Urinmetabolomik avslöjar onormal återhämtning efter maximal ansträngning hos kvinnliga ME/CFS-patienter Del 3

Varför kommer vi att vara trötta? Hur kan vi lösa utmattningsproblemen?

【Kontakt】 E-post: george.deng@wecistanche.com / WhatsApp:008613632399501/Wechat:13632399501

3. Diskussion

Detta är första gången som urinmetabolomen hos ME/CFS-patienter har karakteriserats före och efter en träningsutmaning när ME/CFS-patienter upplever PEM. Många av dessa metaboliter har aldrig tidigare uppmätts hos ME/CFS-patienter, eftersom tidigare urinmetabolomiska studier i ME/CFS har begränsats till färre än 50 metaboliter och den aktuella studien mätte 1403. Dessutom har användningen av stillasittande friska kontroller för att ta hänsyn till fysisk aktivitetsnivåer, som kan påverka metabolitnivåerna vid baslinjen och efter träning, är en viktig fördel med den nuvarande studiedesignen som inte har använts i tidigare studier. Våra resultat visade utbredda ökningar av nivåerna av metaboliter i urinen hos kontrollerna 24 timmar efter träning som inte sågs hos ME/CFS-patienter, där 110 av dessa föreningar hade en signifikant interaktion mellan sjukdomsstatus (ME/CFS eller kontroll). ) och tid (baslinje vs. efter träning) (kompletterande figur S2). Förutom ett flertal analyser av urinmetabolitnivåer, gav korrelerande metabolitnivåer i urin och plasma ytterligare bevis på metabolisk dysreglering hos ME/CFS-patienter efter träning. Denna analys gav ytterligare bevis på patofysiologiska förändringar i flera subpathways såväl som bevis på skillnader i ytterligare subpathways som inte hade många signifikanta skillnader mellan ME/CFS-patienter och kontroller när man tittade på urinmetabolitnivåer isolerat.

Cistanche kan fungera som en anti-trötthets- och uthållighetsförstärkare, och experimentella studier har visat att avkoket av Cistanche tubulosa effektivt kan skydda leverhepatocyter och endotelceller skadade i viktbärande simmöss, uppreglera uttrycket av NOS3 och främja leverglykogen syntes, vilket utövar anti-trötthetseffekt. Fenyletanoidglykosidrikt Cistanche tubulosa-extrakt kan avsevärt minska serumkreatinkinas-, laktatdehydrogenas- och laktatnivåerna och öka hemoglobin- (HB) och glukosnivåerna i ICR-möss, och detta kan spela en anti-trötthetsroll genom att minska muskelskadan. och fördröja mjölksyraanrikningen för energilagring hos möss. Compound Cistanche Tubulosa tabletter förlängde signifikant den viktbärande simtiden, ökade leverglykogenreserven och minskade serumureanivån efter träning hos möss, vilket visar dess anti-trötthetseffekt. Avkoket av Cistanchis kan förbättra uthålligheten och påskynda elimineringen av trötthet hos träningsmöss, och kan också minska höjningen av serumkreatinkinas efter belastningsträning och hålla ultrastrukturen av skelettmuskulaturen hos möss normal efter träning, vilket indikerar att det har effekterna för att förbättra fysisk styrka och mot trötthet. Cistanchis förlängde också signifikant överlevnadstiden för nitritförgiftade möss och ökade toleransen mot hypoxi och trötthet.

Klicka på att känna dig trött hela tiden

3.1. Jämförelse med tidigare urinmetabolomiska studier på ME/CFS-patienter

Sammantaget överensstämmer våra resultat inte med de få tidigare studierna som mäter urinmetaboliter hos ME/CFS-patienter jämfört med kontrollpersoner som inte har ME/CFS. För att bättre jämföra våra resultat med tidigare studier, som mätte färre metaboliter, jämförde vi resultaten vid baslinjen för p < 0.05 i LMM med de tidigare studierna. Den enda förening som visade sig vara signifikant i en annan studie och vår var alanin, även om den tidigare studien fann att alanin var lägre hos kvinnliga patienter än hos kontroller (BH-justera p-värde < 0.05) och i vår studie var den genomsnittliga normaliserade koncentrationen högre hos ME/CFS-patienterna än hos kontrollerna [20]. Flera av studierna fann dock skillnader vid baslinjen i föreningar som vi fann förändrades på olika sätt hos ME/CFS-patienter och kontroller under träningsåterhämtning, inklusive fenylalanin (lägre hos ME/CFS-patienter [23,24]) och valin (lägre i ME/CFS-patienter [20]). Både fenylalanin och valin ökade också signifikant i de stillasittande kontrollerna efter träning i den aktuella studien, så det är möjligt att kontrollerna i andra studier var mer aktiva och redan hade högre nivåer av fenylalanin i urinen. Inga andra studier rekryterade specifikt stillasittande icke-ME/CFS-personer, även om en studie försökte matcha "allmän livsstil" [23]. Armstrong et al. tittade på Pearsons korrelationer mellan urin- och plasmametaboliter hos ME/CFS-patienter och kontroller vid baslinjen, och fann skillnader i acetat, laktat och fenylalanin med en tröskel på |R| > 0,4 ​​i endera gruppen [20]. Acetat är för litet för att kunna detekteras i vår analys och vi upptäckte inga skillnader i plasma- och urinkorrelationer i laktat eller fenylalanin.

McGregor och kollegor undersökte också förändringar i urin- och plasmametabolomerna hos ME/CFS-patienter som upplever PEM [19]. De använde en undersökning för att separera ME/CFS-patienter som för närvarande upplever PEM under de senaste sju dagarna och upptäckte att åtta av trettio uppmätta urinmetaboliter hade signifikant lägre koncentrationer i ME/CFS-gruppen jämfört med kontrollerna. Av dessa hade endast serin signifikanta skillnader i våra analyser; den ökade efter träning i kontrollgruppen (Supplementary Data File S2—LMM Results). Nivåerna av två urinmetaboliter, acetat och metylhistidin, var också signifikant olika i gruppen PEM kontra ingen PEM [19]. Nivåerna av metylhistidinerna som analyserades i denna studie var inte signifikant olika i LMM-analysen, men vi fann skillnader i plasma- och urinkorrelationerna mellan 1-metylhistidin och N-acetyl-3-metylhistidin (Figur 9). McGregor et al. fann också samband mellan sjudagars PEM-poäng med flera metaboliter i plasma och urin [19].

