+ T-celler. Därefter undersökte vi kapaciteten hos tumörceller att direkt presentera KRASG12V-härledda epitoper på MHC-II. För att generera HLA-matchade MHC-II+-cellinjer för dessa studier transducerade vi KRASG12V+-cellinjerna NCI-H2444 och DAN-G, härledda från humana lung- och pankreascancer, med CIITA och en konstruktion som kodar för HLA-DRB5*01: 01 med en trunkerad CD34-reportergen (Figur 6A). I enlighet med våra tidigare resultat kunde MHC-II+-tumörceller som uttrycker den begränsande HLA-allelen inte stimulera TCR-konstruerade T-celler om inte målceller först pulserades med exogen peptid (Figur 6B). Viktigt är att det inte fanns några listade somatiska mutationer i MHC-II-presentationsgener (nämligen HLADMA, HLADMB, CD74) för varken NCI-H2444 eller DAN-G i offentligt tillgängliga sekvenseringsdata (23). NCI-H2444 CIITA-celler växte ohämmade i närvaro av TCR-konstruerade T-celler, medan NCI-H2444 CIITA-celler pulserade med KRASG12V-peptid upplevde fördröjd tumörtillväxt (Figur 6C). I överensstämmelse med resultaten som erhölls för HNSCC-56, CD8+ T-celler som uttrycker en HLA-A*03:01– begränsad, KRASG12V-specifik TCR (24) kunde känna igen NCI-H2444-celler men inte CaSki-celler, som uttrycker HLA-A*03:01 men inte KRASG12V (Figur 6D). Dessa resultat visar att en distinkt onkogen närvarande i cytosolen inte heller kan presenteras av MHC-II+-tumörceller trots att den effektivt presenteras på MHC-I. Uttryck av samhiberande ligander såsom programmerad celldödsligand 1 (PD-L1) av tumörceller begränsar TCR-signalering i T-celler (25). För att avgöra om denna mekanism kan förhindra igenkänning av MHC-II+-tumörceller av CD4+ T-celler, odlade vi CD4+ T-celler som uttrycker vår KRASG12V-specifika TCR eller den E6-specifika F12 TCR med NCI-H2444 CIITA respektive HNSCC-56 CIITA, med eller utan anti-PD-L1-blockerande abs. Blockering av PD-L1/PD-1-interaktioner var inte tillräcklig för att främja igenkänning av tumörceller (kompletterande figur 3). På liknande sätt modulerade inte tillägget av anti-CD28-agonist Ab igenkänning av tumörceller. Dessa resultat tyder på att en brist på antigenpresentation, snarare än närvaron eller frånvaron av samhiberande respektive samstimulerande signaler, är ansvarig för denna fenotyp. Vissa studier tyder på att endogena proteiner internaliserade från plasmamembranet företrädesvis laddas på MHC-II för presentation, jämfört med andra subcellulära avdelningar (26). Även om KRAS-proteiner ofta associeras med membran via lipidmodifieringar, uttrycker de inte en transmembrandomän, och dessa interaktioner är inte stabila (3, 27). Vi resonerade därför att förankring av det immunogena fragmentet av KRASG12V till plasmamembranet i tumörceller kan möjliggöra direkt antigenigenkänning av CD4+ T-celler. Tumörceller som uttrycker KRASG12V-MITD-konstruktionen, vilket framgår av uttrycket av en P2A-länkad EGFP-reporter, kunde dock inte på liknande sätt stimulera TCR-konstruerade CD{109}} T-celler (tilläggsfigur 4). Dessa resultat tyder på att subcellulär onkogenlokalisering inte är den enda determinanten för den direkta presentationen av MHC-II av tumörceller. Dessutom tyder dessa resultat på att överuttryck av antigenet inte är tillräckligt för att främja presentationen av MHC-II. Våra resultat hittills tyder på att tumörspecifika CD{114}} T-celler kan vara mer benägna att känna igen antigener som presenteras av APC än av tumörceller själva. Därför bedömde vi kapaciteten hos HLADRB5*01:01+ DC att presentera antigener som härrör från exogena proteiner. HLA-matchade DC:er genererade in vitro kunde stimulera TCR-konstruerade CD4+ T-celler som uttrycker KRASG12V-specifika TCR när omogna DC:er antingen pulserades med KRASG12V 20-mer-peptiden eller matades med KRASG12V-helprotein men inte KRAS WT-protein (Figur 6E). Dessa resultat tyder på att även om TCR inte kan känna igen endogena antigener som presenteras av tumörceller, kan den känna igen korsvis presenterade exogena antigener i samband med DC.

