Exogen Wnt1 förhindrar akut njurskada och dess efterföljande progression till kronisk njursjukdom

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Xue Hong^1†, Yanni Zhou^2†, Dedong Wang^3†, Fuping Lyu⁴, Tianjun Guan³, Youhua Liu^1,5och Liangxiang Xiao^3*

¹State Key Laboratory of Organ Failure Research, National Clinical Research Center of Kidney Disease, Division of Nephrology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou, Kina,²Department of Nephrology, Xiamen Hospital, anslutet till Beijing University of Chinese Medicine, Xiamen, Kina,³Department of Nephrology, Zhongshan Hospital, anslutet till Xiamen University, Xiamen, Kina,⁴Institutionen för endokrinologi och diabetes, det första anslutna sjukhuset vid Xiamen University, Xiamen, Kina,⁵Institutionen för patologi, University of Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh, PA, USA

Studier tyder på att Wnt/-cateninagonister är fördelaktiga vid behandling avakut njurskada(AKI); den förblir dock svårfångad om dess roll i förebyggandet av AKI och dess utveckling till kronisk njursjukdom (CKD). I denna studie aktiverades renal Wnt/-cateninsignalering antingen genom överuttryck av exogen Wnt1 eller hämmades av administrering med ICG-001, en liten molekylhämmare av -cateninsignalering, innan mössen utsattes för ischemi/reperfusionsskada (IRI) för att inducera AKI och efterföljande CKD. Våra resultat visade att in vivo-uttryck av exogent Wnt1 före IR-skyddade möss mot AKI, och hindrade utvecklingen av AKI till CKD hos möss, vilket framgår av både biokemiska blodanalyser och njurhistologiska analyser. Däremot hade förbehandling av ICG-001 före IR ingen effekt på renal Wnt/-catenin-signalering eller progressionen av AKI till CKD. Mekanistiskt undertryckte uttryck in vivo av exogent Wnt1before IR uttrycket av proapoptotiska proteiner i AKI-möss och minskade inflammatoriska svar i både AKI- och CKD-möss. Dessutom inhiberade exogen Wnt1 apoptos av tubulära celler inducerad av hypoxi-reoxygenation (H/R) behandling in vitro. Sammanfattningsvis ger denna studie bevis för att stödja den förebyggande effekten av Wnt/-catenin-aktivering på IR-relaterad AKI och dess efterföljande progression till CKD.

Nyckelord: akut njurskada, kronisk njursjukdom, Wnt1, -catenin, ischemi-reperfusionsskada

Behandlingen avakut njurskada(AKI): cistanche

INTRODUKTION

Akut njurskada (AKI)är ett kliniskt tillstånd som beror på en snabb förlust av njurfunktionen genom olika skador, såsom läkemedel, ischemi, sepsis och toxiner (Chawla och Kimmel, 2012; Scholz et al., 2021). AKI är associerat med en hög incidens av sjuklighet och dödlighet, ansvarig för cirka 2 miljoner dödsfall varje år över hela världen (Belayev och Palevsky, 2014). I synnerhet är AKI en välkänd oberoende prediktor för utvecklingen av kronisk njursjukdom (CKD) eller end-stage renal disease (ESRD), som har lagt en enorm ekonomisk börda på hälso- och sjukvården (Leung et al., 2013; Belayev och Palevsky, 2014; Kurzhagen et al., 2020). Tyvärr finns det inga effektiva läkemedel för förebyggande och behandling av AKI.

