Whitening aktivitet av beståndsdelar isolerade från trichosanthes massa

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Rongchao Zhang ,1,2Xiuqin Hu,1Bo Zhang,1ZhenWang,1Chunxiang Hao,1 Jie Xin,1och Qingmei Guo 2

Abstrakt: Blekningenkosmetikamarknaden har en ljus framtid, och rena naturliga blekningsprodukter av traditionell kinesisk medicin har alltid varit en forskningshotspot. I denna forskning isolerades och renades den vita aktiva ingrediensen i kinesisk medicin Trichosanthes massa för första gången, och dessblekningmekanismen klargjordes. Kromatografiska metoder såsom silikagel, ODS och HPLC användes för att isolera och rena dem. B16-celler användes för att mäta antioxidantaktiviteten,tyrosinasaktivitet och melaninborttagande aktivitet. Totalt 20 föreningar isolerades, inklusive p-hydroxibensaldehyd (1), salicylsyra (2), vaniljsyra (3), isovanillsyra (4), protokatekuat (5), transkanelsyra (6), {{9 }}kumarsyra (7), transferulsyra (8), drechslerol-B (9), cyklohexanol 3-palmitat (10), 5-acetoximetyl-2-furaldehyd (11), 5-hydroximetylfurfural (12), diosmetin (13), apigenin (14), krysoberyl (15), luteolin (16), 4'-hydroxiscutellarin (17), quercetin (18), 3', {{31} }dihydroxi-7-(-D-glukopyranosyloxi)-4'-metoxiflavon (19) och ciprofloxacin-7-O- -D-glukosid (20). Bland dem har föreningarna 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 och 20 goda antioxidantreparationseffekter; föreningarna 3, 4, 5, 6 och 7 har hög svartinhibering; föreningarna 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 och 20 har uppenbar tyrosinoxidashämmande aktivitet. 1e-resultaten lade grunden för den fortsatta utvecklingen och utnyttjandet av Trichosanthes massaresurser och ger också en grund för utvecklingen av naturligablekningkosmetika.

Cistanche herbaär ennaturlig blekningsingrediens.

1. Introduktion

Trichosanthes kirilowii Maxim. är en flerårig klätterväxtväxt av familjen Cucurbitaceae. Dess frukt, frön, skal och rot används ofta som traditionella kinesiska mediciner. Under lång tid har massan av Trichosanthes ofta kasserats vid produktion och bearbetning av sperma Trichosanthis och Pericarpium Trichosanthis, vilket resulterar i betydande avfall. För närvarande är rapporter om Trichosanthes-massa huvudsakligen inriktade på jämförelse av innehållet av socker, aminosyror, vitaminer och andra näringsämnen [1–4]. Det finns ingen rapport om den kemiska sammansättningen av Trichosanthes-massa. Därför är det nödvändigt att systematiskt studera massans kemiska beståndsdelar.

Samtidigt, med den snabba utvecklingen av ekonomin, är kosmetika inte bara livsstilsprodukter med hög konsumtion utan blir också de mest populära "nödvändigheterna" för kvinnor. Många böcker om klassisk kinesisk medicin eller materiamedica har registrerat att Trichosanthes-massa har funktionen attblekningoch rynkborttagande effekter [5–7]. 1e tidigare resultat från vår forskargrupp visar att vattenextraktet av Trichosanthes-massa hade högretyrosinashämmande aktivitet, och tyrosinasinhiberingsgraden var cirka 70 procent. 1egemensamtblekningmedel vitamin C (VC) och arbutin användes som kontrollämnen [8]. Det var preliminärt bevisat att extraktet av Trichosanthes-massa hade en viss blekningseffekt genom att hämma aktiviteten av tyrosinas. Därför är det av stor betydelse att studera de kemiska beståndsdelarna och blekningsmekanismen i Trichosanthes-massa.