cistanche tubulosa-förbättra immunförsvaret

Diskussion

Målet med denna studie var att avgöra om TCR isolerade från naturligt primade T-celler erhållna från patienter med cancer kunde känna igen tumörceller som uttrycker onkogener. Med avseende på klass I (HLA-A*02:01)-begränsad, HPV-16 E629-38 TCR erhållen från HNSCC TILs, bekräftades, kanske inte överraskande, igenkänning för både en autolog tumörcellinje och en välkarakteriserad HLA-matchad och E6-uttryckande tumörcell, CaSki (viktigt, se figur 2). Samma TILs (Figur 1) innehöll också ett betydande antal IFN-producerande E6-specifika CD4+ T-celler (Figur 3), som däremot inte kände igen E6- uttrycka tumörceller, även när de inducerades att uttrycka riklig yt-MHC klass II av den korrekt presenterade allelen (DQA1*01:02/DQB1*05:02) genom IFN-behandling eller CIITA-transduktion (Figur 4). CIITA-uttryck inducerar inte bara ytuttrycket av MHC-II-proteiner utan även HLA-DM och invarianta kedjemolekyler, som krävs för antigenbearbetning och presentation (28). HLA-matchade B-celler, däremot, kändes igen av denna TCR när antigenet riktades till MHC-II-vägen. En liknande situation observerades i fallet med en KRASG12V-specifik, HLA-DRB5*01:01-begränsad TCR, som kunde känna igen HLA-matchade B-celler, men inte MHC-II-uttryckande tumörceller, när antigenet riktades mot MHC-II presentationsväg. Båda TCR hade tillräcklig funktionell aviditet för att mediera igenkännandet av endogent uttryckta antigener under de betingelser som beskrivits ovan, och båda kunde mediera cytotoxiciteten hos peptidladdade målceller. Denna senare observation speglar de omständigheter som presenteras i flera rapporter om cytotoxiska CD4+ T-celler, även om våra data utökar sammanhanget för denna observation genom att visa att endogent uttryck av källantigenet och induktion av MHC-II av IFN- är osannolikt för att ge ett fysiologiskt mål på epitelhärledda tumörceller för TCR mot nukleära eller membranassocierade antigener. Nyligen genomförda studier av human blåscancer och melanom identifierade genetiska signaturer som motsvarar cytotoxiska CD4+ T-celler bland TILs (14, 15). Funktionellt sett är dessa cytotoxiska CD4+ TILs kapabla till direkt MHC-II-beroende tumörigenkänning, vilket i slutändan leder till mållys av granzymer på ett sätt som liknar deras CD8+ motsvarigheter. Emellertid kan terapeutisk translation av dessa fynd begränsas av det faktum att få solida tumörer uttrycker MHC-II. Faktum är att resultat från 2 oberoende studier antydde att endast cirka en tredjedel av patienterna med melanom har några MHC-II+-tumörceller, och frekvensen av dessa celler i tumören är ofta mindre än 10 % (15, 29). Istället verkar den dominerande cellulära källan till MHC-II i tumörmikromiljön vara infiltrerande leukocyter (26).

Figur 6. MHC-II+ KRASG12V+-tumörceller presenterar inte KRASG12V-härledda epitoper för CD4+ T-celler. (A)