Wnt/-catenin-signalering spelar en grundläggande roll inorganogenes, vävnadshomeostas och utvecklingen av olika sjukdomar, inklusive njursjukdomar (Soni, 2021). -Catenin har dubbla roller genom att fungera som både ett strukturellt protein och en transkriptionsregulator (MacDonald et al., 2009). Det membranbundna -cateninet är en del av adherensjunction-komplexet och bidrar till cell-cellinteraktion, medan det cytosoliska -cateninet fosforyleras av glykogensyntaskinas-3 (GSK-3) och riktas mot ubiquitination och proteasomal nedbrytning. En sådan nedbrytning av -catenin skulle emellertid kunna räddas av Wnt-liganderna, en familj av utsöndrade glykoproteiner med olika biologiska aktiviteter. Bindningen av Wnt stabiliserar -catenin, som translokeras in i kärnan och fungerar som en transkriptionsfaktor för generreglering. Noterbart är att Wnt/-catenin-signalering är relativt tystad i oskadade vuxna njurar men återaktiveras under akut och kronisk njurskada (Huffstater et al., 2020). Aktivering av Wnt/-catenin i ett tidigt skede av AKI minskar njurskada och gynnar återhämtningen njurfunktionen, medan ihållande Wnt/-catenin-aktivering kan driva utvecklingen från AKI till CKD (Xiao et al., 2016; Huffstater et al., 2020). Därför är Wnt/-catenin-signalering ett tveeggat svärd vid njurskada och kräver en bättre förståelse. Noterbart är det fortfarande svårfångat om Wnt/-cateninaktiveringens roll i förebyggandet av AKI och dess efterföljande AKI-CKD-progression.

Renal ischemi-reperfusionsskada (IRI) anses vara den största orsaken till AKI. Därför har den renala IRI-djurmodellen ofta använts för forskning av AKI och AKI-CKDprogression (Bonventre och Yang, 2011). Både farmakologiska och genetiska tillvägagångssätt har använts för att belysa rollen av Wnt/-cateninaktivering i IRI-modeller av AKI respektive CKD. Litium- och GSK-3-hämmare används ofta för att farmakologiskt aktivera Wnt/-catenin-signalering i prekliniska AKI-modeller, men det bör noteras om deras -catenin-oberoende effekter (Bao et al., 2014). Genetiska modifieringar av GSK{{9 }} , -catenin eller Wnt-ligander (Wnt1 och Wnt9a) har använts för att belysa rollen för Wnt/-catenin-aktivering i AKI och CKD (Bonventre och Yang, 2011; Bao et al., 2014; Zhou et al., 2013, 2018; Liuet al., 2020). Icke desto mindre är studier om rollen av Wnt/-cateninsignalering i förebyggandet av AKI ganska begränsade. Denna studie syftade till att belysa rollen av Wnt/-catenin-signalering i förebyggandet av AKI och dess efterföljande progression till CKD.

FIGUR 1|In vivo uttryck av exogent Wnt1 före IR förhindrar AKI och aktiverar renalt -catenin hos möss

(A)Musbehandlingsgrupper. Möss behandlades med antingen pcDNA3 (IRI plus pcDNA3) eller PHA-Wnt1 (IRI plus PHA-Wnt1) plasmid via hydrodynamisk svansveninjektion 2 dagar före BIRI. Serumkreatininnivåer(B)och urea nitrogen (BUN) nivåer i blodet(C) mättes. (D) Representativa mikrofotografier av njurmorfologi 1 dag efter BIRI. Njursektioner utsattes för periodisk syra-Schiff-färgning. Inramade ytor är förstorade. Pilar indikerar njurtubuli. Skalstång, 200 µm.(E, F)Western blot-analys av aktivt -catenin i njurar hos möss. *P < 0.05="" kontra="" sham-kontroller="" (n="5)." †p="">< 0,05="" mot="" iri="" injicerad="" med="" pcdna3-plasmid="" (n="">

Cistanche förbättrar njurfunktionen

MATERIAL OCH METODER

Djurstudie

C57BL/6-hanmöss som vägde cirka 22–25 g köptes från Vital River Laboratory Animal Technology (Beijing, Kina) och hölls i djuranläggningen (temperatur: 22 ± 2◦C, luftfuktighet: 60 ± 5 procent, 12 timmar mörk/ljuscykel ) vid Southern Medical University (Guangzhou, Kina) med vatten och mat ad libitum. Djurstudier godkändes av Animal Ethical and Welfare Committee vid Southern MedicalUniversity. Alla djur behandlades i enlighet med guiden för vård och användning av försöksdjur.