Deblekningmekanism kan sammanfattas som hämmar syntesen av melanin och påskyndar överföringen av melanin. 1e processen för melaninbildning i melanocyter är som följer:tyrosinasoxiderar tyrosin till polymorf BA (DOPA); sedan oxideras det till dopakinon. Efter en rad metaboliska reaktioner produceras melanin.Tyrosinas är det enda hastighetsbegränsande enzymet i reaktionsprocessen, och dess aktivitet bestämmer mängden melanin som syntetiseras. När tyrosinasaktiviteten förstärks ökar melaninsyntesen; när tyrosinasaktiviteten hämmas reduceras melaninsyntesen [9]. 1e aktivt centrum av tyrosinas har ett dubbelt kopparaktivt ställe, och varje kopparjon kombineras med 3 histidinrester med 1 eller 2 valenser. Därför kan reduktionen med antioxidanteffekter interagera med kopparatomen på det aktiva stället för tyrosinas eller minska mellanprodukten i processen för melaninsyntes för att hämma bildningen av melanin[10, 11]. Dessutom kan inhibering av överföringen av mogna melanocyter till keratinocyter också spela en roll för blekning.

Cellodlingsteknik används för att bestämma effekten avblekningaktiva ingredienser påtyrosinasaktivitet och melaninproduktion i melanocyter in vitro. 1e musmelanomcellinje (B16-celler) härrör från hudmelanomceller från mus, och dess grundläggande struktur, särskilt när det gäller melaninsyntes, är i princip densamma som hos humannormala melanomceller. Eftersom det är mycket svårt att odla mänskliga primära hudmelanomceller, kan musmodellen användas som en testcell för bestämning avblekningaktiva ingredienser. Därför användes B16-celler för att mäta antioxidantaktivitet, tyrosinasaktivitet och melaninavlägsnande aktivitet, och de vita aktiva komponenterna och den relaterade mekanismen bestämdes preliminärt. Resultaten lade grunden för den fortsatta utvecklingen och utnyttjandet av Trichosanthes massaresurser och ger också en grund för utvecklingen av naturlig blekande kosmetika.

2. Experiment

2.1. Material.

Trichosanthes trichosanthis samlades in från planteringsbasen Hebao för örtmedicin i Pinyin, Jinan. 1e prover identifierades av professor QingmeiGuo vid Shandong University of Traditional Chinese Medicine. Efter avlägsnande av skalet och fröna erhölls fruktköttsdelen. Efter frystorkning krossades massan, blandades och placerades slutligen i en exsickator för vidare användning.

färsk cistanchemedechinakosideffekter

2.2. Cellviabilitet.

B-16-celler (musmelanomceller) köptes från KeyGEN och hölls i DMEM-medium kompletterat med 10 procent fetalt bovint serum (FBS), vid 37 grader i en fuktad atmosfär med 5 procent CO2. 1en, såddes B-16-celler i 96-brunnsplattor (10 × 104 celler/brunn) under 24 timmars inkubation.

2.3. Beredning av olika extrakt.

Råmaterialet för massan av Trichosanthes kirilowii var 4,5 kg. 1e massa blötlades i 10 gånger mängden 95 procent etanol 3 gånger. 1e extrakt kombinerades och koncentrerades till ca 3,0 1. Anetylacetatextrakt erhölls genom att dispergera etanolextraktet i 15 1 vatten, extrahera det med etylacetat tills extraktet var färglöst. 1e-extrakten kombinerades och koncentrerades under reducerat tryck.

Etylacetatextraktet blandades med silikagel (100–200 mesh) i ett förhållande av 1:2 (extrakt: silikagel, v/ v). Lösningsmedlet avdunstades och gelén reserverades. 1e glaskromatografikolonn (8{{30}} mm × 1200 mm) packades med 200–300 mesh silikagel och D101 makroporöst harts, och sedan eluerades kolonnen med etylacetat, petroleumeter (10 procent, 25 procent, 50 procent, 75 procent och 100 procent) och metanol, etylacetat (5 procent, 10 procent, 25 procent, 50 procent) , 75 procent och 100 procent ), för att samla in varje flöde. Slutligen samlades varje fraktion upp och konfigurerades till följande koncentrationer: 0,003125 mg/ml, 0,00625 mg/ml, 0,0125 mg/ml, 0,025 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,25 mg/5 mg/0,25 mg/ml. ml, 1,0 mg/ml och 2,0 mg/ml, och användes sedan för att bearbeta de odlade cellerna. I slutet av behandlingen tillsattes 20 μL MTT-lösning (5 mg/ml) till varje brunn. 1e-celler inkuberades i 20 minuter vid 37 grader. 1 esupernatant kasserades och 100 μL DMSO sattes till varje brunn. 1e-absorbansen mättes vid 490 nm. 1eexperimentet upprepades 3 gånger. 1e överlevnadsgrad beräknades enligt följande:

överlevnadsgrad procent=(experimentell grupp blank grupp)/(kontrollgrupp - blank grupp) × 100 procent .

Den optimala koncentrationen (C1) för varje fraktion beräknades i enlighet med det funktionella förhållandet mellan överlevnadsgraden och varje fraktionskoncentration. Cl späddes ut 2, 4, 6 och 8 gånger för att erhålla koncentrationerna C2, C3, C4 respektive C5. 1e olika extrakt av massan visas i tabell 1.

Tabell 1: Polära extrakt av Trichosanthes-massa och optimal koncentration.

2.4. Whitening Experiment

2.4.1. Antioxidanttest.

En MTT-analys användes för att bestämma cellviabilitet (MTT Kit, Kaiji Biology). 1en, B-16-celler såddes i 96-brunnsplattor (10 × 104 celler/brunn) under 24 timmar och behandlades med olika extrakt eller förening i 24 timmar. Efterbehandling kastades odlingsmediet och tvättades två gånger med PBS. 1en tillsattes 0,05 procent H2O2 och cellerna odlades i 4 timmar. Därefter inkuberades B-16-celler i 20 µL MTT-lösning (5 mg/ml) vid 37 grader i 4 timmar. 1en avlägsnades odlingssupernatanten och återstoden löstes i 100 µL DMSO. 1e-absorbans detekterades vid 490 nm med användning av en mikroplattläsare (Tecan Trading AG). 1eexperiment utfördes parallellt 3 gånger.

2.4.2. Hämning av melaninproduktion.

Produktionen av melanin bestämdes genom att detektera melanininnehållsceller genom NaOH-pyrolys [12]. Celler såddes i 96-brunnsodlingsplattor under 24 timmar vid en celldensitet på 10 ×104 celler/brunn.1en, cellerna behandlades med olika extrakt eller förening i 24 timmar. Därefter avlägsnades cellkultursupernatanten (300 µL) och återstoden löstes i NaOH (1 ml, 1,0 mol/L) under 24 timmar vid rumstemperatur. Absorbansen mättes vid 475 nm med användning av en mikroplattläsare (Tecan Trading AG). 1e experiment utfördes parallellt med 3 replikat. 1e IC50 bestämdes av programvaran GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., San Diego, Kalifornien), och arbutin användes som en positiv kontroll (IC50 =15,6 µL).

2.4.3. Tyrosinasaktivitetsbestämning.

Cellkultursupernatanten avlägsnades och återstoden löstes i Tritonx-100 (90 µL) ochtyrosinas(10 µL, 1,0 mg/ml, Sigma, T3824 25ku). Efter blandning inkuberades blandningen vid 37 grader i 30 minuter. 1e absorbans mättes vid 475 nm med användning av en mikroplattläsare (Tecan Trading AG). 1eexperiment utfördes parallellt 3 gånger. 1e IC50 bestämdes med programvaran GraphPad Prism 5 (GraphPadSoftware, Inc., San Diego, Kalifornien), och arbutin användes som en positiv kontroll (IC50 =15,6 µL).

2.5. Extraktion och isolering. Etylacetatextraktet löstes i metanol och kolonnen packades med 200–300 mesh silikagel, som jämviktades med petroleumeter. 1en, en gradienteluering bestående av petroleumeter och etylacetat i förhållanden av 2:1, 1:1 och 1:2; Etylacetat; etylacetat och metanol i förhållanden av 2:1, 1:1 och 1:2; och metanol användes i samband med TLC för att erhålla föreningar A (11,5 g), B (10,4 g), C (12,1 g), D (5,2 g) och E (6,1 g).