Även om vissa solida tumörceller uttrycker antingen konstitutiv eller inducerbar MHC-II, visar våra resultat att trots närvaron av onkogenspecifika CD4+ T-celler bland TILs och PBMCs, kan dessa celler inte direkt känna igen och lysera antigenuttryckande MHC-II+-tumörceller, medan epitoper från samma protein effektivt kan presenteras för CD8+ T-celler på MHC-I (13). Detta tyder på att det kanske inte är tillräckligt att bara uttrycka ett målantigen för att ge igenkänning av CD4+ T-celler för den undergrupp av tumörer som uttrycker MHC-II. Dessutom verkar dessa resultat vara konsekventa över flera tumörtyper, eftersom cellinjerna som frågas i denna studie inkluderar de som härrör från HNSCC, lungadenokarcinom och pankreascancer. Direkt CD4+ T-celligenkänning av melanomcellinjer som uttrycker MHC-II naturligt eller efter CIITA-transduktion har rapporterats i 2 studier (30, 31). I båda dessa studier kände dock en betydande del av de testade TCR inte igen tumörceller direkt. Det är oklart om dessa TCR representerar "åskådare"-klonotyper som inte känner igen tumörantigener eller tumörspecifika TCR som inte kan känna igen deras besläktade antigen på grund av antigenpresentationsbrister såsom de som lyfts fram i denna studie. Oliveira et al. (31) visade att direkt igenkänning av CD4+ T-celler var begränsad till 2 melanom med extremt höga tumörmutationsbördor, vilket tyder på att denna fenotyp kan ge ytterligare nödvändiga förändringar som tillåter MHC-II-presentation av tumörantigener. Även om fästning av en MITD till det immunogena fragmentet av KRASG12V inte resulterade i direkt igenkänning av tumörceller av CD4+ T-celler, har studier beskrivit en bias för endogena peptider härledda från membranbundna proteiner eluerade från MHC-II, förmodligen på grund av membranåtervinning (26, 32). Melanomantigenet Trp1 finns i plasmamembranet, vilket kan underlätta direkt presentation för CD4+ T-celler av B16-tumörceller (33). Ett annat melanomassocierat antigen, gp100, presenteras av tumörceller för CD4+ T-celler på ett sätt som är beroende av gp100:s transmembrana domän (34). I nyare arbete som undersökte rollen av neoantigenspecifika CD4+ T-celler i en murin sarkommodell, eluerades epitoper härledda från en muterad integrinsubenhet, också ett membranbundet protein, från MHC-II på CIITA-transducerad tumör celler (35). Våra resultat tyder på att även om membranbundna proteiner företrädesvis kan transporteras till endosomer för direkt presentation på MHC-II, är närvaron av ett immunogent membranprotein enbart inte tillräckligt för att främja denna presentation. Andra icke-klassiska presentationsvägar har beskrivits som kan ge cytosoliska eller nukleära proteiner tillgång till MHC-II, inklusive autofagi-associerad presentation av intracellulära proteiner och transportör associerad med antigenbearbetning-beroende presentation till CD4+ T-celler, varvid antigena peptider överförs förmodligen från MHC-I till MHC-II under membranåtervinning (36, 37). Direkt MHC-II-beroende igenkänning av autologa tumörceller av CD4+ T-celler specifika för E7-epitoper har rapporterats (38, 39); emellertid gällde dessa studier båda E7-proteiner uttryckta av mindre vanliga onkogena HPV-subtyper (nämligen HPV-33 och HPV-59) som presenteras av livmoderhalscancerceller på HLA-DR-molekyler. Det är därför möjligt att HPV-subtyp, tumörhistologi och begränsande HLA-alleler också kan vara relevanta faktorer i den differentiella presentationen av nukleära HPV-antigener på MHC-II+-tumörceller. Även om våra data tyder på att direkt tumörcytotoxicitet inte är en trolig mekanism för E6- och KRASG12V-specifika CD4+ T-celler, har andra antitumörmekanismer för CD4+ T-celler beskrivits, och adoptiv överföring av tumörspecifika CD4+ T-celler hos patienter med cancer har visat antitumöraktivitet (7, 40, 41). Därför kan MHC-II-begränsade TCR som de som identifierats i denna studie vara användbara för ACT hos mänskliga patienter, med tanke på sådana TCRs inriktning på epitoper härledda från driveronkoproteiner begränsade till HLA-haplotyper uppskattade till 1,27 % och 16,10 % av USA White befolkning för HLADQA1*01:02/DQB1*05:02 respektive HLA-DRB5*01:01 (42). Noterbart är att CD4+ T-celler hjälper till vid priming av tumörspecifika CD8+ T-celler genom att licensiera antigenbärande DC på ett CD40L-beroende sätt (43–45). Vi visar att den KRASG12V-specifika TCR som identifieras i denna studie känner igen korspresenterade antigener i samband med DC, vilket tyder på att dessa celler kan bidra till antitumörimmunitet via denna funktion. CD8+ T-celler kan också ge lokal hjälp för CD8+ T-celler i tumörer genom att utsöndra cytokiner som IL-2 och IFN-, stödja CD8+ T-cellsöverlevnad och rekrytering till tumören (46). Dessutom kan CD4+ TILs känna igen antigener i tumörens mikromiljö på myeloidceller som makrofager. I själva verket har prekliniska studier visat att i frånvaro av MHC-II på tumörceller, kan adoptivt överförda Trp1 CD4+ T-celler fortfarande utöva antitumörimmunitet beroende på IFN- och korrelera med ökad cytotoxisk aktivitet hos makrofager (47). Emellertid verkar detta fenomen vara beroende av tumörantigenutsöndring, vilket vi också skulle spekulera är minimalt när det gäller de flesta onkogener. Sammantaget belyser vår studie selektiviteten för direkt presentation av endogena antigener av MHC-II+-tumörceller och visar att varken CIITA-uttryck eller närvaron av ett membranbundet antigen är tillräckligt för att främja direkt igenkänning av tumörceller av CD{{115} } T-celler. Fler studier behövs för att karakterisera vilka antigener som kan presenteras direkt av MHC-II+-tumörceller under vilka förhållanden för att fullt ut förstå de sammanhangsberoende rollerna för CD4+ T-celler i cancer.