Induktionen av AKI och CKD hos möss beskrevs i våra tidigare studier (Xiao et al., 2016; Zhou et al., 2018). Bilateral njurischemi/reperfusionsskada (BIRI) har använts i stor utsträckning för att inducera AKI hos möss, medan det ökar dödligheten under progressionen av AKI toCKD. Därför används unilateral njurischemi/reperfusionsskada (UIRI) för forskning om progression av AKI till CKD. Kortfattat gjordes ett buksnitt i mittlinjen i musen under allmän anestesi, och bilaterala eller vänstra njurstjälkar klipptes under 30 minuter med hjälp av mikroaneurysmklämmor (artikelnr 18051-35; Fine ScienceTools, Cambridge, Storbritannien). Under operationen hölls kroppstemperaturen vid cirka 37–38◦C med hjälp av ett temperaturkontrollerat värmesystem.

För att utvärdera den förebyggande effekten av Wnt/-catenin-aktivering på AKI, injicerades möss med 1 mg/kg hemagglutinin(HA)-märkt Wnt1-expressionsvektor (PHA-Wnt1, UpstateBiotechnology) eller tom vektor (pcDNA3) 2 dagar före BIRI med hjälp av den hydrodynamiska- baserad genöverföringsteknik som rapporterats tidigare (Xiao et al., 2016). Blod- och njurvävnad samlades in 1 dag efter njur-BIRI.

För att utvärdera effekten av tidig Wnt/-catenin-aktivering på progressionen av AKI till CKD, utsattes möss antingen för daglig hydrodynamisk svansveninjektion av Wnt1 expressionsplasmider med 1 mg/kg eller daglig intraperitoneal injektion av ICG-001({{4 }}, Chembest, Shanghai, Kina) vid 5 mg/kg i 3 dagar före UIRI. Blod- och njurvävnader uppsamlades 11 dagar efter UIRI. I vår preliminära studie kunde 2 dagars Wnt1-injektion inducera uttrycket av Wnt1 i AKI-möss (data visas inte). Det bör noteras att 3 dagars Wnt1-injektion valdes för att säkerställa och förlänga uttrycket av Wnt1 under progressionen av AKI till CKD.

Akut njurskada (AKI) är ett kliniskt tillstånd som beror på en snabb förlust av njurfunktionen

Cellkultur och behandling

Human proximal tubulär epitelcellinje (HKC-8) tillhandahölls av Dr. L. Racusen vid Johns Hopkins University (Baltimore, MD, USA). Cellkulturer utfördes som tidigare beskrivits (Zhou et al., 2013). HKC-8-celler behandlades med humant rekombinant Wnt1 (SRP4754; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) vid 100 ng/mL eller ICG-001 (847591-62-2, Chembest, Shanghai , Kina) vid 10 µM under 4 timmar. Celler inkuberades sedan i en hypoxiarbetsstation (X3-CK, Biospherix) vid 1 procent pO2 i 48 timmar. Därefter syresattes cellerna igen i 2 timmar före uppsamling för olika analyser.

FIGUR 2|In vivo-uttryck av exogen Wnt1 före IR minskar tubulär cellapoptos och NF-KB-aktivering i AKI-möss

(A) Representativa mikrofotografier visar TUNEL-positiva celler i olika grupper som anges. Pilar indikerar positiv färgning. Skalstång, 100 µm.(B)Den grafiska presentationen visar TUNEL-positiva celler per högeffektfält (HPF) i olika grupper enligt indikation.(C–F)Representativa Western blot-analyser visar njurexpression av FasL, p53 och Bax i olika grupper som anges. *P < 0.05="" kontra="" sham-kontroller;="" †p="">< 0,05="" jämfört="" med="" iri="" injicerad="" med="" pcdna-plasmider="" (n="">(G) Representativ Western blöt av p65- och p-p65-proteiner i olika grupper enligt indikation.

Apoptosanalys

Celler trypsiniserades, samlades in och tvättades med PBS.PE Annexin V-färgning utfördes enligt tillverkarens protokoll. Cytometrisk analys utfördes med en flödescytometer (BD FACSCanto II, San Jose, CA, USA) för att mäta apoptoshastigheterna genom att detektera den relativa mängden PE Annexin V-positiva och 7-AAD-negativa celler. Varje analys utfördes i triplikat.

Kreatinin och blodurea kväveanalys

Kreatininnivåer i serum och urin såväl som ureanitrogennivåer i blodet (BUN) mättes med användning av en automatisk biokemisk analysator (AU480, Beckman-Coulter Inc., Brea, CA, USA).