3.2. Ökningen av metaboliter i urinen efter träning i stillasittande kontroller är i överensstämmelse med tidigare studier

Urinmetabolomen hos kvinnor 24 timmar efter träning har inte karakteriserats väl. Så vitt vi vet har inga studier mätt urinmetabolomen vid baslinjen jämfört med 24 timmar efter träning hos kvinnor. En studie mätte 32 metaboliter i urin före träning och 24 timmar efter träning hos män, där nio tävlingscyklister jämfördes med åtta friska men otränade män i samma ålder (50–60 år) [48]. Medan deras studie fokuserade på att jämföra idrottarna med de otränade försökspersonerna, såg de stora förändringar efter träning (mer signifikant än tvåfaldigt) hos kontrollpersonerna i laktat-, acetat- och hypoxantinnivåer. Acetat mättes inte i vår studie, och varken laktat eller hypoxantin skilde sig från baslinje till efter träning i vår kvinnliga kontrollgrupp. Mukherjee et al. fann signifikanta skillnader mellan idrottare och kontrollgrupper i åtta av de uppmätta metaboliterna kopplade till en mängd olika biokemiska vägar [48]. Därför är en styrka med den aktuella studien valet av stillasittande friska kontroller i motsats till mer aktiva individer, som kan ha en förändrad urinmetabolom på grund av regelbunden träning.

Även om det finns en brist på publicerad litteratur om urinmetabolomen 24 timmar efter träning, finns det flera studier som mäter urinmetaboliter hos både män och kvinnor vid tidigare tidpunkter efter träning (granskas i [49]). Ett av fynden som var konsekvent mellan studierna är att koncentrationen av de flesta lipider ökar i biovätskor efter träning, inklusive i urin. I synnerhet har acylkarnitinkoncentrationer visat sig öka i blod och urin som svar på träning. Detta överensstämmer med resultaten av vår studie där flera acylkarnitinföreningar ökade signifikant efter träning i kontrollernas urin (Figur 7A).

Den största studien som inkluderade kvinnor (totalt 255 försökspersoner, 107 kvinnor) fann också omfattande metaboliska förändringar i urinen efter träning, med 37 av 47 uppmätta metaboliter signifikant förändrade efter FDR-korrigering, och 33 av dessa var ökade efter träning [50] . Detta överensstämmer med vårt fynd av storskalig metabolisk förändring efter träning i urinen hos kontrollpersoner, där majoriteten av föreningarna som förändrades visade sig ha ökade koncentrationer. Denna studie avslutade också en könsstratifierad jämförande analys men fann bara två metaboliter med signifikant olika förhållande efter träning/baslinje hos kvinnor och män.

I Schranner et al. granskning, resultaten för aminosyror är inte lika konsekventa som de för lipider, som generellt ökar efter träning [49]. Vissa fynd i urin var dock konsekventa i minst två studier (även om alla tidpunkter efter träning är kombinerade), inklusive att följande föreningar ökade i urin efter träning: alanin, O-acetyl-homoserin, 5- hydroxiindolpyruvat, xanthurenat, L-metanefrin, N-acetylvanilalanin och N-(karboxietyl)arginin. Följande föreningar visade sig minska i urin efter träning i minst två studier: glycin, histidin, trimetylamin n-oxid. Genom att jämföra dessa resultat med vår studie var de flesta metaboliterna antingen inte signifikant olika före och efter träning, eller så mättes de inte i vår studie. Men vi fann också en signifikant ökning av alaninnivåerna i kontrollerna, vilket är i linje med de granskade studierna. I vår studie ökade glycinnivåerna också efter träning hos kontroller i motsats till minskade. Emellertid har Kistner et al. studie, som inkluderade många kvinnor, fann också att glycinnivåerna ökade signifikant efter träning [50].

3.3. Skillnader mellan stillasittande kontroller och ME/CFS-patienter i Lipid Superpathway

Många lipidsubpathways var signifikant olika i urinen hos patienterna och kontrollerna i denna studie, inklusive acylkarnitinfettsyrametabolism. Acylkarnitinmetaboliter ökade efter träning i urinen hos friska kontroller och förändringarna som inducerades av träning var signifikant olika mellan kontrollerna och ME/CFS-patienter (figur 3, 7 och S4). Dessutom, även om det inte är ett acylkarnitin, korrelerade deoxikarnitin i karnitinmetabolismens lipidsubväg annorlunda mellan plasma och urin hos ME/CFS-patienter jämfört med kontroller (Figur 9). Acylkarnitiner är mycket viktiga i energiomsättningen, eftersom de krävs för att transportera fettsyror in i mitokondrierna för -oxidation. Långkedjig fettsyraoxidation är det primära sättet för energimetabolism under aerob träning. Störd acylkarnitinmetabolism under träning kan bidra till träningsintolerans och PEM hos ME/CFS-patienter. I en annan studie som endast tittade på försökspersoner vid baslinjen och som inte specifikt rekryterade stillasittande kontroller, visade sig acylkarnitin-subpathwayen vara signifikant annorlunda hos ME/CFS-patienter jämfört med kontroller, med fem av åtta föreningar som visade sig ha en lägre koncentration hos patienterna [11]. När endast baslinjepatienter analyserades visade specifika mätningar av acylkarnitin i serum att substansen var lägre hos ME/CFS-patienter än kontrollerna i en rapport [51], men inga skillnader i urin- eller plasmanivåer sågs i en annan studie [52]. I plasman från den större kohorten, av vilken försökspersonerna i den aktuella studien är en undergrupp, förändrades det kemiska karnitinklustret också signifikant i kvinnliga stillasittande kontroller under återhämtning (definierad som skillnaden mellan 24 timmar efter träning och 15 minuter efter träning). ) med majoriteten av föreningarna som ökar efter träning [25]. Det kemiska karnitinklustret visade sig inte vara signifikant förändrat under träningsåterhämtning hos ME/CFS-patienter. Även om detta kluster innehåller mer än bara acylkarnitiner, är acylkarnitiner medlemmar och bidrar till dess betydelse i analys av kemisk likhetsanrikning också i den aktuella studien (kompletterande figur S4). Det har också visats ex vivo att palmitoylkarnitin, som ökar i muskler övergående efter träning, kan fungera som en ansträngningssignal från muskel till en undergrupp av neuroner [53].