cistanche växthöjande immunförsvar

Metoder

Cell kultur. TILs skördades och odlades som tidigare beskrivits (48). I korthet dissekerades primär tumörvävnad i 2–3 mm fragment, som placerades i en 24-brunnsplatta och odlades i RPMI-1640 kompletterat med 1{{102}}% humant AB-serum, penicillin-streptomycin, HEPES, gentamicin och 6,000 IE/ml IL-2. Extravaserade TILs odlades med halvmedia-ersättningar varannan till var tredje dag. Primära humana T-celler från perifert blod odlades i ett 50:50 medium bestående av 50 % AIM V plus 50 % RPMI-1640 kompletterat med 10 % humant AB-serum, penicillin-streptomycin (100 U/ mL vardera; Gibco, Thermo Fisher Scientific), 300 IE/mL IL-2, 5 ng/ml IL-7 och 5 ng/ml IL-15. Patienthärledda tumörcellinjer genererades och odlades som tidigare beskrivits (17). I korthet skars primär tumörvävnad i fragment mindre än 2 mm och dissocierades med användning av en GentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec). Tumörceller resuspenderades i F-Media innehållande 5 μM Rho-kinashämmare och ströks ut över en bädd av bestrålade 3T3-fibroblaster (30 Gy). Efter initial odling förökades tumörceller i en 3:1-blandning av bestrålat 3T 3--konditionerat medium och F-Media innehållande 5 μM Rho-kinashämmare. CaSki (ATCC), NCI-H2444 (ATCC), DAN-G (ATCC), J76 Jurkat (ATCC), 3T3-CD40L och B-LCL bibehölls i RPMI-medium kompletterat med l-glutamin och HEPES ( 10 mM; Gibco, Thermo Fisher Scientific), 10 % FBS, 1 mM natriumpyruvat (Gibco, Thermo Fisher Scientific), 1× MEM icke-essentiella aminosyror (Gibco, Thermo Fisher Scientific) och penicillin-streptomycin (100 U/ ml vardera; Gibco). Vi bibehöll 293GP (ATCC) i DMEM-mediumtillskott med 10% FBS och penicillin-streptomycin (100 U/mL vardera; Gibco, Thermo Fisher Scientific). IHW03304-, GM3107-, KAS011-, D8- och D66-celler var gåvor från Alessandro Sette (La Jolla Institute for Immunology). ELISPOT-analyser. TIL eller PBMC ströks ut med 100,000 celler per brunn i ELISPOT-plattor belagda med antiIFN-Abs (1-D1K, Mabtech). Celler restimulerades med HPV-16 E6 och E7 PepMix (JPT) peptidpooler, peptidpooler som representerade utvalda onkogena mutationer, eller indikerade individuella peptider vid 5 ug/ml för pooler eller 10 ug/ml för peptider i 22 timmar innan de utvecklades ELISPOT-plåtar enligt tillverkarens anvisningar (Mabtech). För en positiv kontroll användes 5 ug/ml fytohemagglutinin-L. Ex vivo expansionskultur. PBMC pläterades med en peptidpool som representerade utvalda onkogena mutationer vid 5 ug/ml. Färskt medium innehållande 10 IE/ml IL-2 tillsattes dag 4, 7 och 10. På dag 14 återstimulerades PBMC för användning i antingen ELISPOT- eller cytokinutsöndringsanalyser. TCR-sekvensering. TIL eller PBMC återstimulerades med 5 ug/mL HPV -16 E6 PepMix (JPT) eller KRASG12V-peptid, och IFN--utsöndrande celler fluorescensmärktes med hjälp av Human IFN-Secretion Assay kit enligt tillverkarens instruktioner (Miltenyi Biotec) . Enstaka IFN- +-celler sorterades i en 96-brunnsplatta med en FACSAria (BD Biosciences) och RNA-Seq utfördes med en Illumina Miseq för att identifiera parad TCR och kedjor. För identifiering av den E6-specifika CD4+ TCR-klonen sorterades IFN--utsöndrande celler enligt ovan och TCR- och TCR-sekvenser amplifierades med kapslad, multiplexerad PCR, som tidigare beskrivits (49). PCR-produkter lämnades in för Sanger-sekvensering (ETON Biosciences). För TCR-frekvensanalys skickades PBMC före och efter 14-dag ex vivo expansion med indikerade peptider till Adaptive Biotechnologies. HPV-expressionsanalys. RNA isolerades från Hu-56 primära tumörceller och tumörcellinje och skickades för bulk-RNA-Seq. Avläsningar av parade sekvenser kartlades med hjälp av BWA (v0.7.12) (50) till HPV-komplettgenomet (GenBank accessionsnr. NC_001526.2) och dess motsvarande transkriptom. Den resulterande sekvensanpassningskartfilen konverterades till en sorterad binär anpassningskarta och indexerades, följt av räkning av mappade läsningar med SAMtools (v1.2) (50). Hel-exom-sekvensering. Hel-exom-sekvensering och RNA-Seq utfördes vid La Jolla Institute for Immunology Sequence Core med användning av Agilent helexom-infångning respektive Illumina-kit. FFPE-bioprover distribuerades av Moores Cancer Center till Tempus för nästa generations sekvensering tillsammans med matchat referens-DNA med användning av perifera blodprover. Sekvensavläsningar från exomsekvensering av tumören och normala prover justerades till referensgenomet GRCh38 med användning av SpeedSeq Align (v0.1.0) (51). Exomvarianter identifierades med SpeedSeq Somatic, och varianter kommenterades med SNPeff (v4.3i) (52). RNA-Seq och hel-exom-sekvenseringsdata för detta manuskript har laddats upp till NCBI BioProject, accessionsnummer PRJNA924789. T-cell retroviral transduktion. TCR-nukleotidsekvenser syntetiserades och klonades i MSGV1-retrovirusryggraden med användning av en BioXP 3200 (Codex). Sekvensen kodonoptimerades för uttryck i humana celler. De humana TCR-konstanta regionerna byttes ut mot mus-TCR-konstanta regioner med substitutioner för att förbättra ytuttryck och främja preferentiell parning (53, 54). Humana PBMCs isolerades från buffy coats. CD4+ eller CD8+ T-celler avlägsnades genom magnetisk selektion och den negativa fraktionen som innehöll alla återstående lymfocyter odlades i ett T-cellsmedium med 50 ng/ml anti-CD3 Ab (OKT3) i 2 dagar.