A separerades genom polyamidkolonnkromatografi med användning av diklormetan och metanol i förhållanden av 2:1, 1:1 och 1:2 som elueringslösningsmedel. le eluat övervakades med TLC. Fläckar med samma retentionsfaktor (rf) kombinerades och Al och A2 erhölls. 1en, A1 framställdes genom TLC, med användning av diklormetan och metanol i ett förhållande av 1:1 som framkallningsmedel, och renades flera gånger av gelkolonnen. Slutligen erhölls förening 1 (17 mg) och förening 2 (27 mg). A2 renades genom kiselgelkolonnkromatografi med användning av diklormetan och metanol som elueringsmedel i förhållanden av 1:1 och 1:2. Förening 3 (11 mg), förening 4 (12 mg) och förening 5 (23 mg) erhölls. B separerades genom omvänd fas C18 medeltryckskromatografi (RP-C18), med användning av metanol, vatten i en gradienteluering enligt följande: 0 procent ,10 procent , 15 procent , 20 procent , 25 procent , 30 procent , 35 procent, 40 procent, 50 procent, 75 procent, 90 procent och 100 procent. 1e flödeshastighet var 10 ml·min−1. 1e flödesfraktioner med samma rf kombinerades och B1 och B2 erhölls. Bl renades upprepade gånger med gelkolonnen med metanol som elueringslösningsmedel. Förening (24 mg), 7 (21 mg) och 8 (18 mg) erhölls efter upprepad eluering. B2 renades med gelkolonnen och metanol och förening 9 (11 mg) erhölls. C separerades med RP-C18 och eluerades med metanol och vatten med en flödeshastighet på 10 mL·min−1. 1e flödesfraktioner med samma rf kombinerades och Cl, C2 och C3 erhölls. Cl framställdes med gelkolonnen och eluerades med metanol, och förening 10 (13 mg) erhölls. C2 separerades med silikagelkolonn och eluerades med etylacetat och metanol, med en gradienteluering i förhållandena 2:1, 1:1 och 1:2. C2 renades genom preparativ vätskefasextraktion och föreningarna 11 (15 mg) och 12 (14 mg) erhölls. C3 separerades med polyamidkolonnen, eluerades med metanol och vatten och renades med HPLC. Föreningarna 13 (34 mg), 14 (42 mg) och 15 (38 mg) erhölls. D separerades med RP-C18 och eluerades med metanol och vatten.1e flödeshastigheten var 10 mL·min−1. Föreningarna 16 (36 mg), 17 (19 mg) och 18 (37 mg) erhölls genom HPLC. Föreningarna 19 (29 mg) och 20 (34 mg) erhölls genom gradienteluering med användning av etylacetat och metanol i förhållanden av 1:1 och 1:2, följt av 100% metanol på en silikagelkolonn.

herba epimedium sagittatum på huden

3. Resultat och diskussion

3.1. Bestämning av aktiva extrakt (E1–E11).

1e optimal koncentration (nämligen C1) av varje extrakt beräknades och visas i tabell 1. 1e antioxidantexperiment visar att alla extrakt har antioxidantreparationseffekt, men jämfört med VC är antioxidanteffekten för varje grupp svag. 1eantioxidantaktiviteten hos E1, E3, E4, E7 och E11 minskade med ökande koncentrationer, som visas i figur 1. 1e melanininhiberingstest visade att alla polära komponenter i pulpof Trichosanthes kirilowii hämmade melaninsyntesen. I synnerhet var melaninhämningshastigheten signifikant högre för E2, E3 och E4 än för den positiva kontrollen arbutin, som visas i figur 2. 1e resultat avtyrosinasaktivitet visar att alla polära komponenter i massan av Trichosanthes kirilowiii hämmade tyrosinasaktiviteten, och hämningstrenden var liknande den för melaninhämning. 1e-inhibering av tyrosinasaktivitet var signifikant högre för E2, E3, E4 och E8 än för den positiva kontrollen. I allmänhet har extrakten från petroleumeter en låg hämmande effekt på tyrosinas.1e extrakt från etylacetat har en hög hämmande effekt på tyrosinas, speciellt de polära komponenterna från etylacetat. 1e-extrakt från n-butanol har också en hög hämmande effekt på tyrosinas, som visas i figur 3.