Acylglycinfettsyrametaboliter är de enda föreningar som hittades i urin vid signifikant olika koncentrationer i ME/CFS jämfört med kontroller vid en enda tidpunkt (24 timmar efter träning) och en annan acylglycinförening, 3-hydroxibutyroylglycin , hade en signifikant negativ korrelation hos ME/CFS-patienterna när U3/U1 korrelerades med P3/P1 (figur 5 och 9). Dessutom förändrades cis-3,4-metylenheptanoylglycin annorlunda under återhämtning av träningen hos ME/CFS-patienter jämfört med kontroller (LMM, tilläggsbild S2). Även om acylglycinmetabolism inte är en av de undervägar som ökade signifikant efter träning enbart hos kontrollerna, var den signifikant annorlunda hos ME/CFS-patienter jämfört med kontroller både vid tidpunkten 24 timmar efter träning och vid analys av skillnaden i förhållandet efter träning/baslinje (Figur 3). Urinutsöndring av särskilda acylglyciner förändras också av störningar kopplade till fettsyraoxidation i mitokondrierna, inklusive medelkedjig acyl-koenzym A (CoA) dehydrogenas (MCAD)-brist [54]. Vår grupp har observerat att fettsyraoxidation skiljer sig i immunceller från ME/CFS-patienter jämfört med kontroller [55].

3.4. Skillnader mellan stillasittande kontroller och ME/CFS-patienter i aminosyrasupervägen

Vi fann också många skillnader i urin i aminosyror hos ME/CFS-patienter och kontroller efter träning. Två av dessa vägar stack ut eftersom de hade signifikanta förändringar i ME/CFS-patienter jämfört med kontroller i alla våra analyser, inklusive KEGG-väganalys, och diskuteras vidare nedan.

Ureacykeln i levern är en viktig del av träningsmetabolismen eftersom den behövs för att ta bort höga nivåer av ammoniak som produceras under träning [56,57]. Germain och kollegor fann också att ureacykeln och ammoniakåtervinningens SMPDB-vägar förändrades signifikant i plasman mellan ME/CFS kvinnliga patienter och kontroller i en väganalys när man jämförde skillnaden mellan metabolitnivåer 24 timmar efter CPET (P3) och 15 min efter CPET (P2) [25]. Ammoniakuppbyggnad har tidigare kopplats till neurotoxicitet och träningsinducerad trötthet [56,57]. Oregleringen av ureacykeln i urin- och plasmametabolomerna efter träning hos ME/CFS-patienter kan orsaka uppbyggnad av ammoniak, men de 1403 föreningar som mättes med Metabolon® i urinen inkluderade inte ammoniak eftersom det är en flyktig förening och även mindre än detektionsgränsen för Metabolon®s plattform.

Cystein, metionin, SAM och taurin är viktiga aminosyror eftersom de är de enda som innehåller svavel, och cystein är unik i sin förmåga att bilda disulfidbindningar. Cystein kan också omvandlas till glutation och taurin. Cystein och metionin spelar många roller i cellulär metabolism men de är också viktiga byggstenar för proteiner [37]. På grund av sin tiolgrupp är cystein involverat i att katalysera många enzymatiska reaktioner och upprätthålla redoxhomeostas. Förändringar i cysteinmetabolism förekommer i många neurodegenerativa sjukdomar, inklusive Alzheimers sjukdom, Huntingtons sjukdom och Parkinsons sjukdom [58]. Medan cystein-, metionin-, SAM- och taurinmetabolismen visade många skillnader mellan patienterna och kontrollerna i våra urinmetabolomanalyser, visade urin- och plasmakorrelationerna ytterligare föreningar med signifikanta skillnader mellan ME/CFS-patienterna och kontrollerna, inklusive i cystein, vilket är produceras när två cysteiner oxideras för att bilda en disulfidbindning, och cystationin som är en mellanprodukt i cysteinproduktionen i metionincykeln [37].

3.5. Begränsningar

Vår studie har flera viktiga begränsningar. För det första kontrollerades inte försökspersonernas kost, och intag av metaboliter via kosten kan påverka deras utsöndring i urinen. För det andra erkänner vi att bristen på BMI-matchning inte är idealisk och är en begränsning av denna studie. Vår större kohort av ME/CFS-patienter och friska stillasittande kontroller är BMI-matchad, och därför kommer detta inte att vara ett problem i framtiden om denna pilotstudie utökas. För det tredje är våra resultat begränsade till kvinnliga ME/CFS-patienter. Även om det är mycket viktigt att studera båda könen vid ME/CFS och ett ökande antal könsskillnader i patofysiologi upptäcks [25,59,60], valde vi att fokusera vår pilotstudie på kvinnor på grund av den högre sjukdomsbördan av ME /CFS hos kvinnor (60–65 % kvinnor) [2]. Dessutom, eftersom vi fångade urinmetabolomen endast vid två tidpunkter, baseline och 24 timmar efter träning, kan vi inte säga om ME/CFS-patienterna har förändrat utsöndringsnivåer av några av dessa metaboliter vid antingen en tidigare eller senare tidpunkt. punkt än kontrollerna. Dessa ökningar av utsöndringsprodukter kan inträffa hos patienter men med en större fördröjning, liknande hur ME/CFS-patienter visar en försenad total återhämtning till träning. Det är dock också möjligt att denna brist på förändrad metabol utsöndring är en del av en övergripande brist på ett hälsosamt metaboliskt svar på träning.

4. Material och metoder

4.1. Studieämnen

Åtta friska stillasittande kontroller och tio ME/CFS-patienter inkluderades i denna studie. ME/CFS-patienter diagnostiserades med Canadian Consensus Criteria [3]. De 18 försökspersonerna som ingick i denna studie var en del av en större kohort på totalt 173 deltagare (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT04026425) [61]. För denna pilotstudie var alla försökspersoner som ingick kvinnor. Försökspersoner rekryterades med följande kriterier. Alla deltagare måste vara mellan 18–70 år. Försökspersoner exkluderades från endera gruppen om de var rökare, gravida eller ammade, var diabetiker, konsumerade för stora mängder alkohol eller hade en ortopedisk begränsning som hindrade dem från att utföra CPET. Diagnoser schizofreni, egentlig depression, bipolär sjukdom eller ångest var också uteslutningskriterier i båda grupperna. Dessutom uteslöts friska stillasittande kontroller om de diagnostiserades med någon autoimmun sjukdom. Njurfunktionen var normal hos alla försökspersonerna i denna studie, utvärderad av följande Quest Diagnostics standardlaboratorieblodprover: serumkreatinin, blodureakväve och uppskattad glomerulär filtrationshastighet (eGFR).

Sjutton försökspersoner utförde träningstestningen vid Ithaca College i Ithaca, New York, och en försöksperson utförde träningstestningen på ID Med i Torrance, Kalifornien. Alla deltagare ombads att sluta med kosttillskott inklusive probiotika i två veckor innan träningstestning. Deltagarna ombads att sluta med smärta och stimulerande medicinering i två dagar innan träningstestet. Alla patienter gav skriftligt informerat samtycke och alla protokoll godkändes av Ithaca College IRB #1017-12Dx2. Alla deltagare fyllde i Bell Disability Scale [26], Short Form-36 hälsoundersökning [62] och anpassade frågeformulär. ME/CFS-patienterna fullföljde dessutom den multidimensionella trötthetsinventeringen [63].