Fördelarna med cistanche tubulosa-Antitumor

TCR retrovirala supernatanter genererades genom samtransfektion av 293GP-celler med MSGV1-vektorn innehållande den relevanta TCR-sekvensen och RD113-plasmiden. Två dagar efter transfektion skördades de retrovirala supernatanterna och användes antingen färska eller frysta vid –80 grader. Transduktioner utfördes på RetroNectin-belagda plattor (Takara), som tidigare beskrivits (5). Must TCR konstant regionuttryck bedömdes med flödescytometri för att bestämma transduktionseffektiviteten. TCR-konstruerade T-celler användes inte tidigare än dag 7 efter initial stimulering. T-cell funktionella analyser. Vi samodlade 5 × 104 TIL-celler, transducerade T-celler eller J76 Jurkat-celler med 1 × 105 B-LCL pulserade över natten med indikerade koncentrationer av peptid eller 5 × 103 tumörceller sådda föregående dag i {{16} }brunn U-bottnade respektive plattbottnade plattor. Där så anges tillsattes anti-CD28-agonist (klon CD28.2, BioLegend) eller anti-PD-L1-blockerande (klon 29E.2A3, BioLegend) Abs till T-cells- och tumörcellsamkulturer med 5 respektive 10 ug/ml. För cytokin- och aktiveringsmarköranalyser användes 1× Cell Activation Cocktail (BioLegend) innehållande PMA och jonomycin som en positiv kontroll. För HLA-blockeringsstudier sattes 20 ug/ml av följande abs till peptidpulsade B-LCL minst 2 timmar före tillsatsen av T-celler: anti-HLA-DQ (Tü169, BioLegend), anti-HLA-DR (L243, BioLegend), eller mus IgG2a isotypkontroll (MOPC-173, BioLegend). Där så anges odlades tumörceller i 72 timmar med 10 ng/ml rekombinant IFN- före tillsats av T-celler. Supernatanter skördades efter 18–24 timmar, IFN- mättes med ELISA (Thermo Fisher Scientific), och cellpellets färgades för flödescytometri. Cytotoxicitetsanalyser utfördes genom samodling av T-celler med tumörceller vid angivna effektor-till-mål-förhållanden. Kortfattat såddes 5 × 103 tumörceller och odlades över natten innan T-celler tillsattes vid de angivna förhållandena. Målcellslys bestämdes med hjälp av xCELLigence Real-Time Cell Analyzer (ACEA Biosciences), som bedömde elektrisk impedans på grund av cellvidhäftning var 30:e minut fram till slutet av experimentet. Data analyserades med hjälp av programvarupaketet xCELLigence RTCA, och resultaten rapporterades som cellindex normaliserat till 1 vid den tidpunkt då T-celler lades till. MHC-II presentationsanalys. Syntetiska DNA-konstruktioner som kodar för följande genererades och klonades in i MSGV1 med användning av en BioXP 3200 (Codex): de N-terminala 25 aminosyrorna i den humana HLA-B-genen, följt av de första 50 aminosyrorna av HPV-16 E6 eller 25 aminosyror av KRASG12V fusionerade till de C-terminala 55 aminosyrorna av humant HLA-B, ett T2A självklyvande element och den kodande sekvensen för EGFP. Virala supernatanter genererades enligt beskrivningen ovan, och autologa B-LCLs transducerades på RetroNectin-belagda plattor efter stimulering över natten på en bädd av bestrålade (0,5 Gy) 3T3-celler som uttryckte human CD40L (3T3-CD40L). Transduktionseffektiviteten bedömdes genom flödescytometrisk kvantifiering av EGFP-uttryck. Transducerade B-LCL stimulerades med 3T3-CD40L i närvaro av 200 IE/mL rekombinant human IL-4 (PeproTech) under 2 på varandra följande omgångar om 2–3 dagar före samodling med autologa TIL. Generering av DC för antigenpresentationsanalyser. DC genererades med användning av plastadhesionsmetoden. Frysta PBMC:er tinades och ströks ut i DC-medium (RPMI-1640 kompletterat med l-glutamin, 5 % värmeinaktiverat humant AB-serum och 100 U/mL vardera penicillin-streptomycin) under 2 timmar vid 37 grader. Icke-vidhäftande