En homozygot Dab1−// är en potentiell ny orsak till autosomala recessiva medfödda anomalier hos möss njure och urinvägar
Feb 28, 2022
Introduktion
Yotari-mutantmöss, erhållna genom spontant förvärv av en mutation i Dab1-genen, uppvisar histologiska abnormiteter i det centrala nervsystemet [1,2], mycket lika de hos haspelmöss (reelin//), vilket tyder på att reelin och DAB1 tillhör samma signalväg [1–4]. Avvikelserna i reelin/DAB1-vägen har rapporterats vara associerade med olika psykiatriska störningar [5–7]. Intressant nog, förutom det centrala nervsystemet, har närvaron av DAB1- och reelin-proteiner också bekräftats i det perifera nervsystemet och vissa extraneurala vävnader. Närvaron av DAB1 har hittats i muspodocyter [8] och mänskliga fosternjurar[9] medan reelin-uttryck har rapporterats under mus och mänsklig fosterutveckling, såväl som i vissa endotelceller längs blodkärlen hos den vuxna musen [9-11]. Den kanoniska reelin/DAB1-vägen kan utlösa distinkta nedströmsproteiner, inklusive NOTCH2-receptorer, som spelar avgörande roller i cellödebeslut och differentiering undernjureutveckling [12–14]. NOTCH2-receptorer krävs för att bilda proximala tubuli och podocyter [13], men när nefronmognad har uppnåtts tystas denna väg mestadels [15]. Vid akuta tillståndnjursjukdomar,ökat uttryck av NOTCH2 kan potentiellt bidra till regenerering, medan ihållande uttryck är kausalt associerat med interstitiell fifibros och glomeruloskleros [15]. Nedreglering av NOTCH-signalering kan kraftigt minska autofagi och orsaka försämring av podocytdifferentiering under utveckling [16].
Följaktligen spelar dysfunktionella podocyter en avgörande roll vid glomerulär sjukdom, särskilt vid humant idiopatisk nefrotiskt syndrom [17,18] och vid nefrotiskt syndrom med minimal förändring (MCNS) [19]. Därför upprätthåller autofagi cellulär homeostas under normala fysiologiska förhållanden, medan den under patologiska tillstånd kan utvecklas till autofagisk död [20]. En allmänt använd biomarkör för autofagi är LC3B, ett strukturellt protein av autofagosomala membran [21]. Komplex överhörning mellan autofagi och apoptos bidrar också till upprätthållandet av homeostatisk balans som ett svar på cellens mikromiljö. Det är välkänt att apoptotiska händelser ökar i antal undernjureutveckling [22] och avtar avsevärt när mognaden är över, förutom under förhållanden avnjurskada[23]. Onekligen är apoptos en komplex mekanism som regleras genom samspelet mellan flera vägar men slutar oftast med aktivering av caspase3 (CASP3), vars aktivering är en av de mest använda markörerna för apoptosdetektering [23].
I den här rapporten syftade vi till att analysera hur Dab1-genens funktionella tystnad påverkarnjuremorfologi och uttryck och lokalisering av reelin, NOTCH2, LC3B och kluvna CASP3-proteiner i postnatala mössnjurar. Vi antar att dessa proteiner uttrycks i den postnatala musennjure,och deras funktionella samspel bidrar till att upprätthålla deras struktur och funktion. Dessutom, eftersom närvaron av DAB1 har bekräftats under foster människanjureutveckling [9], kan det antas att dess inaktivering kan orsaka störningar i ett brett spektrum av medfödda anomalier injureoch urinvägar (CAKUT).