Histologi och immunhistokemisk färgning

Njursektioner och immunhistokemisk färgning utfördes som tidigare beskrivits (Liu et al., 2020). Primära antikroppar inkluderade polyklonal kanin anti–Wnt1(ab15251; Abcam, Inc.), polyklonalt anti- -kanin anti- -catenin (ab15180; Abcam, Inc. .), och polyklonalt kanin anti-fibronektin (F3648; Sigma-Aldrich).

Western blot-analys

Western blot-analys utfördes som beskrivits tidigare (Zhou et al., 2019). Primära antikroppar inkluderade kaninpolyklonalt anti-fibronektin (F3648; Sigma-Aldrich), musmonoklonal anti- -cateninantikropp (610154; BD TransductionLaboratories), mus monoklonal anti- -SMA-antikropp (A2547;Sigma-Albitdrich), polyklonal anti-Wnt1 (ab15251; Abcam), mus anti- -tubulin (T9026; Sigma-Aldrich), mus anti PAI-1 antikropp (AF3828;R&D Systems), antiaktivt -catenin(#05 –665; EMD Millipore), anti-Fas-ligand (FasL) (SC -6237; Santa Cruz, CA, USA), p53 (#2524S; CST), Bax (SC 20067; Santa Cruz), p65 ( #8242S; CST), p-p65 (#3033S; CST), PCNA (#2586S; CST).

RNA-extraktion och qPCR-analys

Total RNA-isolering och qPCR utfördes som tidigare beskrivits. mRNA-nivåerna för olika gener normaliserades med -aktin. Generernas primersekvenser listas i tilläggstabell 1.

FIGUR 3|In vivo uttryck av exogent Wnt1 före IR förhindrar utvecklingen av AKI till CKD hos möss

(A)Musbehandlingsgrupper. Möss utsattes för antingen hydrodynamisk svansveninjektion av 1 mg/kg pcDNA3 (IRI plus pcDNA3) eller PHA-Wnt1 (IRI plus PHA-Wnt1) plasmid, eller intraperitoneal injektion av 5 mg/kg ICG -001 tre dagar före UIRI . Blod och vävnader uppsamlades 11 dagar efter UIRI. Serumkreatininnivåer(B) och blodets urea nitrogen (BUN) nivåer(C) mättes.(D) Representativa mikrofotografier av njurmorfologi 11 dagar efter UIRI. Njursektioner utsattes för periodic acid-Schiff-färgning. Inramade områden förstoras. Pilar indikerar njurtubuli. Skalstapel, 100 µm. *P < 0,05;="" **p="">< 0,01.="" n="">

Statistisk analys

Alla data uttrycktes som medelvärde ± SEM. Data analyserades statistiskt med hjälp av programvaran Sigma Stat (Jandel ScientificSoftware, San Rafael, CA, USA). Jämförelse mellan grupper gjordes med envägs ANOVA, följt av Student-Newman-Keuls-testet. P < 0.05="" ansågs="">

CISTANCHE ÖRTFÖRDEL NJURE

RESULTAT

In vivo uttryck av exogent Wnt1Before IR förhindrar akut njurskada och aktiverar njurkatenin hos möss

För att bestämma rollen för Wnt/-catenin-aktivering i AKIprevention administrerades möss med antingen HA-märkt Wnt1-expressionsvektor (PHA-Wnt1) eller tom vektor (pcDNA3) via hydrodynamisk svansveninjektion 2 dagar före BIRI(Figur 1A). Serumnivåer av kreatinin och BUN, två biomarkörer för njurskada, ökade signifikant hos möss 1 dag efter BIRI, vilket tyder på förekomsten av AKI (Figur 1B, C). Konsekvent var framträdande njurmorfologiska lesioner, såsom astubulära skador i den kortikomedullära korsningen, observerades i AKI-möss(Figur 1D). Särskilt dessa förändringar i biomarkörer för serumnjurskador och morfologiska lesioner hos AKI-möss försvagades markant av exogen Wnt1. Western blotanalyser avslöjade att exogen Wnt1 främjade uttrycket av renal-catenin i AKI-möss(Figur 1E, F). Sammantaget tyder dessa fynd på att förbehandling av exogent Wnt1 aktiverar renalt -catenin och förhindrar AKI hos möss.