celler avlägsnades genom tvättning med varm PBS, och vidhäftande celler odlades i DC-medium kompletterat med 800 U/mL GM-CSF (Tonbo, Cytek Biosciences) och 500 U/mL IL-4 (PeproTech) i 6 dagar . Vi tillsatte 1 ug/mL KRASG12V-peptid eller 20 ug/mL KRASG12V eller WT KRAS-protein (Abcam) direkt till omogna DC över natten. Nästa dag skördades DCs och samodlades med TCR-konstruerade T-celler i ett förhållande på 1:1 över natten innan CD137-uppreglering bedömdes med flödescytometri. Retroviral transduktion av tumörceller. Den kodande sekvensen för human CIITA syntetiserades (Integrated DNA Technologies) och klonades in i MSGV1 av Gibson Assembly. De kodande sekvenserna för HLADRB5*01:01 och kedjor separerade av en P2A-sekvens syntetiserades (Integrated DNA Technologies) och klonades in i en modifierad pHAGE lentiviral vektor uppströms om en T2A-sekvens följt av en trunkerad CD34-reportersekvens av Gibson Assembly. Retrovirala supernatanter genererades med MSGV1, såsom beskrivits ovan. Lentivirala supernatanter genererades genom samtransfektion av 293T-celler med pHAGE-, tat-, rev-, gag/pol- och vsv-g-plasmider. Virala supernatanter uppsamlades 24 timmar senare och koncentrerades genom centrifugering i Amicon Ultra 5-rör (MilliporeSigma). Tumörceller ströks ut och 1 dag senare ersattes mediet med retroviral eller lentiviral supernatant kompletterad med 10 ug/ml polybren. Fyra timmar senare aspirerades den virusinnehållande supernatanten och ersattes med ett odlingsmedium. MHC-II+ och CD34+-tumörceller sorterades med en FACS Fusion-cellsorterare (BD Biosciences). Flödescytometri. Celler märktes med fluorokrom-konjugerade monoklonala Abs till följande antigener: anti-human CD3-PE (OKT3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD4-PE-Cyanine7 (SK3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD8-APC (Hit8a, Tonbo) , Cytek Biosciences), CD34–Alexa Fluor 647 (581, BioLegend), CD69–PerCP– Cyanine5.5 (FN50, BioLegend), CD137–PE (4B4-1, Miltenyi Biotec), PD-1 –BV650 (EH12.2H7, BioLegend), HLA-II–APC (Tü39, BioLegend) och anti-mus TCR -APC (H57-597, Tonbo, Cytek Biosciences). Döda celler färgades med antingen DAPI eller LIVE/DEAD Fixable Aqua (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). E629-38– HLA-A*02:01–PE tetramer monterades och märktes av NIH Tetramer Core Facility. Celler färgades med 1 ug/ml tetramer under 1 timme på is. Ab-färgning för ytantigener utfördes under 15 minuter på is. För intracellulär cytokinfärgning (ICS) samodlades T-celler med peptidpulsade APC i 4–6 timmar i närvaro av Brefeldin A. Celler permeabiliserades och färgades för intracellulära cytokiner med Cytofix/Cytoperm Kit (BD Biosciences) efter ytfärgning , enligt tillverkarens instruktioner. Följande fluorokromkonjugerade Abs användes för cytokinfärgning: IFN- –APC (4S.B3, BioLegend), IL-2-FITC (MQ1- 17H12, BioLegend), TNF- –BV785 (Mab11) , BioLegend) och Granzyme B–PE (QA16A02, BioLegend). Data insamlades med en FACSCelesta flödescytometer (BD Biosciences) och analyserades med programvaran FlowJo v10.7. Statistik. Statistiska analyser utfördes med Prism 8 (GraphPad Software). För ICS-jämförelser användes ett oparat 2-svansartat t-test. För att jämföra HLA-blockerande Ab–Ab-medierad undertryckning av T-cellssignalering användes ett 2-sätt ANOVA. P < 0,05 ansågs vara statistiskt signifikant. Studiegodkännande. De avidentifierade mänskliga proverna som användes i denna studie erhölls under informerat samtycke genom UCSD IRB-protokoll 101391CX, "Tumor Environment Phenotyping and Cell Isolation." Skriftligt informerat samtycke gavs av individerna i studien.