Nyckelord:yotari; njurfunktion; postnatal njurutveckling; immunofluorescensfärgning; transmissionselektronmikroskopi
CISTANCHE KOMMER FÖRBÄTTRA NJUR/NJURFUNKTIONEN
Material och metoder
ProvsamlingSom Dab1 noll konventionella mutanter använde vi yotari (Dab1/) möss som tidigare beskrivs av Howell et al. [24]. PCR-primrar som användes för genotypning av mössen var yotari: GCC CTTCAGCATCACCATGCT och CAGTGAGTACATATTGTGTGAGTTCC, vildtyp av Dab1-lokus: GCCCTTCAGCATCACCATGCT och CCTGTTTCTTTGCTTTAA-GGCTGT [5]. C57BL/6 N-möss uppföddes och inhystes i grupp i standardburar av polykarbonat (inklusive minst en av varje genotyp) med ad libitum tillgång till mat och vatten i ett temperaturkontrollerat (23 ± 2 ◦C) rum med ett 12 timmars ljus/ mörk cykel. På dagarna 4, 11 och 14 efter födseln (P4, P11 och P14) bedövades möss djupt med pentobarbital och perfuserades transkardialt under 1 0 min med fosfatbuffertsaltlösning (PBS, pH 7,2) och 4 procent paraformaldehyd (PFA) 0,1 M PBS.Njurartogs bort och fixerades med 4 procent PFA i 0.1 M PBS över natten för konventionella histologiska analyser (hematoxylin–eosin (H&E), immunhistokemisk och immunofluorescensfärgning) och i en blandning av 2 procent PFA plus 2,5 procent glutaraldehyd (GA) för elektronmikroskopundersökning. Efter fifixering förbereddes vävnad för ytterligare histologisk undersökning, som vi har beskrivit tidigare [25,26].
Immunofluorescens och immunoperoxidasfärgningEfter deparafifinisering och rehydrering upphettades sektioner under 20 min i 0.01 M citratbufferten (pH 6,0) i en vattenångare och kyldes sedan ner till rumstemperatur. Blockeringsbuffert (ab 64226, Abcam, Cambridge, Storbritannien) applicerades i 30 minuter för att utesluta ospecifik färgning. Sektioner inkuberades sedan i en fuktkammare över natten med primära antikroppar (tabell 1). Efter tvättning i PBS applicerades sekundära antikroppar (tabell 1) under en timme och tvättades i PBS igen. Därefter färgades kärnor med 4060 -diamidino-2-fenylindol (DAPI) i 2 minuter, tvättades i PBS och täckglas. Vi utförde preadsorptionstestet så att varje primär antikropp användes med motsvarande peptid och applicerade deras kombination på sektionerna. Resultaten visade ingen antikroppsfärgning. Dessutom utfördes kontroller med utelämnande av den primära antikroppen för att bestämma nivåer av icke-specifik bindning av sekundära antikroppar.
För immunoperoxidasfärgning applicerades kanin polyklonal anti-CASP3 (1:100 spädningar, ab13847, Abcam, Cambridge, Storbritannien) som en primär antikropp under en timme i en fuktkammare efter behandling av snittet med 0,1 procent H2O2. Efter tvättning i PBS utfördes sekundär detektion med användning av länken och streptavidinperoxidas, vardera i femton minuter (DakoCytomation, CA 93013 USA, LOT 03477) och diaminobensidin (Dako, CA 93013 USA, LOT 10051369), kontrollerade noggrant för att undvika bakgrund. Kärnor färgades med hematoxylin, sköljdes i kranvatten i 10 minuter, dehydrerades kort i stigande serier av etanollösningar och täckglas.
Vävnadsförberedelse för transmissionselektronmikroskop (TEM)Efter fixering med en blandning av 2 procent PFA och 2,5 procent GA i 0.1 M PBS under 2 timmar, tvättades proverna med PBS och efterfikserades i en vattenlösning av 2 procent osmiumtetroxid under 2 timmar. Alla prover tvättades två gånger i PBS, dehydrerades i stigande etanolkvaliteter och inbäddades i Epon 812 (TAAB Laboratories Equipment, Reading, Storbritannien). Seriella sektioner (70 nm i tjocklek) skars på en Ultracut UCT-ultramikrotom (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland) och färgades med 1 procent uranylacetat och blycitrat.