In vivo-uttryck av exogent Wnt1Before IR minskar tubulär cellapoptos och hämmar NuclearFactor-Kappa B-aktivering

För att undersöka om reglering av apoptos är mekanismen bakom den skyddande effekten av exogen Wnt1 på AKI, utfördes TUNEL-färgning för att identifiera apoptos i njurvävnad hos AKI-möss. Jämfört med shammöss ökade IRI markant apoptoshastigheten såväl som nivåerna av apoptosrelaterade proteiner, såsom FasL, p53 och Bax, njurar hos möss(Figur 2A–F). Sådana förändringar i njurar hos AKI-möss reducerades markant genom uttryck in vivo av exogent Wnt1 före IR. Nukleär faktor-kappa B (NF KB), särskilt dess heterodimera form p65/p50, spelar en avgörande roll för att reglera det inflammatoriska svaret i njurarna hos AKI-möss. Western blot-analys visade att både p65 och dess fosforylerade form (p-p65) var markant ökade njurar hos möss efter IRI, medan sådana förändringar förhindrades av exogent Wnt1(Figur 2G). Dessa fynd tyder på att in vivo-uttryck av exogent Wnt1 före IR förhindrar apoptos och hämmar NF-KB-aktiveringsnjurar hos AKI-möss.

FIGUR 4|In vivo uttryck av exogent Wnt1 före IR nedreglerar endogent Wnt1 och -catenin i njurar hos möss efter AKI-CKD progression

(A)Representativa mikrofotografier visar Wnt- och -catenin-proteinuttryck i olika grupper som anges. Skalstång, 50 µm.(B–E)Representativa Western blotanalyser av Wnt1-, -catenin- och aktiva-cateninproteinnivåer i olika grupper enligt indikation.(F) mRNA-uttryck av TGF- i olika grupper enligt indikation.*P < 0.05;="" **p="">< 0,01.="" n="">

In vivo uttryck av exogent Wnt1Before IR förhindrar utvecklingen av akut njurskada till kronisk njursjukdom

Vi undersökte sedan om aktivering av Wnt/-cateninbefore IR kan förhindra utvecklingen av AKI till CKD. Visas iFigur 3A, möss genomgick antingen hydrodynamisk svansveninjektion av Wnt1-expressionsplasmid (PHA-Wnt1) eller intraperitoneal injektion av ICG-001 3 dagar före UIRI. Både serumkreatinin- och BUN-nivåerna ökade hos möss 11 dagar efter UIRI(Figur 3B, C). Dessutom avslöjade Masson-trikromfärgning framträdande renal kollagenavlagring och fibrotiska lesioner hos möss 11 dagar efter UIRI(Figur 3D). Dessa observationer indikerar utvecklingen av AKI till CKD hos möss efter UIRI. Noterbart är att de observerade förändringarna av biomarkörer för njurskada i serum och njurfibros hos möss med CKD nästan helt förhindrades genom förbehandling av exogent Wnt1, men inte ICG-001. Därför förhindrar uttryck in vivo av exogent Wnt1 före IR utvecklingen av AKI till CKD hos möss.

In vivo uttryck av exogent Wnt1 Innan IR nedreglerar EndogenousWnt1 och -Catenin i njurarna

Vi undersökte ytterligare effekten av exogen Wnt1 onendogen Wnt/-catenin-signalering i njurar hos CKD-möss. Som visas i figur 4A avslöjade immunhistokemisk färgning att både endogen Wnt1 och -catenin var markant uppreglerade i njurar hos möss vid 11 dagar efter IRI. Deras proteinnivåer reducerades kraftigt genom förbehandling av exogent Wnt1, men inte ICG-001. Western blot-analyser bekräftade den hämmande effekten av exogent Wnt1, men inte ICG-001, onendogent uttryck av Wnt1, -catenin och aktiva -cateninin-njurar från CKD-möss (Figur 4B–E). Wnt/-catenin- och TGF-signaleringsvägarna överhörning vid njurfibros. MRNA-uttrycket av TGF- inducerades i njurar hos CKD-möss, och sådan induktion minskades av exogent Wnt1, men inte ICG-001 (Figur 4F). Därför hämmar förbehandling av exogen Wnt1 endogen njur-Wnt/-cateninsignalering hos CKD-möss.