4.2. Hjärt- och lungansträngningstestning och urinprovtagning

CPET utfördes på en stationär cykelergometer, med följande protokoll: 3 min vila följt av kontinuerlig cykling där den inkrementella arbetsbelastningen ökar med 15 watt per minut av träning fram till frivillig utmattning (ca 8–10 min). Andningsutbytesförhållandet (RER), som är graden av koldioxidproduktion dividerat med hastigheten för syreförbrukningen, mättes för att säkerställa att deltagarna utförde testet med tillräcklig ansträngning (RER > 1,1 indikerar maximal ansträngning).

Alla urinprover togs på morgonen: (1) 15–20 minuter före CPET och (2) 24 timmar senare. Urin samlades upp mitt i strömmen i sterila urinuppsamlare, alikvoterades, centrifugerades vid 10,000× g i 10 minuter för att avlägsna cellrester och lagrades vid -80 ◦C. Urinprover genomgick en frys-/tiningscykel för ytterligare alikvotering och alikvoterna skickades över natten till Metabolon® på torris.

4.3. Metabolomisk analys

Metaboliter mättes med hjälp av Precision Metabolomics™ vätskekromatografi – tandemmasspektrometri (LC-MS/MS) global metabolomics-plattform på Metabolon®. Detaljerade metoder har beskrivits tidigare [64]. I korthet extraherades prover i metanol (5:1 metanol: prov) och indunstades sedan. Metaboliter upptäcktes i varje prov med fyra olika LC-MS/MS-plattformar som var optimerade för hydrofila och hydrofoba föreningar och med både positiv och negativ jonisering. All kromatografi använde en Waters Acquity ultrahögprestanda (UP)LC och en 5 µL injektionsvolym (med prover rekonstituerade i lämpliga lösningsmedel för varje plattform). All masspektrometri utfördes med en ThermoScientific Q-Exactive högupplösta/noggranna masspektrometrar med uppvärmda elektrosprayjoniseringskällor (HESI-II) och Orbitrap-massanalysatorer som kördes vid 35,000 massupplösning med skanningsområde 70–1000 m/ z. Metabolon® proprietär programvara användes för att matcha experimentella prover med ett referensbibliotek av Tier 1-identifieringsstandarder enligt definitionen av Metabolomics Standards Initiative, och arean under kurvan användes för toppkvantifiering. Värdena är normaliserade i termer av antal råareor, och alla prover kördes i en batch så ingen batchkorrigering var nödvändig. De okända föreningarna har ingen standard, och delvis karakteriserade molekyler är de som inte har bekräftats officiellt utifrån en standard eller för vilka det inte finns någon standard, men Metabolon® är rimligt säker på sin identitet.

4.4. Databehandling

Rådata normaliserades med osmolalitet för varje prov och data för varje metabolit var mediancentrerade till 1 (rådata inklusive osmolalitet finns i tilläggsfil S1). Saknade värden imputerades med minimivärdet, förutom droger som tillräknades som 0. Data log10 transformerades med en variansstabiliserande transformation (MetaboanalystR) [65,66]. Totalt 1403 metaboliter mättes ursprungligen. Metaboliter filtrerades enligt den modifierade 80%-regeln: en förening inkluderades om den detekterades i minst 80% av proverna i någon av ME/CFS- eller kontrollgrupperna [27]. Totalt sett uppfyllde 1154 metaboliter kriterierna och inkluderades i efterföljande analyser. Den enda analys som utfördes utan filtrering var på korrelationerna med plasmametaboliter. Förhållandena efter träning/baslinje för varje metabolit beräknades i log bas 10 som post-träningsvärdet minus baslinjevärdet för varje individ. För att plotta vulkandiagrammet omvandlades de genomsnittliga logvecklingsförändringarna (ME/CFS-patienter kontra kontroller) till logbas 2 med användning av basformeln.

4.5. Dataanalys och statistik

Univariat statistisk analys för varje metabolit utfördes med hjälp av en linjär blandad modell med fixerade effekter av sjukdomsstatus, tidpunkt, ålder och BMI och en slumpmässig effekt av försökspersonen (smartaste [67] och medel [68] R-paket). Benjamini–Hochberg (BH)-metoden användes för att korrigera för den falska upptäcktsfrekvensen, med q < 0.1 som tröskel för signifikans. EnhancedVolcano R-paketet användes för vulkanplaner [69].

ChemRICH i R användes för att utföra den icke-överlappande väganalysen med de Metabolon®-definierade subvägarna och vägordningen [29]. Webbverktyget ChemRICH användes för att utföra den kemiska likhetsklustringsanalysen [30]. För den analysen kunde endast föreningar som hade en känd SMILES-kod inkluderas, totalt 516 föreningar. För båda ChemRICH-analyserna utfördes anrikningsstatistiken med Kolmogorov-Smirnov-testet, som inte använder en p-värdes signifikansgräns utan snarare jämför sannolikhetsfördelningen med en nollhypotessannolikhetsfördelning [70]. För Metabolon®-undervägarna valdes q < 0.05 som tröskelvärde för signifikans och q < 0,15 valdes för de kemiska klustren (BH FDR-korrigering). För båda hade alla kluster under de valda q-tröskelvärdena också p < 0,05.

Bananrikning och topologianalys utfördes med hjälp av webbverktyget Metaboanalyst 5.0 [65], för både KEGG och SMPDB mänskliga referensmetabolomer med följande parametrar valda: ett globalt test för statistiktestet och relativ centralitet mellan varandra som nodviktsmåttet. Föreningar inkluderades i denna analys om HMDB ID som tillhandahålls av Metabolon® matchade HMDB ID i Metaboanalyst. För duplikatföreningar för ett HMDB-ID inkluderades endast den första. Detta resulterade i 453 inkluderade föreningar.

Grupperingen av försökspersonerna med de fyra föreningarna som var signifikant olika mellan patienterna och kontrollerna efter träningen utfördes med hierarkisk klustring, med det euklidiska avståndet som avståndsmått och metoden "Ward.D2" (värmekarta R-paketet [71) ]).

Pearson-korrelationer mellan urin och plasma för 727 metaboliter uppmätta i båda biovätskorna utfördes i R (hmisc-paket). p-värden beräknades för varje korrelation med användning av ett t-test med nollhypotesen att korrelationskoefficienten är lika med 0, följt av BH FDR-korrigering med q < 0.15 som tröskel för signifikans. För figur 8 screenades föreningar för att ta bort de som hade extrema extremvärden med den modifierade z-poängmetoden, som beräknar en z-poäng med hjälp av median och median absolut avvikelse (extrema R-paket, z-tröskel=6).