Datainsamling och analysAnalysen utfördes med ett epiflfluorescensmikroskop (Olympus BX51, Tokyo, Japan) utrustat med en DP71 digitalkamera (Olympus), ett JEM 1400 transmissionselektronmikroskop (JEOL, Tokyo, Japan) opererat vid 80 kV och fotograferat med en JEOL-laddning. kopplade enheter (CCD) kamerasystem (Advanced Microscopy Techniques, Danvers, MA, USA) och slutligen ett ljusfifältsmikroskop (BX40, Olympus, Tokyo, Japan). Alla analyserade bilder bearbetades med ImageJ-programvara och Adobe Photoshop (Adobe, San Jose, CA, USA). Per undersökt grupp använde vi tre till fyra djur. Allt samlatnjurarskars vid 5 µm tjocka sektioner och maximaltnjure length determined by using these samples was reported. Mean proximal convoluted tubules (PCT), distal convoluted tubules (DCT) and glomeruli diameters were determined by averaging 100 structure diameters per analyzed sample. As nephron segments have irregular shapes, we took the largest diameter of every examined segment as representative. The staining intensity was semiquantitatively evaluated at four degrees: the absence of any reactivity (( ), mild reactivity (+), moderate reactivity (++), and strong reactivity (+++) (Table 2). The number of DAB1, reelin, NOTCH2, LC3B, and cleaved CASP3 immunoreactive cells was counted and expressed as a percentage of total cells. For each sample, we analyzed twenty PCT, DCT, and G at ×40 objective magnifification. We averaged the number of positive cells per group. Any level of nuclear, cytoplasmic, or membrane staining was regarded as positive. Three investigators analyzed the images independently. Interrater agreement was tested with interclass correlation analysis, which yielded a coeffificient >0.75, vilket indikerar utmärkt överensstämmelse [27].
Statistisk analysEtt tvåsidigt t-test utfördes för att analysera skillnaderna i medeldiametern mellan PCT, DCT och G hos vildtyps- och yotaridjur. Diametern presenterades som medel ± standardavvikelse (SD). Signifikansnivån sattes till p < 0.05.="" ett="" tvåvägs="" anova-test="" följt="" av="" tukeys="" multipla="" jämförelsetest="" användes="" för="" att="" undersöka="" skillnaderna="" i="" andelen="" positiva="" celler="" mellan="" pct,="" dct="" och="" glomeruli="" vid="" alla="" tidpunkter.="" procentandelen="" positiva="" celler="" uttrycktes="" som="" medelvärdet="" ±="" standardfel="" av="" medelvärdet="" (sem).="" signifikansnivån="" sattes="" till="" p="">< 0,05.="" analysen="" utfördes="" i="" graphpad="" programvara="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca,="">
Resultat
Hematoxylin-eosinfärgning (H&E) och mätning av njurdiameterH&E-färgning av midsagittala sektioner avnjurarvid alla undersökta tidpunkter belyser det lillanjurefenotyp av yotari-möss jämfört med vildtyp (Figur 1a). Vid 4P medelnjurediametern på yotari-djur var cirka 55 µm än cirka 75 µm. Dessutom var denna skillnad märkbar vid senare tidpunkter på grund av den långsammare tillväxten avnjurari yotari jämfört med den progressiva tillväxten avnjurarhos vildtypsdjur. För att avgöra om minskningen i totaltnjurestorleken orsakades av en minskning av nefronsegmentstorleken, vi tog i genomsnitt diametern av PCT, DCT och G per grupp. Det var faktiskt en minskning av medeldiameter G, PCT och DCT i yotari-gruppen jämfört med vildtyp (Figur 1b, p < 0.05).="" dessutom="" avslöjade="" h&e-färgning="" tunnare="" cortex="">njur-bäckenförlängning hos yotari-djur och något diffust dilaterad DCT vid 14P. Den grundläggande strukturen och mönstret för glomerulär mognad är desamma i båda undersökta djurgrupperna.