FIGUR 5|In vivo uttryck av exogent Wnt1 före IR nedreglerar njur Wnt/-catenin målgener hos möss efter AKI-CKD progression

(A, B) mRNA-uttryck av PAI-1 och MMP-7 i olika grupper som anges.(C–E)Representativa Western blot-analyser av PAI-1- och Klotho-proteinnivåer.(F)mRNA-uttryck av Klotho. *P < {{0}}.05;="" **p="">< 0,01.="" n="">

In vivo-uttryck av exogent Wnt1Before IR nedreglerar RenalWnt/-Catenin-målgener i möss

Jämfört med shammöss, var mRNA-uttrycket av PAI-1och MMP-7, två direkt nedströmsmål för Wnt/-cateninsignalering, signifikant uppreglerad i njurarna hos möss 11 dagar efter UIRI(Figur 5A, B). Förbehandling av exogent Wnt1, men inte ICG-001, hämmade PAI-1- och MMP-7-mRNA-uttryck i CKD-möss. Western blot-analys visade att PAI-1-proteinnivåer ökade i njurar hos CKD-möss, där de avskaffades genom förbehandling av exogent Wnt1, men inte ICG-001(Figur 5C, D). Klotho är anendogen Wnt-antagonist genom bindning och sekvestrering av Wnt-ligander. Jämfört med shammöss minskade både mRNA- och proteinnivåerna av Klotho i njurarna hos möss 11 dagar efter UIR(Figur 5E, F). Förbehandling av exogent Wnt1, men inte ICG-001, återställde nästan helt Klotho-mRNA och proteinuttryck i njurar hos möss med kronisk nyckling. Dessa fynd tyder vidare på den hämmande effekten av exogen Wnt1 på endogena Wnt/-catenin-signalerande njurar hos CKD-möss.

In vivo-uttryck av exogent Wnt1Before IR minskar njurfibros hos möss efter akut njurskada - kronisk njursjukdomsprogression

Vi undersökte därefter effekten av Wnt/-catenin-aktivering före IR på njurmatrisgener och fibrotiska lesioner i CKD-möss. Jämfört med skenmöss inducerades mRNA-uttrycket av fibronektin(FN), kollagen I, kollagen III och -SMA markant i njurar hos möss 11 dagar efter UIR(Figur 6A–D)Sådana förändringar minskade genom förbehandling av exogent Wnt1, men inte ICG-001. Western blot-analys visade att proteinnivåerna av FN och -SMA var signifikant ökade njurar hos CKD-möss, och sådana förändringar avskaffades genom förbehandling av exogent Wnt1, men inte ICG-001(Figur 6E–G). Effekterna av exogent Wnt1 och ICG-001 på FN-proteinuttryck i CKD-möss validerades genom njurimmunfärgning med en FN-antikropp(Figur 6H). Dessa fynd tyder på att förbehandling av exogen Wnt1 förhindrar njurfibrogenes i IR-inducerade CKD-möss.

FIGUR 6|In vivo uttryck av exogent Wnt1 före IR minskar njurfibros hos möss efter AKI-CKD progression

(A–D)mRNA-uttryck av fibronektin, kollagen I, kollagen III och -SMA.(E–G)Representativa Western blot-analyser av fibronektin- och -SMA-SMA-proteinnivåer.(H)Immunfärgning av fibronektin njursektioner. *P < {{0}}.05;="" **p="">< 0,01;="" †p="">< 0,05.="" n="5." skalstång,="" 50="">

In vivo uttryck av exogent Wnt1 Innan IR dämpar njurinflammation efter akut njurskada - kronisk njursjukdomsutveckling

Jämfört med shammöss var mRNA-uttrycket av inflammatoriska gener, såsom IL-1, IL-6 och TNF-, signifikant uppreglerat i njurarna hos möss 11 dagar efter UIR(Figur 7A–C). Sådana förändringar avskaffades nästan helt genom förbehandling av exogent Wnt1, men inte ICG-001. Western blot-analys visade att proteinnivåerna av både P65 och dess fosforylerade form (p-p65) var markant ökade njurar hos möss efter 11 dagar efter UIRI, vilket indikerar aktiveringen av NF-KB-signalering i CKD-möss(Figur 7D–F). I synnerhet minskade förbehandling av exogent Wnt1, men inte ICG-001 signifikant p65- och p-p65-proteinnivåerna i njurarna hos CKD-möss. Dessa fynd tyder på att förbehandling av exogent Wnt1 förhindrar njurinflammatoriska svar hos CKD-möss.