Om inget annat anges utfördes alla datavisualiseringar med ggplot2 R-paketet. BH FDR-korrigering valdes för alla analyser istället för den mer stringenta Benjamini och Yekutieli FDR-korrigeringen eftersom ett extremt litet antal föreningar visade sig vara kolinjära (0,75 % av målen hade ett absolut värde Pearsons korrelationskoefficient > { {3}}.7).

5. Slutsatser

Sammantaget fanns det signifikanta skillnader i urinmetabolomen hos de friska stillasittande kontrollerna och ME/CFS-patienterna som svar på en CPET-utmaning i ett stort antal metaboliska super- och subpathways, som spänner över aminosyror, lipider, kolhydrater, nukleotider, xenobiotika och okända. Dessa vägar är involverade i en mängd fysiologiska funktioner inklusive men inte begränsade till energimetabolism. Detta tyder på att ME/CFS-patienter har en generell metabolisk dysreglering som är en del av deras träningsintolerans och PEM där förändrad metabol utsöndring är en bidragande faktor. Våra data tyder på att metabolismerna hos stillasittande individer som inte har ME/CFS genomgår stora förändringar som gör att de kan återhämta sig från ansträngning, medan ME/CFS-patienter misslyckas med att göra liknande adaptiva svar. Framtida arbete kommer att innefatta att utöka denna studie till en mycket större kohort som inkluderar båda könen för att validera dessa resultat, undersöka könsskillnader i urinmetabolomen och undersöka om det finns mer subtila skillnader i urinmetaboliter hos ME/CFS-patienter vid baslinjen som potentiellt skulle kunna bidra till ett diagnostiskt test för sjukdomen i framtiden.

Författarbidrag:Konceptualisering, AG, KAG och MRH; metodik, AG, KAG, YVH och MRH; formell analys, KAG, AG och YVH; utredning, KAG, AG och YVH; skrivning—ursprungligt utkast, KAG, AG och MRH; skrivande—recension och redigering, alla författare; visualisering, KAG och AG; projektadministration, MRH; finansieringsförvärv, MRH Alla författare har läst och samtyckt till den publicerade versionen av manuskriptet.

Finansiering:Denna forskning stöddes av National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS), NIH (U54NS105541) och Amar Foundation. National Center for Advancing Translational Sciences vid NIH gav finansiering till Weill Cornell Medicine Clinical and Translational Science Center (CTSC) för att underhålla REDCap-databasen genom UL1 TR 002384.

Uttalande av institutionell granskningsnämnd:Studien genomfördes i enlighet med riktlinjerna i Helsingforsdeklarationen och godkänd av Ithaca College Institutional Review Board, Ithaca, New York, USA (protokoll 1017-12Dx2), och Weill Cornell Medical College Institutional Review Board ( protokoll 1708018518).

Informerat samtycke:Informerat samtycke erhölls från alla försökspersoner som var involverade i studien.

Datatillgänglighetsförklaring:Alla metabolitdata för varje ämne är tillgängliga i de medföljande kompletterande datafilerna.

Erkännanden:Carl Franconi skötte databasen och biobanken vid Cornell University. Blodprover fraktionerades av David Wang vid EVMED Research med stöd från Workwell Foundation och av Ivan Falsztyn, Carl Franconi, Ludovic Giloteaux, Madeline McCanne, Jineet Patel, Adam O'Neal, Alexandra Mandarano, Jessica Maya, Shannon Appelquist vid Cornell University. Vi tackar följande personer som deltog i att screena deltagare, utföra träningstester och/eller samla in blod och urin: Betsy Keller, John Chia, Jared Stevens, Tiffany Ong och Maria Russell.

Intressekonflikt:Författarna förklarar ingen intressekonflikt. Finansiärerna hade ingen roll i utformningen av studien; vid insamling, analyser eller tolkning av data; i skrivningen av manuskriptet; eller i beslutet att publicera resultaten.

Referenser

1. Jason, LA; Mirin, AA Uppdatering av National Academy of Medicine ME/CFS-prevalens och ekonomiska konsekvenser för att ta hänsyn till befolkningstillväxt och inflation. Trötthet Biomed. Hälsobeteende. 2021, 9, 9–13. [CrossRef]

2. Valdez, AR; Hancock, EE; Adebayo, S.; Kiernicki, DJ; Proskauer, D.; Attewell, JR; Bateman, L.; DeMaria, A., Jr.; Lapp, CW; Rowe, PC; et al. Uppskattning av prevalens, demografi och kostnader för ME/CFS med hjälp av data om medicinska påståenden i stor skala och maskininlärning. Främre. Pediatr. 2018, 6, 412. [CrossRef] [PubMed]

3. Carruthers, BM; Jain, AK; De Meirleir, KL; Peterson, DL; Klimas, NG; Lerner, AM; Bested, AC; Flor-Henry, P.; Joshi, P.; Powles, AP; et al. Myalgisk encefalomyelit/kroniskt trötthetssyndrom: definition av kliniskt arbetsfall, diagnostik och behandlingsprotokoll. J. Chronic Fatigue Syndr. 2003, 11, 7–115. [CrossRef]

4. Chu, L.; Valencia, IJ; Garvert, DW; Montoya, JG Deconstructing post-exertional malaise in myalgic encefalomyelit/chronic fatigue syndrome: En patientcentrerad, tvärsnittsundersökning. PLoS ONE 2018, 13, e0197811. [CrossRef]

5. Stussman, B.; Williams, A.; Snow, J.; Gavin, A.; Scott, R.; Nath, A.; Walitt, B. Karakterisering av sjukdomskänsla efter ansträngning hos patienter med myalgisk encefalomyelit/kroniskt trötthetssyndrom. Främre. Neurol. 2020, 11, 1025. [CrossRef]

6. Stevens, S.; Snell, C.; Stevens, J.; Keller, B.; VanNess, JM Kardiopulmonell träningstestmetod för att bedöma ansträngningsintolerans vid myalgisk encefalomyelit/kroniskt trötthetssyndrom. Främre. Pediatr. 2018, 6, 242. [CrossRef]

7. Vanness, JM; Snell, CR; Stevens, SR Minskad kardiopulmonell kapacitet under postansträngningsbesvär. J. Chronic Fatigue Syndr. 2007, 14, 77–85. [CrossRef]