Beskrivande histologisk analys baserad på TEM-mikrofotografierPå mikrofotografier erhållna genom TEM, visade glomeruli från vildtypsmöss det typiska utseendet för alla delar av fifiltreringsbarriären, som normalt utvecklades och kändes igen (Figur 2a). Podocyter, podocytfotsprocesser och pediklar, fifiltreringsslitsar, glomerulära basalmembran och kapillärlumen med det fenestrerade endotelet var lätt urskiljbara (Figur 2a). Å andra sidan, i glomeruli hos yotari-möss, kunde progressiv podocytskada med utplåning av fotprocessen och avsaknad av fifiltreringsslitsar observeras (Figur 2b–d). Dessa ultrastrukturella förändringar observerades i allanjurarundersökte och involverade de flesta av de undersökta glomeruli. Inga abnormiteter märktes i PCT eller DCT hos yotari-möss än vildtypsdjur (Figur 2e–h). I PCT definierades cellgränssnitt dåligt på grund av oregelbundenhet hos cellmembran och cellinterdigitation med sina grannar. Cytoplasman var riklig och innehöll väl urskiljbara kärnor, långsträckta mitokondrier, basala inveckningar och många rörformiga gropar mellan mikrovilli, som bildade en borstkant vid det apiala membranet. Högre förstoring avslöjade den apikala ytan av PCT-epitelceller innehållande långa mikrovilli för att bilda borstkanten och täta förbindelser mellan de luminala cellgränserna för närliggande tubulära epitelceller (Figur 2e, f). Å andra sidan innehöll den apikala ytan av DCT-epitelceller få korta mikrovilli och många vesiklar (Figur 2g, h).
Figur 2. Transmissionselektronmikroskop (TEM) mikrofotografier av vildtyp och yotarinjurar.Glomeruli hos vildtypsdjur (a) visade en normalt utvecklad fifiltreringsbarriär med fenestrerat endotel (E) i kapillären (C), basalmembran (BM), podocyter (P) med pediklar (PE) och fifiltreringsslitsar (FS). ). I dennjurarav yotari-djur kunde utplåning av pediklarna och avsaknad av fifiltreringsslitsar noteras (asterisker, b–d). Inga abnormiteter märktes i de proximala hopvikta tubuli (PCT) eller distala hopvikta tubuli (DCT) hos yotari-möss jämfört med vildtypsdjuren (e–h). I PCT var cytoplasman riklig och innehöll välutmärkta kärnor (N), långsträckta mitokondrier (M), basala infoldningar (BI) och många rörformiga gropar (TP) mellan mikrovilli, som bildade en borstkant (BB) vid apikalt membran (e,f). Högre förstoring avslöjade den apikala ytan av PCT-epitelceller innehållande långa mikrovilli för att bilda borstkanten och täta korsningar (TJ) mellan de luminala cellgränserna för angränsande tubulära epitelceller (e,f). Å andra sidan, den apikala ytan av DCT-epitelceller som innehåller få korta mikrovilli och många vesiklar (g,h). Skalstapeln i bilder (a–d) och infällningar (e–h) är 1 µm; skalstrecket i bilder (e–h) är 2 µm.
Lokalisering och samlokalisering av Reelin och DAB1Reelin uttrycktes svagt med mild till måttlig reaktivitet (tabell 2) i glomeruli och DCT hos alla undersökta djur vid alla observerade tidpunkter (p < 0.05,="" figur="" 3a).="" endast="" i="" pct="" av="" yotari-möss="" var="" andelen="" positiva="" celler="" signifikant="" högre="" än="" vildtypsdjur="" (p="">< 0,05,="" figur="" 3a).="" i="" de="" glomerulära="" cellerna="" var="" lokaliseringen="" av="" färgning="" perinukleär,="" medan="" den="" i="" pct="" och="" dct="" var="" spridd="" över="" hela="" cytoplasman="" (figur="">
bild 4. Immunfluorescensfärgning av postnatal yotarinjurarmed reelinmarkör (a) och dubbel immunofluorescensfärgning av postnatal vildtypnjurarmed DAB1 och haspelmarkörer (b). (a,b) Nuclear DNA DAPI-färgning slogs samman med DAB1, och reelin-immunfluorescens visas parallellt (sammansmält). Observerade tidpunkter var P4, P11, P14. Uttryck av de undersökta markörerna i glomeruli (G), proximala konvoluterade tubuli (PCT) och distala convoluted tubuli (DCT) markeras med pilarna, medan asterisker indikerar uttryck av reelin i den extracellulära matrisen (a). Inlägg visar det mest framträdande uttrycket i bilden. DAPI-kärnfärgning avslöjade dålig kolokalisering av DAB1 och reelin, mestadels i DCT (pilspets). Skalstapeln är 20 µm och hänvisar till alla bilder.