FIGUR 7|In vivo uttryck av exogent Wnt1 före IR dämpar njurinflammation hos möss efter AKI-CKD progression

(A–C) mRNA-uttryck av IL-1, IL-6 och TNF- i njurar hos möss. (D–F)Representativa Western blot-analyser av p65- och p-p65-proteinnivåer. *P < 0.05;="" **p="">< 0,01.="" n="">

Exogen Wnt1 skyddar tubulära celler mot apoptos inducerad av hypoxi-reoxygenationsskada in vitro

För att ytterligare peka ut rollen för Wnt1 i AKI, etablerade vi HKC -8 tubulära cellmodeller av AKI med användning av hypoxi-reoxygenation (H/R) behandling. Flödescytometri användes för att detektera apoptos och avslöjade ökningen av apoptoshastigheten i HCK 8-celler efter H/R-behandling(Figur 8A, B). Exogen Wnt1 minskade markant apoptos i HCK-8-celler efter H/R-behandling. Western blot-analyser visade att H/R-behandling signifikant ökade nivåerna av apoptosrelaterade proteiner, såsom FasL,p54, Bax och Parp{{4} } i HCK-8-celler(Figur 8C–G). Sådana förändringar minskades av exogent Wnt1. Dessa data tyder på att exogen Wnt1 skyddar mot H/R-inducerad apoptos i tubulära celler.

FIGUR 8|Exogen Wnt1 skyddar tubulära celler mot apoptos inducerad av hypoxi-reoxygenation (H/R) skada in vitro

(A)Representativa FACS-analyser visar att Wnt1 hämmade hypoxi/reoxygenation (H/R)-inducerad cellapoptos. HKC-8-celler föruttrycktes med exogent Wnt1, följt av inkubation av inhypoxiska förhållanden i 48 timmar och sedan återsyresättning i 2 timmar.(B) Grafikenpresentationen visar procentandelen apoptotiska celler i olika grupper som anges. De PE-märkta Annexin V-positiva cellerna räknades med flödescytometri. *P < 0.05="" kontra="" kontroller;="" †p="">< 0,05="" mot="" h/r="" (n="">(C) Representativa Western blotanalyser visar proteinuttryck av FasL, p53, Bax och Parp-1 i HKC-8-celler.(D–G)Grafiska presentationer visar den relativa mängden FasL, p53, Bax och Parp-1 i HKC-8-celler. *P < 0.05="" kontra="" kontroller;="" †p="">< 0,05="" mot="" h/r="" (n="">

DISKUSSION

Även om AKI ökar i incidens och är den största riskfaktorn för progression till CKD, finns det inga effektiva terapier för att förebygga och behandla AKI. Ett antal situationer, såsom hjärtkirurgi, intratubulära avlagringar och administrering av nefrotoxiska läkemedel, kan leda till utvecklingen av AKI (Mas-Font et al., 2017). Detta belyser behovet av förebyggande åtgärder av AKI.

Även om många studier stöder de gynnsamma effekterna av Wnt/-catenin-aktivering i patogenesen av AKI, förblir det hemskt om den förebyggande effekten av Wnt/-catenin agonistson AKI. Ett nytt fynd i den aktuella studien är att in vivo-uttryck av exogent Wnt1 före IR kunde skydda möss mot AKI och förhindra utvecklingen av AKI till CKD. In vivo-uttryck av exogent Wnt1 2 dagar före njurbilateralt IR kunde aktivera renal-catenin, vilket ledde till minskad njurapoptos och inflammation hos AKI-möss (1 dag efter IR). Dessutom in vivo uttryck av exogent Wnt1 3 dagar innan njurens unilaterala IR hämmades endogen Wnt/-cateninsignalering och förhindrade utvecklingen av njurfibros i CKD-möss (11 dagar efter IR). Däremot visades in vivo-uttryck av exogen Wnt1 5 dagar efter njur-IR inducera -catenin-aktivering och accelerera AKI till CKD-progression (Xiao et al., 2016). Dessa studier tyder på att tidpunkten för Wnt/-cateninagonister är en viktig faktor när de används för att förebygga och behandla AKI.