3.2. Isolering och identifiering av monomerkomponenter.

20 föreningar separerades med silikagel och ODS-kromatogramkolonner såväl som preparativ HPLC. På basis av NMR- och MS-dataanalyser klargjordes deras strukturer.1e 20 föreningar visas i tabell 2, och specifika analytiska data för monomerer visas i bilaga 1.

3.3. Valideringsanalys av effektiva föreningar

3.3.1. Valideringsanalys av antioxidantföreningar.

E1, E2, E3, E4 och E5 har antioxidanteffekter. 1e huvudföreningar isolerade från ovanstående komponenter var drechslerol-B (förening 9), cyklohexanol 3-palmitat (förening 10), 5-acetoximetyl-2-furaldehyd (förening 11), 5-hydroximetylfurfural ( förening 12), diosmetin (förening 13), apigenin (förening 14), chrysoberyl (förening 15), luteolin (förening 16), 4'-hydroxi-scutellarin (förening 17), quercetin (förening 18), 3', {{ 25}}huvudföreningarna var glykosider, vilket tyder på att glykosider har goda antioxidantaktiviteter. Fenolsyror, såsom 5-acetoximetyl-2-furaldehyd (förening 11), 5-hydroximetylfurfural (förening 12), diosmetin (förening 13), apigenin (förening 14), krysoberyl (förening 15) ,luteolin (förening 16), 4'-hydroxiscutellarin (förening 17), quercetin (förening 18) och 3',5-dihydroxi-7-(-Dglukopyranosyloxi)-4'-metoxiflavon, har också goda antioxidantaktiviteter, på grund av den fenoliska hydroxylgruppen och omättade dubbelbindningar [26, 27]. 1e resultat visas i figur 4.

Figur 4: Cellöverlevnadsgrad (procent) av antioxidantexperimentet av olika föreningar från Trichosanthes-extrakt

3.3.2. Valideringsanalys av melaninhämmande föreningar.

E11, E12, E13, E16, E17 och E18 har god hämmande effekt på melaninsyntesen. 1e huvudföreningar isolerade från ovanstående komponenter visas i tabell 2. Enligt metoden i avsnitt 2.4.2 bestämdes effekten av varje förening på syntesen av melanin. Varje förening utvärderades vid följande koncentrationer: 1000 µg/ml, 800 µg/ml, 400 µg/ml, 200 µg/ml och 100 µg/ml. Varje mätning utfördes i tre exemplar och hämningshastigheten för melaninsyntesen beräknades.

Protokatekuat (förening 5), 5-acetoximetyl-2-furaldehyd (förening 11), 5-hydroximetylfurfural (förening 12), diosmetin (förening 13), p-hydroxibensaldehyd (förening 1), salicylsyra (förening 2), vaniljsyra (förening 3), isovanillinsyra (förening 4), trans-kanelsyra (förening 6), 4- kumarsyra (förening 7), apigenin (förening 14), krysoberyl (förening 15 ), luteolin (förening 16), 4'-hydroxiscutellarin (förening 17), quercetin (förening 18), 3',5-dihydroxi-7-(-D-glukopyranosyloxi)-4' -metoxiflavon (förening 19), ofloxacin-7-O- -D-glukosid (förening 20) kan hämma melaninproduktionen [28]. Särskilt vanillinsyra (förening 3), isovanillinsyra (förening 4), protokatekuat (förening 5), transkanelsyra (förening 6) och 4-kumarsyra (förening 7) har hög melanininhibering. 1e resultat visas i figur 5.