Det fanns nästan ingen immunreaktivitet av DAB1 i glomeruli och PCT hos vildtypsdjur vid P4, medan andelen positiva celler med mild reaktivitet (tabell 2) ökade signifikant vid P11 och P14 (p < 0.05,="" figur="" 3b).="" i="" dct="" uttrycktes="" dab1="" mestadels="" vid="" de="" apikala="" och="" laterala="" delarna="" av="" cellmembranen="" (figur="" 4b)="" med="" stark="" reaktivitet="" (tabell="" 2).="" andelen="" positiva="" celler="" var="" betydligt="" högre="" än="" i="" tidigare="" strukturer,="" runt="" 60="" procent="" (figur="" 3b),="" särskilt="" i="" gula="" fläcken="" (figur="" 4b).="" det="" var="" nästan="" ingen="" samlokalisering="" av="" dab1="" och="" reelin="" förutom="" i="" dct="" av="" vildtypsdjur="" vid="" p14="" (pilspets,="" figur="" 4b).="" biomolecules="" 2021,="" 11,="" 609="" 8="" av="" 14="" figur="" 4.="" immunoflfluorescensfärgning="" av="" postnatal="">njurarmed reelinmarkör (a) och dubbel immunofluorescensfärgning av postnatal vildtypnjurarmed DAB1 och haspelmarkörer (b). (a,b) Nuclear DNA DAPI-färgning slogs samman med DAB1, och reelin-immunofluorescens visas parallellt (sammansmält). Observerade tidpunkter var P4, P11, P14. Uttryck av de undersökta markörerna i glomeruli (G), proximala konvoluterade tubuli (PCT) och distala convoluted tubuli (DCT) markeras med pilarna, medan asterisker indikerar uttryck av reelin i den extracellulära matrisen (a). Inlägg visar det mest framträdande uttrycket i bilden. DAPI-kärnfärgning avslöjade dålig kolokalisering av DAB1 och reelin, mestadels i DCT (pilspets). Skalstapeln är 20 µm och hänvisar till alla bilder. Det fanns nästan ingen immunreaktivitet av DAB1 i glomeruli och PCT hos vildtypsdjur vid P4, medan andelen positiva celler med mild reaktivitet (tabell 2) ökade signifikant vid P11 och P14 (p < 0,05,="" figur="" 3b).="" i="" dct="" uttrycktes="" dab1="" mestadels="" vid="" de="" apikala="" och="" laterala="" delarna="" av="" cellmembranen="" (figur="" 4b)="" med="" stark="" reaktivitet="" (tabell="" 2).="" andelen="" positiva="" celler="" var="" betydligt="" högre="" än="" i="" tidigare="" strukturer,="" cirka="" 60="" procent="" (figur="" 3b),="" särskilt="" i="" gula="" fläcken="" (figur="" 4b).="" det="" fanns="" nästan="" ingen="" samlokalisering="" av="" dab1="" och="" reelin="" förutom="" i="" dct="" av="" vildtypsdjur="" vid="" p14="" (pilspets,="" figur="">
Rumsliga och tidsmässiga uttrycksmönster för NOTCH2 och LC3BAndelen NOTCH{{0}}positiva celler var mindre än 20 procent i glomeruli hos båda djurgenotyperna vid alla observerade tidpunkter. Endast vid P14 var andelen positiva celler signifikant högre i glomeruli hos yotari-djur än vildtypsdjur (p < 0,05,="" figur="" 3c).="" färgningsintensiteten="" var="" mild="" till="" måttlig="" (tabell="" 2),="" mestadels="" lokaliserad="" perinukleärt="" (figur="" 5a–f).="" i="" pct="" och="" dct="" för="" båda="" djurgenotyperna="" ökade="" andelen="" positiva="" celler="" över="" tiden.="" vid="" p14="" var="" andelen="" positiva="" celler="" signifikant="" högre="" i="" pct="" och="" dct="" hos="" yotari-djur="" än="" pct="" och="" dct="" hos="" vildtypsdjur="" (p="">< 0,05,="" figur="" 3c).="" signalintensiteten="" vid="" alla="" observerade="" tidpunkter="" var="" mild="" till="" måttlig="" (tabell="" 2)="" och="" spridd="" över="" hela="" cytoplasman="" (figur="" 5a–f).="" figur="" 5.