8. Keller, BA; Pryor, JL; Giloteaux, L. Oförmåga hos patienter med myalgisk encefalomyelit/kroniskt trötthetssyndrom att reproducera VO(2)-topp indikerar funktionsnedsättning. J. Transl. Med. 2014, 12, 104. [CrossRef]

9. Missailidis, D.; Annesley, SJ; Fisher, PR Patologiska mekanismer bakom myalgisk encefalomyelit/kroniskt trötthetssyndrom. Diagnostik 2019, 9, 80. [CrossRef]

10. Huth, TK; Eaton-Fitch, N.; Staines, D.; Marshall-Gradisnik, S. En systematisk genomgång av metabolomisk dysreglering vid kroniskt trötthetssyndrom/myalgisk encefalomyelit/systemisk ansträngningsintoleranssjukdom (CFS/ME/SEID). J. Transl. Med. 2020, 18, 198. [CrossRef]

11. Germain, A.; Barupal, DK; Levine, SM; Hanson, MR Comprehensive Circulatory Metabolomics in ME/CFS avslöjar störd metabolism av acyllipider och steroider. Metaboliter 2020, 10, 34. [CrossRef]

12. Germain, A.; Ruppert, D.; Levine, SM; Hanson, MR Metabolisk profilering av en kohort för upptäckt av myalgisk encefalomyelit/kroniskt trötthetssyndrom avslöjar störningar i fettsyra- och lipidmetabolism. Mol. Biosyst. 2017, 13, 371–379. [CrossRef]

13. Germain, A.; Ruppert, D.; Levine, SM; Hanson, MR Prospektiva biomarkörer från Plasma Metabolomics of Myalgic Encephalomyelit/Chronic Fatigue Syndrome implicerar redoxobalans i sjukdomssymptomatologi. Metaboliter 2018, 8, 90. [CrossRef]

14. Yamano, E.; Sugimoto, M.; Hirayama, A.; Kume, S.; Yamato, M.; Jin, G.; Tajima, S.; Goda, N.; Iwai, K.; Fukuda, S.; et al. Indexmarkörer för kroniskt trötthetssyndrom med dysfunktion av TCA och ureacykler. Sci. Rep. 2016, 6, 34990. [CrossRef]

15. Armstrong, CW; McGregor, NR; Sheedy, JR; Buttfield, I.; Butt, HL; Gooley, PR NMR-metabolisk profilering av serum identifierar aminosyrastörningar vid kroniskt trötthetssyndrom. Clin. Chim. Acta 2012, 413, 1525–1531. [CrossRef]

16. Armstrong, CW; McGregor, NR; Lewis, DP; Butt, HL; Gooley, PR Föreningen av fekal mikrobiota och fekal, blodserum och urinmetaboliter vid myalgisk encefalomyelit/kroniskt trötthetssyndrom. Metabolomics 2016, 13, 8. [CrossRef]

17. Hoel, F.; Hoel, A.; Pettersen, IK; Rekeland, IG; Risa, K.; Alme, K.; Sorland, K.; Fossa, A.; Lien, K.; Herder, I.; et al. En karta över metaboliska fenotyper hos patienter med myalgisk encefalomyelit/kroniskt trötthetssyndrom. JCI Insight 2021, 6, e149217. [CrossRef]

18. Nagy-Szakal, D.; Barupal, DK; Lee, B.; Che, X.; Williams, BL; Kahn, EJR; Ukaigwe, JE; Bateman, L.; Klimas, NG; Komaroff, AL; et al. Insikter i myalgisk encefalomyelit/kroniskt trötthetssyndrom fenotyp genom omfattande metabolomik. Sci. Rep. 2018, 8, 10056. [CrossRef]

19. McGregor, NR; Armstrong, CW; Lewis, DP; Gooley, PR Post-exertionell sjukdomskänsla är associerad med hypermetabolism, hypoacetylering och purinmetabolism avreglering i ME/CFS-fall. Diagnostik 2019, 9, 70. [CrossRef]

20. Armstrong, CW; McGregor, NR; Lewis, DP; Butt, HL; Gooley, PR Metabolisk profilering avslöjar anomal energimetabolism och oxidativ stressvägar hos patienter med kroniskt trötthetssyndrom. Metabolomics 2015, 11, 1626–1639. [CrossRef]

21. Fluge, O.; Mella, O.; Bruland, O.; Risa, K.; Dyrstad, SE; Alme, K.; Rekeland, IG; Sapkota, D.; Rosland, GV; Fossa, A.; et al. Metabolisk profilering indikerar nedsatt pyruvatdehydrogenasfunktion vid myalgisk encefalopati/kroniskt trötthetssyndrom. JCI Insight 2016, 1, e89376. [CrossRef] [PubMed]

22. Naviaux, RK; Naviaux, JC; Li, K.; Bright, AT; Alaynick, WA; Wang, L.; Baxter, A.; Nathan, N.; Anderson, W.; Gordon, E. Metaboliska egenskaper hos kroniskt trötthetssyndrom. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2016, 113, E5472–E5480. [CrossRef] [PubMed]

23. Jones, MG; Cooper, E.; Amjad, S.; Goodwin, CS; Barron, JL; Chalmers, RA Urin- och plasmaorganiska syror och aminosyror vid kroniskt trötthetssyndrom. Clin. Chim. Acta 2005, 361, 150–158. [CrossRef] [PubMed]

24. Niblett, SH; King, KE; Dunstan, RH; Clifton-Bligh, P.; Hoskin, LA; Roberts, TK; Fulcher, GR; McGregor, NR; Dunsmore, JC; Butt, HL; et al. Hematologiska och urinutsöndringsanomalier hos patienter med kroniskt trötthetssyndrom. Exp. Biol. Med. 2007, 232, 1041–1049. [CrossRef] [PubMed]

25. Germain, A.; Giloteaux, L.; Moore, GE; Levine, SM; Chia, JK; Keller, BA; Stevens, J.; Franconi, CJ; Mao, X.; Shungu, DC; et al. Plasmametabolomik avslöjar störd respons och återhämtning efter maximal träning vid myalgisk encefalomyelit/kroniskt trötthetssyndrom. JCI Insight 2022, 7, e157621. [CrossRef]

26. Bell, DS The Doctor's Guide to Chronic Fatigue Syndrome. Förstå, behandla och leva med CFIDS; Addison-Wesley Publishing Company: Reading, MA, USA, 1994.