3.3.3. Verifiering och analys av föreningar som hämmar tyrosinasaktivitet.

E2, E3, E4, E7, E8 och E9 har goda hämmande effekter påtyrosinasaktivitet. 1e huvudföreningar isolerade från ovanstående komponenter visas i tabell 2. Enligt metoden som presenteras i avsnitt 2.4.3 användes arbutin som kontroll och koncentrationen av föreningen var 1000 µg/ml, 800 µg/ml, 400 µg/mL 200 µg/ml och 100 µg/ml. Varje mätning utfördes 5 gånger och hämningshastigheten för tyrosinas beräknades. 1e-resultaten visas i figur 6.

1e resultat visar att diosmetin (förening 13), apigenin (förening 14), chrysoberyl (förening 15), luteolin (förening 16), 4'-hydroxiscutellarin (förening 17), quercetin (förening 18), 3', {{10} }dihydroxi-7-(-D-glukopyranosyloxi)-4′-metoxiflavon (förening 19), ciprofloxacin-7-O- -D-glukosid (förening 20), p-hydroxibensaldehyd (förening 1), salicylsyra (förening 2), vaniljsyra (förening 3), isovanillsyra (förening 4), protokatekuat (förening 5), transkanelsyra (förening 6), 4-kumarsyra (förening 7) ), och trans-ferulsyra (förening 8) har alla uppenbaratyrosinashämmande aktiviteter.

Cistanche-växten hämmar tyrosinasaktivitet.

Klicka på bilden och få mer information.

Hydroxylsubstituerade föreningar på bensenringen, såsom p-hydroxibensaldehyd (förening 1), salicylsyra (förening 2), vaniljsyra (förening 3), isovanillinsyra (förening 4), protokatekuat (förening 5), transkanelsyra ( förening 6), 4-kumarsyra (förening 7), trans-ferulsyra (förening 8) och flavonoider, uppvisade hög tyrosinasinhibering, och hämningshastigheten för para-substituerade föreningar var signifikant högre än den för orto-substituerade föreningar . Till exempel var den hämmande aktiviteten av p-hydroxibensaldehyd signifikant högre än den för salicylsyra, och den hämmande aktiviteten för vanillinsyra var signifikant högre än den för isovanillicacid. Dessutom var den hämmande aktiviteten för p-hydroxibensaldehyd signifikant högre än den för salicylsyra, vaniljsyra, isovanillinsyra och protokatekuat. En anledning kan vara att de nukleofila grupperna runt det aktiva centret avtyrosinas, såsom –SH, −NH2 och –OH, upptar utrymmet runt det aktiva centret och förhindrar därmed tyrosin från att angripa det aktiva centret. Slutligen hämmades syntesen av melanin [28]. 1e-hämmande aktiviteten hos föreningar innehållande o-dihydroxi var starkare än den för parahydroxiföreningar, och den hämmande aktiviteten för protokatekuat var signifikant högre än den för vaniljsyra. 1e ovanstående fenomen finns också i flavonoider. 1-hämmande graden av flavonoider innehållande 7 och 4' hydroxylgrupper var signifikant högre än om 7 och 4' hydroxylgrupperna ersattes. Till exempel var den hämmande aktiviteten för krysoberyl signifikant högre än den för diosmetin, medan den hämmande aktiviteten för diosmetin var högre än den för 3',5-dihydroxi-7-(-D-glukopyranosyloxi)-4 ′- metoxiflavon och ciprofloxacin-7-O- -D-glukosid. 1hämmande frekvensen av flavonoider innehållande 3-hydroxi var signifikant högre än för föreningar utan 3-hydroxi eller om 3-hydroxien ersattes. Till exempel var den hämmande aktiviteten av quercetin signifikant högre än den för 4'-hydroxiscutellarin, men den hämmande aktiviteten för 4'-hydroxiscutellarin var högre än den för quercetin-3-o glukosid. Dessutom är den hämmande aktiviteten hos koellin tvättare än för apigenin men lägre än den för luteolin. Det föreslås att B-ringssubstituenterna, särskilt hydroxylgruppen, kan förbättratyrosinashämmande aktivitet, och ortodihydroxigruppen i B-ringen hade större hämmande aktivitet [29].