="" immunfluorescensfärgning="" av="" postnatal="" vildtyp="" och="">njurarmed NOTCH2- och LC3B-markörer och immunoperoxidasfärgning med klyvd caspase3-markör (CASP3). (a–f) Nuclear DNA DAPI-färgning slås samman med NOTCH2 och LC3B. Observerade tidpunkter var P4, P11, P14. Uttryck av NOTCH2- och LC3B-markörerna i glomeruli (G), proximala konvoluterade tubuli (PCT) och distala convoluted tubuli (DCT) markeras med pilarna. Speciellt stark LC3B-reaktivitet kan observeras i Bowman-kapseln av ruttnande glomeruli (asterisk, e). Inlägg visar det mest framträdande uttrycket i bilden. CASP3 uttrycktes dåligt i alla observerade tidpunkter. Det enda signifikanta uttrycket var i glomeruli hos yotari-möss på P14 (pilar). Skalstapeln är 20 µm och hänvisar till alla bilder. Biomolekyler 2021, 11, 609 9 av 14 3.4. Rumsliga och temporala uttrycksmönster för NOTCH2 och LC3B Andelen NOTCH2-positiva celler var mindre än 20 procent i glomeruli hos båda djurgenotyperna vid alla observerade tidpunkter. Endast vid P14 var procentandelen positiva celler signifikant högre i glomeruli hos yotari-djur än vildtypsdjur (p < 0,05,="" figur="" 3c).="" färgningsintensiteten="" var="" mild="" till="" måttlig="" (tabell="" 2),="" mestadels="" lokaliserad="" perinukleärt="" (figur="" 5a–f).="" i="" pct="" och="" dct="" för="" båda="" djurgenotyperna="" ökade="" andelen="" positiva="" celler="" över="" tiden.="" vid="" p14="" var="" andelen="" positiva="" celler="" signifikant="" högre="" i="" pct="" och="" dct="" hos="" yotari-djur="" än="" pct="" och="" dct="" hos="" vildtypsdjur="" (p="">< 0,05,="" figur="" 3c).="" signalintensiteten="" vid="" alla="" observerade="" tidpunkter="" var="" mild="" till="" måttlig="" (tabell="" 2)="" och="" spridd="" över="" hela="" cytoplasman="" (figur="">
Figur 5. Immunoflfluorescensfärgning av postnatal vildtyp och yotarinjurarmed NOTCH2- och LC3B-markörer och immunoperoxidasfärgning med klyvd caspase3-markör (CASP3). (a–f) Nuclear DNA DAPI-färgning slås samman med NOTCH2 och LC3B. Observerade tidpunkter var P4, P11, P14. Uttryck av NOTCH2- och LC3B-markörerna i glomeruli (G), proximala konvoluterade tubuli (PCT) och distala convoluted tubuli (DCT) markeras med pilarna. Speciellt stark LC3B-reaktivitet kan observeras i Bowman-kapseln av ruttnande glomeruli (asterisk, e). Inlägg visar det mest framträdande uttrycket i bilden. CASP3 uttrycktes dåligt i alla observerade tidpunkter. Det enda signifikanta uttrycket var i glomeruli hos yotari-möss på P14 (pilar). Skalstapeln är 20 µm och hänvisar till alla bilder.
I glomeruli och DCT hos båda djurgenotyperna ökade andelen LC3B-positiva celler över tiden (p < 0.05,="" figur="" 3d).="" vid="" p11="" och="" p14="" var="" andelen="" positiva="" celler="" signifikant="" högre="" i="" glomeruli="" hos="" yotari-djur="" än="" glomeruli="" hos="" vildtypsdjur="" (p="">< 0.05,="" figur="" 3d).="" i="" glomeruli="" hos="" yotari-djur="" var="" färgningsintensiteten="" mestadels="" måttlig="" till="" stark="" (tabell="" 2)="" lokaliserad="" i="" det="" perinukleära="" och="" nukleära="" utrymmet="" (figur="" 5a–f),="" vid="" alla="" observerade="" tidpunkter,="" medan="" i="" glomeruli="" hos="" vildtypsmöss="" var="" intensiteten="" mestadels="" måttlig="" (tabell="" 2).="" pct="" från="" yotari-="" och="" vildtypsdjur="" innehöll="" cirka="" 20="" procent="" positiva="" celler="" vid="" alla="" observerade="" tidpunkter="" (p="">< 0,05,="" figur="">
Klyvt CASP-3-uttryckDet fanns nästan inget uttryck för den aktiverade CASP-3 injurarav vildtypsdjur vid alla observerade tidpunkter. I PCT och DCT av yotari-möss var flera individuella celler CASP-3-positiva (Figur 3e). Endast i glomeruli av yotari njurar vid P14 (Figur 5e) ökade andelen positiva celler signifikant jämfört mednjurarav vildtypsmöss (p < 0.05, figur 3e).