27. Yang, J.; Zhao, X.; Lu, X.; Lin, X.; Xu, G. En dataförbehandlingsstrategi för metabolomik för att minska maskeringseffekten vid dataanalys. Främre. Mol. Biosci. 2015, 2, 4. [CrossRef]

28. Benjamini, Y.; Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. JR Stat. Soc. Ser. B 1995, 57, 289–300. [CrossRef]

29. Barupal, DK; Fan, S.; Fiehn, O. Integrering av bioinformatikmetoder för en omfattande tolkning av metabolomikdatauppsättningar. Curr. Opin. Biotechnol. 2018, 54, 1–9. [CrossRef]

30. Barupal, DK; Fiehn, O. Chemical Similarity Enrichment Analysis (ChemRICH) som ett alternativ till biokemisk vägkartläggning för metabolomiska datamängder. Sci. Rep. 2017, 7, 14567. [CrossRef]

31. Goeman, JJ; van de Geer, SA; de Kort, F.; van Houwelingen, HC Ett globalt test för grupper av gener: Testande samband med ett kliniskt resultat. Bioinformatik 2004, 20, 93–99. [CrossRef]

32. Rosato, A.; Tenori, L.; Cascante, M.; De Atauri Carulla, PR; Martins Dos Santos, VAP; Saccenti, E. Från korrelation till orsakssamband: Analys av metabolomikdata med hjälp av systembiologiska tillvägagångssätt. Metabolomics 2018, 14, 37. [CrossRef]

33. Cardounel, AJ; Cui, H.; Samouilov, A.; Johnson, W.; Kearns, P.; Tsai, AL; Berka, V.; Zweier, JL Bevis för den patofysiologiska rollen av endogena metylargininer i regleringen av endotelial NO-produktion och vaskulär funktion. J. Biol. Chem. 2007, 282, 879–887. [CrossRef]

34. Chandrasekharan, UM; Wang, Z.; Wu, Y.; Wilson Tang, WH; Hazen, SL; Wang, S.; Elaine Husni, M. Förhöjda nivåer av plasmasymmetrisk dimetylarginin och ökad arginasaktivitet som potentiella indikatorer på kardiovaskulär komorbiditet vid reumatoid artrit. Arthritis Res. Ther. 2018, 20, 123. [CrossRef]

35. Siroen, MP; Teerlink, T.; Nijveldt, RJ; Prins, HA; Richir, MC; van Leeuwen, PA Den kliniska betydelsen av asymmetrisk dimetylarginin. Annu. Rev. Nutr. 2006, 26, 203–228. [CrossRef]

36. Bertinat, R.; Villalobos-Labra, R.; Hofmann, L.; Blauensteiner, J.; Sepulveda, N.; Westermeier, F. Minskad NO-produktion i endotelceller exponerade för plasma från ME/CFS-patienter. Vasc. Pharmacol. 2022, 143, 106953. [CrossRef]

37. Brosnan, JT; Brosnan, ME De svavelhaltiga aminosyrorna: En översikt. J. Nutr. 2006, 136, 1636S–1640S. [CrossRef]

38. Fernández-García, JC; Martínez-Sánchez, MA; Bernal-López, MR; Muñoz-Garach, A.; Martínez-González, MA; Fitó, M.; Salas-Salvadó, J.; Tinahones, FJ; Ramos-Molina, B. Effekt av ett livsstilsinterventionsprogram med energibegränsad medelhavsdiet och träning på serumpolyaminmetabolomen hos individer med hög risk för hjärt-kärlsjukdom: En randomiserad klinisk studie. Am. J. Clin. Nutr. 2020, 111, 975–982. [CrossRef]

39. Wang, W.; Zhang, H.; Xue, G.; Zhang, L.; Zhang, W.; Wang, L.; Lu, F.; Li, H.; Bai, S.; Lin, Y.; et al. Träning bevarar ischemisk förkonditionering i åldrade råtthjärtan genom att återställa myokardpolyaminpoolen. Oxid. Med. Cell. Longev. 2014, 2014, 457429. [CrossRef]

40. Blomstrand, E.; Eliasson, J.; Karlsson, HK; Kohnke, R. Förgrenade aminosyror aktiverar nyckelenzymer i proteinsyntesen efter fysisk träning. J. Nutr. 2006, 136, 269S–273S. [CrossRef]

41. Newsholme, P.; Stenson, L.; Sulvucci, M.; Sumayao, R.; Krause, M. 1.02-Aminosyrametabolism. I Comprehensive Biotechnology, 2nd ed.; Moo-Young, M., Ed.; Academic Press: Burlington, ON, Kanada, 2011; s. 3–14. [CrossRef]

42. Li, S.; Gao, D.; Jiang, Y. Funktion, upptäckt och förändring av acylkarnitinmetabolism i hepatocellulärt karcinom. Metaboliter 2019, 9, 36. [CrossRef]

43. Braun, TP; Marks, DL Regleringen av muskelmassa av endogena glukokortikoider. Främre. Physiol. 2015, 6, 12. [CrossRef] [PubMed]

44. Furman, BL Mineralokortikoider. I xPharm: The Comprehensive Pharmacology Reference; Enna, SJ, Bylund, DB, Eds.; Elsevier: New York, NY, USA, 2007; sid. 1. [CrossRef]

45. Kavyani, B.; Lidbury, BA; Schloeffel, R.; Fisher, PR; Missailidis, D.; Annesley, SJ; Dehhaghi, M.; Heng, B.; Guillemin, GJ Kan kynureninvägen vara den viktigaste saknade biten i myalgisk encefalomyelit/kroniskt trötthetssyndrom (ME/CFS) komplexa pussel? Cell. Mol. Life Sci. 2022, 79, 412. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Kossman, DA; Williams, NI; Domchek, SM; Kurzer, MS; Stopfer, JE; Schmitz, KH Motion sänker östrogen- och progesteronnivåerna hos premenopausala kvinnor med hög risk för bröstcancer. J. Appl. Physiol. 2011, 111, 1687–1693. [CrossRef] [PubMed]

47. De Souza, MJ; Van Heest, J.; Demers, LM; Lasley, BL Luteal Phase Deficiency in Recreational Runners: Evidence for a hypometabolic state. J. Clin. Endokrinol. Metab. 2003, 88, 337–346. [CrossRef]

48. Mukherjee, K.; Edgett, BA; Burrows, HW; Castro, C.; Griffin, JL; Schwertani, AG; Gurd, BJ; Funk, CD Helblodstranskriptomik och urinmetabolomik för att definiera adaptiva biokemiska vägar för högintensiv träning hos 50–60-åriga mästaridrottare. PLoS ONE 2014, 9, e92031. [CrossRef]

49. Schranner, D.; Kastenmuller, G.; Schonfelder, M.; Romisch-Margl, W.; Wackerhage, H. Metabolite Concentration Changes in Humans After a Bout of Exercise: A Systematic Review of Exercise Metabolomics Studies. Sports Med. Öppet 2020, 6, 11. [CrossRef]