Referenser

1. Hanahan D, Weinberg RA. Kännetecknande för cancer: nästa generation. Cell. 2011;144(5):646–674.

2. Shamseddine AA, et al. Tumörimmunitet och immunterapi för HPV-relaterade cancerformer. Cancer Discov. 2021;11(8):1896–1912.

3. Simanshu DK, et al. Ledande granskning av RAS-proteiner och deras regulatorer vid mänskliga sjukdomar. Cell. 2017;170(1):17–33. 4. De Vos Van Steenwijk PJ, et al. En oväntat stor polyklonal repertoar av HPV-specifika T-celler är redo för verkan hos patienter med livmoderhalscancer. Cancer Res. 2010;70(7):2707–2717.

5. Stevanović S, et al. Landskap av immunogena tumörantigener i framgångsrik immunterapi av viralt inducerad epitelcancer. Vetenskap. 2017;356(6334):200–205.

6. Bhatt KH, et al. Profilering av HPV-16-specifika T-cellssvar avslöjar breda antigenreaktiviteter hos patienter med orofarynxcancer. J Exp Med. 2020;217(10):e20200389.

7. Veatch JR, et al. Tumörinfiltrerande BRAF V600E-specifika CD4 + T-celler korrelerade med fullständigt kliniskt svar vid melanom. J Clin Invest. 2018;128(4):1563–1568.

8. Veatch JR, et al. Endogena CD4+ T-celler känner igen neoantigener hos lungcancerpatienter, inklusive återkommande onkogena KRAS- och ERBB2 (Her2) drivrutiner. Cancer Immunol Res. 2019;2(13):910–922.

9. Cafri G, et al. Minnes-T-celler riktade mot onkogena mutationer detekterade i perifert blod hos patienter med epitelcancer. Nat Commun. 2019;10(1):449.

10. Tran E, et al. T-cellsöverföringsterapi riktad mot mutant KRAS i cancer. N Engl J Med. 2016;375(23):2255–2262.

11. Draper LM, et al. Inriktning på HPV-16+ epitelial cancerceller av TCR genmanipulerade T-celler riktade mot E6. Clin Cancer Res. 2015;21(19):4431–4439.

12. Jin BY, et al. Konstruerade T-celler riktade mot E7 medierar regression av humant papillomviruscancer i en murin modell. JCI Insight. 2018;3(8):e99488.

13. Bear AS, et al. Biokemisk och funktionell karakterisering av mutanta KRAS-epitoper validerar detta onkoprotein för immunologisk målinriktning. Nat Commun. 2021;12(1):4365.

14. Oh DY, et al. Intratumorala CD4+ T-celler förmedlar antitumörcytotoxicitet vid human blåscancer. Cell. 2020;181(7):1612–1625.

15. Cachot A, et al. Tumörspecifika cytolytiska CD4 T-celler förmedlar skyddande immunitet mot human cancer. Sci Adv. 2021;7(9):eabe3348.

16. Doran SL, et al. T-cellsreceptorgenterapi för humant papillomvirus-associerad epitelcancer: en första-i-human, fas I/II-studie. J Clin Oncol. 2019;37(30):2759–2768.

17. Liu X, et al. Villkorlig omprogrammering och långvarig expansion av normala celler och tumörceller från humana bioprover. Nat Protoc. 2017;12(2):439–451.

18. Veatch JR, et al. Neoantigenspecifika CD4+ T-celler i humant melanom har olika differentieringstillstånd och korrelerar med CD8+ T-cells-, makrofag- och B-cellsfunktion. Cancercell. 2022;40(4):393–409.

19. Lowery FJ, et al. Molekylära signaturer av antitumör neoantigen-reaktiva T-celler från metastaserande humancancer. Vetenskap. 2022;375(6583):877–884.

20. Kreiter S, et al. Ökad antigenpresentationseffektivitet genom att koppla antigener till MHC klass I-trafiksignaler. J Immunol. 2008;180(1):309–318.

21. Zaretsky JM, et al. Mutationer associerade med förvärvad resistens mot PD-1-blockad vid melanom. N Engl J Med. 2016;375(9):819–829.

22. Gros A, et al. Igenkänning av humana gastrointestinala cancerneoantigener genom cirkulerande PD-1+-lymfocyter. J Clin Invest. 2019;129(11):4992–5004.

23. Scholtalbers J, et al. TCLP: en online-katalog för cancercellinjer som integrerar HLA-typ, förutspådda neo-epitoper, virus och genuttryck. Genome Med. 2015;7(1):118.

24. Juneja V, Choi J, uppfinnare; BioNTech US Inc., innehavare. T-cellsreceptorkonstruktioner och användningar därav. US patent nr. US202103040215A1. 4 november 2021.

25. Sharpe AH, Pauken KE. De olika funktionerna hos den PD1-hämmande vägen. Nat Rev Immunol. 2018;18(3):153–167.

26. Abelin JG, et al. Att definiera HLA-II-ligandbearbetning och bindningsregler med masspektrometri förbättrar förutsägelse av cancerepitop. Immunitet. 2019;51(4):766–779.

27. Silvius JR, et al. K-ras4B och prenylerade proteiner som saknar "andra signaler" associerar dynamiskt med cellulära membran. Mol Biol Cell. 2006;17(1):192–202.

28. Chang CH, Flavell RA. Klass II-transaktivator reglerar uttrycket av flera gener involverade i antigenpresentation. J Exp Med. 1995;181(2):765–767.

29. Rodig SJ, et al. MHC-proteiner ger differentiell känslighet för CTLA-4- och PD-1-blockad vid obehandlat metastaserande melanom. Sci Transl Med. 2018;10(450):eaar3342.

30. Ahmadzadeh M, et al. Tumörinfiltrerande humana CD4+ regulatoriska T-celler uppvisar en distinkt TCR-repertoar och uppvisar tumör- och neoantigenreaktivitet. Sci Immunol. 2019;4(31):eaao4310.