Diskussion
Njuremorfogenes och utveckling är komplexa processer som är exakt koordinerade genom samspelet mellan ett stort antal gener. Medfödda anomalier avnjureoch urinvägarna (CAKUT) är de vanligaste fosterskadorna som utgör 23 procent av alla sådana defekter och representerar den främsta orsaken till slutstadietnjursjukdomhos barn [28,29]. Enstaka genstörningar kan vara den primära källan till CAKUT, och fram till nu har en mutation i mer än 20 gener identifierats som orsaken till CAKUT [30]. Som vårt tidigare arbete visade stort uttryck av DAB1 under normala fostermänniskornjureutveckling [9], antog vi att DAB1 kan spela en betydande roll under däggdjurnjureutveckling. För att bevisa vår hypotes undersökte vinjuremorfologi och uttrycksmönster för reelin, NOTCH2, LC3B och aktiverade CASP3-proteiner i Dab1 knockout-möss.
CISTANCHE KOMMER FÖRBÄTTRA NJUR-/NJÄRSMÄRTA
Sektion genom yotari-mössennjurarvisade en tunnare cortex och ett betydligt mindre medelvärdenjureoch PCT-, DCT- och G-diametrar jämfört med vildtypsdjur. Minskningen injurestorlek orsakad av otillräcklig nefrontillgång kallasnjur-hypoplasi, en av de vanligaste CAKUT-sjukdomarna, som predisponerar hypertoni hos vuxna och kronisk njursjukdom [31]. Dessutom avslöjade mikrofotografierna som tagits med TEM att yotari-möss uppvisade framträdande podocytskador med utplåning av fotprocessen och avsaknad av fifiltreringsslitsar. Efter skadan genomgår podocyter utplåningsprocessen där de förlorar sin struktur, vilket leder till en minskning av deras fifiltrationsbarriärfunktion [32]. Alla former av nefrotiskt syndrom, såväl som fokal segmentell glomeruloskleros (FSGS), kännetecknas av defekter i podocytstruktur eller funktion [33].
Vår nuvarande studie visade det högsta uttrycket av DAB1 vid de apikala och laterala delarna av cellmembranen i DCT, medan REELIN mestadels var utspridda i cytoplasman i PCT. Vid de undersökta tidpunkterna observerades inga morfologiska förändringar i tubuli hos yotari-möss, men ytterligare undersökning är nödvändig för att belysa rollen av DAB1 i tubulointerstitiala fack. Det förekom en och annan samlokalisering av DAB1- och REELIN-proteinerna, mestadels i DCT. Dessa fynd följer vårt tidigare arbete angående uttrycket av dessa två proteiner under fostermänniskannjureutveckling [9]. Detta kan tyda på att DAB1 och reelin har liknande roller hos människa och musnjurargenom att aktivera några av nedströmsvägarna, såsom Crk, MAPK och PI3K/Akt/mTOR-signaleringskaskader [34–36]. Våra data avslöjade också ökat reelin-uttryck i glomeruli hos yotari-möss. Intressant nog har en tidigare studie visat att DAB1-fosforylering och ökat reelinuttryck i glomeruli åtföljs av hypertoni, proteinuri och podocytskada hos Ang II-infunderade råttor [10].