50. Kistner, S.; Rist, MJ; Doring, M.; Dorr, C.; Neumann, R.; Hartel, S.; Bub, A. En NMR-baserad metod för att identifiera urinmetaboliter associerade med akut fysisk träning och kardiorespiratorisk kondition hos friska människor - Resultat av KarMeN-studien. Metaboliter 2020, 10, 212. [CrossRef]

51. Kuratsune, H.; Yamaguti, K.; Takahashi, M.; Misaki, H.; Tagawa, S.; Kitani, T. Acylkarnitinbrist vid kroniskt trötthetssyndrom. Clin. Infektera. Dis. 1994, 18 (Suppl. 1), S62–S67. [CrossRef]

52. Jones, MG; Goodwin, CS; Amjad, S.; Chalmers, RA Plasma och urinkarnitin och acylkarnitiner vid kroniskt trötthetssyndrom. Clin. Chim. Acta 2005, 360, 173–177. [CrossRef]

53. Zhang, J.; Ljus, AR; Hoppel, CL; Campbell, C.; Chandler, CJ; Burnett, DJ; Souza, EC; Casazza, GA; Hughen, RW; Keim, NL; et al. Acylkarnitiner som markörer för träningsassocierad bränslefördelning, xenometabolism och potentiella signaler till muskelafferenta neuroner. Exp. Physiol. 2017, 102, 48–69. [CrossRef]

54. Costa, CG; Guerand, WS; Struys, EA; Holwerda, U.; ten Brink, HJ; Tavares de Almeida, I.; Duran, M.; Jakobs, C. Kvantitativ analys av urinacylglyciner för diagnos av beta-oxidationsdefekter med GC-NCI-MS. J. Pharm. Biomed. Anal. 2000, 21, 1215–1224. [CrossRef]

55. Maya, J.; Leddy, SM; Gottschalk, CG; Peterson, DL; Hanson, MR Ändrad fettsyraoxidation i lymfocytpopulationer av myalgisk encefalomyelit/kroniskt trötthetssyndrom. Int. J. Mol. Sci. 2023, 24, 2010. [CrossRef]

56. Wilkinson, DJ; Smeeton, NJ; Watt, PW Ammoniak metabolism, hjärnan och trötthet; besöker länken igen. Prog. Neurobiol. 2010, 91, 200–219. [CrossRef]

57. Chen, S.; Minegishi, Y.; Hasumura, T.; Shimotoyodome, A.; Ota, N. Inblandning av ammoniakmetabolism i förbättringen av uthållighetsprestanda av tekatekiner hos möss. Sci. Rep. 2020, 10, 6065. [CrossRef]

58. Paul, BD; Sbodio, JI; Snyder, SH Cysteinmetabolism i neuronal redoxhomeostas. Trender Pharmacol. Sci. 2018, 39, 513–524. [CrossRef]

59. Nkiliza, A.; Parks, M.; Cseresznye, A.; Oberlin, S.; Evans, JE; Darcey, T.; Aenlle, K.; Niedospial, D.; Mullan, M.; Crawford, F.; et al. Könsspecifika plasmalipidprofiler hos ME/CFS-patienter och deras samband med smärta, trötthet och kognitiva symtom. J. Transl. Med. 2021, 19, 370. [CrossRef]

60. O'Neal, AJ; Glas, KA; Emig, CJ; Vitug, AA; Henry, SJ; Shungu, DC; Mao, X.; Levine, SM; Hanson, MR Undersökning av anti-patogen antikroppsnivåer vid myalgisk encefalomyelit/kroniskt trötthetssyndrom. Proteomes 2022, 10, 21. [CrossRef]

61. Analys av sjukdomskänsla efter ansträngning med tvådagars CPET hos personer med ME/CFS.

62. Ware, JE, Jr.; Sherbourne, CD The MOS 36-item shortform health survey (SF-36). I. Konceptuell ram och artikelval. Med. Vård 1992, 30, 473–483. [CrossRef]

63. Smets, EM; Garssen, B.; Bonke, B.; De Haes, JC Den multidimensionella trötthetsinventeringen (MFI) psykometriska egenskaper hos ett instrument för att bedöma trötthet. J. Psychosom. Res. 1995, 39, 315-325. [CrossRef]

64. Ford, L.; Kennedy, AD; Goodman, KD; Pappan, KL; Evans, AM; Miller, LAD; Wulff, JE; Wiggs, BR; Lennon, JJ; Elsea, S.; et al. Precision av en profileringsplattform för klinisk metabolism för användning vid identifiering av medfödda metabolismfel. J. Appl. Labb. Med. 2020, 5, 342–356. [CrossRef]

65. Pang, Z.; Chong, J.; Zhou, G.; de Lima Morais, DA; Chang, L.; Barrette, M.; Gauthier, C.; Jacques, PE; Li, S.; Xia, J. MetaboAnalyst 5.0: Minska klyftan mellan råa spektra och funktionella insikter. Nucleic Acids Res. 2021, 49, W388–W396. [CrossRef] [PubMed]

66. Durbin, BP; Hardin, JS; Hawkins, DM; Rocke, DM En variansstabiliserande transformation för mikroarraydata för genuttryck. Bioinformatik 2002, 18 (Suppl. 1), S105–S110. [CrossRef] [PubMed]

67. Kuznetsova, A.; Brockhoff, PB; Christensen, RHB lmerTestpaket: Tester i modeller med linjära blandade effekter. J. Stat. Softw. 2017, 82, 1–26. [CrossRef]

68. Lenth, R. Emmeans: Estimated Marginal Means, aka Least-Squares Means, 1.8.2; R-paket. 2022.

69. Blighe, K.; Rana, S.; Lewis, M. EnhancedVolcano: Publikationsklara vulkanplotter med förbättrad färgning och märkning, version 1.16.0; R-paket. 2022.

70. Smirnov, NV Om uppskattningen av diskrepansen mellan empiriska fördelningskurvor för två oberoende urval. Tjur. Matematik. Univ. Moskva 1939, 2, 3–14.

71. Kolde, R. Pheatmap: Pretty Heatmaps, 1.0.12; R-paket. 2019.

Ansvarsfriskrivning/Utgivarens anmärkning:Uttalandena, åsikterna och data som finns i alla publikationer är endast de av enskilda författare och bidragsgivare och inte från MDPI och/eller redaktörerna. MDPI och/eller redaktören/redaktörerna frånsäger sig ansvar för eventuella skador på personer eller egendom till följd av idéer, metoder, instruktioner eller produkter som hänvisas till i innehållet.

【Kontakt】 E-post: george.deng@wecistanche.com / WhatsApp:008613632399501/Wechat:13632399501