31. Oliveira G, et al. Landskapet av hjälpare och reglerande antitumör CD4+ T-celler i melanom. Natur. 2022;605(7910):532–538.

32. Rock KL, et al. Presentera dig själv! Genom MHC klass I och MHC klass II molekyler. Trender Immunol. 2016;37(11):724–737.

33. Takechi Y, et al. Ett melanosomalt membranprotein är ett cellytmål för melanomterapi. Clin Cancer Res. 1996;2(11):1837–1842.

34. Lepage S, Lapointe R. Melanosomala målsekvenser från gp100 är väsentliga för MHC klass II-begränsad endogen epitoppresentation och mobilisering till endosomala avdelningar. Cancer Res. 2006;66(4):2423–2432.

35. Alspach E, et al. MHC-II neoantigener formar tumörimmunitet och svar på immunterapi. Natur. 2019;574(7780):696–701.

36. Dengjel J, et al. Autophagy främjar MHC klass II-presentation av peptider från intracellulära källproteiner. Proc Natl Acad Sci US A. 2005;102(22):7922–7927.

37. Matsuzaki J, et al. Icke-klassiska antigenbearbetningsvägar krävs för MHC klass II-begränsad direkt tumörigenkänning av NY-ESO-1- specifika CD4+ T-celler. Cancer Immunol Res. 2009;2(4):341–350.

38. Höhn H, et al. CD4+-tumörinfiltrerande lymfocyter i livmoderhalscancer känner igen HLA-DR-begränsade peptider från humant papillomvirus-E7. J Immunol. 1999;163(10):5715–5722.

39. Höhn H, et al. Humant papillomvirus typ 33 E7-peptider presenterade av HLA-DR*0402 till tumörinfiltrerande T-celler i livmoderhalscancer. J Virol. 2000;74(14):6632–6636.

40. Lu YC, et al. Behandling av patienter med metastaserande cancer med användning av ett större histokompatibilitetskomplex klass II-begränsad T-cellsreceptor som riktar sig mot cancerkönscellsantigenet MAGE-A3. J Clin Oncol. 2017;35(29):3322–3329.

41. Tran E, et al. Cancerimmunterapi baserad på mutationsspecifika CD4+ T-celler hos en patient med epitelcancer. Vetenskap. 2014;344(6184):641–645.

42. Gonzalez-Galarza FF, et al. Allele frequency net databas (AFND) 2020-uppdatering: guldstandarddataklassificering, öppen åtkomst genotypdata och nya frågeverktyg. Nucleic Acids Res. 2020;48(d1): D783–D788.

43. Schoenberger SP, et al. T-cellshjälp för cytotoxiska T-lymfocyter medieras av CD40-CD40L-interaktioner. Natur. 1998;393(6684):480–483.

44. Ahrends T, et al. CD4+ T-celler hjälper till att ge ett cytotoxiskt T-cellseffektorprogram inklusive samhiberande receptornedreglering och ökad vävnadsinvasivitet. Immunitet. 2017;47(5):848–861.

45. Ferris ST, et al. cDC1 primer och är licensierade av CD4+ T-celler för att inducera antitumörimmunitet. Natur. 2020;584(7822):624–629.

46. ​​Bos R, Sherman LA. CD4+ T-cellshjälp i tumörmiljön krävs för rekrytering och cytolytisk funktion av CD8+ T-lymfocyter. Cancer Res. 2010;70(21):8368–8377.

47. Haabeth OAW, et al. CD4+ T-cell-medierad avstötning av MHC klass II-positiva tumörceller är beroende av antigenutsöndring och indirekt presentation på värd APC. Cancer Res. 2018;78(16):4573–4585.

48. Dudley ME, et al. Generering av tumörinfiltrerande lymfocytkulturer för användning i adoptiv överföringsterapi för melanompatienter. J Immunother. 2003;26(4):332–342.

49. Dash P, et al. Encellsanalys av T-cellsreceptorrepertoar. Metoder Mol Biol. 2015;1343:181–197.

50. Li H, et al. Sekvensjustering/kartformat och SAM-verktyg. Bioinformatik. 2009;25(16):2078–2079.

51. Chiang C, et al. SpeedSeq: ultrasnabb personlig genomanalys och tolkning. Nat Methods. 2015;12(10):966–968.

52. Cingolani P, et al. Ett program för att kommentera och förutsäga effekterna av enkelnukleotidpolymorfismer, SnpEff: SNPs i genomet av Drosophila melanogaster-stam w1118; iso-2; iso-3. Flyga (Austin). 2012;6(2):80–92.

53. Haga-Friedman A, et al. Inkorporeringen av transmembrana hydrofoba mutationer i TCR ökar dess ytuttryck och T-cells funktionella aviditet. J Immunol. 2012;188(11):5538–5546.

54. Cohen CJ, et al. Förbättrad antitumöraktivitet hos T-celler konstruerade för att uttrycka T-cellsreceptorer med en andra disulfidbindning. Cancer Res. 2007;67(8):3898–3903.