Studier tyder på att ihållande aktivering av Wnt/-cateninsignalering kan driva utvecklingen av AKI till CKD. ICG 001 hämmar selektivt Wnt/-catenin/CREB-bindande protein(CBP)-signalering och befinner sig för närvarande i en klinisk prövning för olika cancerformer. Vi har tidigare visat att administrering av ICG -0115 dagar efter IR återställde njurfunktionen och hindrade utvecklingen av AKI till CKD, vilket framgår av minskad njurfibros (Xiao et al., 2016). Dessutom kunde ICG-001-administration med början 3 dagar efter unilateral ureterobstruktion (UUO) försvaga fibrotiska njurskador i UUO-modeller av CKD-möss (Hao et al., 2011). Den aktuella studien visade dock att förbehandling av ICG-001 tre dagar före IR inte hade någon effekt på renal Wnt/-catenin-signalering eller progressionen av AKI tillCKD. Detta är inte förvånande eftersom Wnt/-catenin-signalering uttrycks vid mycket låga nivåer i oskadade vuxna njurar (Tanet al., 2014). Icke desto mindre tyder våra resultat på att tidpunkten och varaktigheten för ICG-001-administrering är avgörande för att bestämma dess terapeutiska resultat.

Mekanismer som ligger bakom den skyddande effekten av Wnt/-catenin kan involvera modulering av apoptos och överlevnadsvägar. Genetisk ablation av tubulus-catenin främjar tubulär apoptos efter IRI- eller folsyrabehandling, medan aktivering av Wnt/-catenin undertrycker pro-apoptotiska proteiner (Wnt/-catenin). 2009; Zhou et al., 2012). I den aktuella studien inhiberade exogen Wnt1 markant tubulär cellapoptos i både IRImouse-modeller av AKI och H/R-inducerade cellmodeller av AKI. Detta tyder på att apoptos kan vara en potentiell mekanism som ligger till grund för den förebyggande effekten av exogen Wnt1 på AKI och AKI till CKD-progression. Den föreliggande studien visade också en hämmande effekt av exogen Wnt1 på NF-KB-aktivering i både AKI och CKD, vilket indikerar undertryckande av inflammatoriskt svar. Det bör dock noteras att huruvida reducerad inflammation är en sekundär effekt till skydd eller skyddsmekanismerna som medieras av exogent Wnt1 återstår att bestämmas. Ytterligare studier behövs för att klargöra den exakta mekanismen för exogent Wnt1-medierat skydd mot AKI och förhindrande av AKI till CKD-progression.

Använd Wnt/-catenin-modulatorer för att förebygga och behandla AKI och CKD

SLUTSATS

Sammanfattningsvis ger den här studien bevis för att stödja den förebyggande effekten av Wnt/-catenin-aktivering på IR-relaterad AKI och CKD, även om mer arbete behövs för att belysa de exakta mekanismerna genom vilka exogen Wnt1 skyddar mot AKI och CKD. Med tanke på den dubbla rollen av Wnt/-catenin-signalering i AKI och CKD, belyser den här studien vikten av timing när man använder Wnt/-catenin-modulatorer för förebyggande och behandling av AKI. Framtida studier som använder mer farmakologiska och genetiska tillvägagångssätt samt optimal behandlingstid och varaktighet är motiverade för att undersöka effekten av Wnt/-cateninagonister i AKI-prevention och behandling.

FRÅN: Exogen Wnt1 förhindrar akut njurskada och dess efterföljande progression till kronisk njursjukdom, Xue Hong^1†, Yanni Zhou^2†, Dedong Wang^3†, Fuping Lyu⁴, Tianjun Guan³, Youhua Liu^1,5och Liangxiang Xiao^{3 *}

Främre. Physiol., 8 november 2021|https://doi.org/10.3389/fphys.2021.745816