Dessutom avslöjade immunfluorescensfärgning ett ökat uttryck av NOTCH2-receptorer i glomeruli hos P14 yotari-möss. Det är välkänt att NOTCH2-uttryck nedregleras när nefronmognad har uppnåtts, förutom under förhållanden somnjurskador,såsom diabetisk nefropati och FSGS [15,37]. Möss med Adriamycin-inducerat nefrotiskt syndrom visade också ökat uttryck av aktiverad NOTCH2, vilket förbättrar fifibros [38]. Vid de undersökta tidpunkterna märkte vi inte ökad fifibros, men det återstår att belysa den exakta rollen för den uttryckta NOTCH2 i den postnatala yotarinjurar.Ytterligare observation av om fifibrotiska förändringar inträffar i de senare stadierna skulle vara nödvändig. Det finns dock redan några fynd som tyder på att den kortsiktiga effekten av ökad NOTCH2-aktivering är associerad med en stark överlevnadsfördel för skadade podocyter, som går förlorad i långtidsmodeller, såsom diabetisk nefropati [39].
Högre LC3B-uttryck i glomeruli hos P11- och P14-yotari-möss reflekterade förmodligen en ansamling av autofagosomer i podocyterna. För att tydligt visa att autofagin accelererades. Det är nödvändigt att analysera förhållandet mellan LC3-II och LC3-I proteinuttryck. Under normala förhållanden är autofagi nödvändig för normalnjurfunktion[40], särskilt i podocyter. På grund av dess begränsade kapacitet för celldelning och ersättning, uppvisar de en hög basal nivå av autofagi [41]. Trots dessa fynd har höjning av LC3B-uttryck rapporterats i flera glomerulära sjukdomar [42-44], främst i samband med utplåning av fotprocesser och utveckling av nefrotiskt syndrom, som sett i proreninreceptorbetingade knockoutmöss [45,46]. Alla dessa studier tyder på en skyddande roll av ökad autofagi under patologiska tillstånd, ytterligare stödd av fynden av Adriamycin-inducerad nefropati, där autofagi aktiveras för att skydda mot podocytskada [43], såväl som vid åldersberoende glomerulär sjukdom där den försenar den progressiva funktionella nedgången avnjurfunktion[40]. Analys av människannjurebiopsier visade också tecken på ökad autofagi i samband med utplåning av fotprocesser vid flera glomerulära sjukdomar, inklusive minimal förändring nefrotiskt syndrom (MCNS), som är en av de vanligaste orsakerna till idiopatisk nefrotiskt syndrom [19]. I tillstånden av diabetisk nefropati och lipopolysackarid-inducerad akutnjurskada,förstärkning av autofagi med vissa terapier genom hämning av PI3K/AKT/mTOR-vägen förbättrar njurfunktionen [47,48]. Alla dessa fynd antyder att autofagi har en oumbärlig cytoskyddande roll för stressanpassning injurskada, och dess modulering kan vara en lovande terapeutisk strategi, även om autofagi under vissa omständigheter också kan vara skadligt och utvecklas till celldöd.
CISTANCHE KOMMER ATT FÖRBÄTTRA NJUR-/NJÖRSFULLT
Förutom förhöjningen av autofagi kunde en ökad nivå av apoptos också observeras i glomeruli hos P14 yotari-möss. Autofagi förhindrar vanligtvis apoptos, men under specifika patologiska omständigheter kan den också ha motsatt effekt på cellöverlevnad genom att förstärka och främja apoptos [42]. Efter födseln, apoptos injurarär kraftigt förminskad, utom i förhållandena förnjurskada,såsom idiopatisk nefrotiskt syndrom där bidrar till att utveckla sjukdomen [23]. potentiell ny orsak till autosomala recessiva medfödda anomaliernjureoch urinvägarna. Men huvudrollen för DAB1 undernjureutvecklingen är fortfarande oklar. Dessutom uppvisade dessa möss fotprocessavvikelser och en ökad nivå av reelin, NOTCH2, LC3B och kluvna CASP3-proteiner i glomeruli som kan leda till glomerulära skador, som nefrotiskt syndrom, som i samband med hypoplasi kan vara en potentiell dödsorsak av dessa djur under avvänjningsperioden. För att bekräfta denna hypotes är det nödvändigt att tillhandahålla ytterligare information om blodtryck och andra klinik-laboratorieparametrar, såsom nivåer av serumkreatinin, albumin och proteiner.