En ny strategi för screening av aktiva komponenter i Cistanche Tubulosa baserad på spektrum-effektrelationsanalys och nätverksfarmakologi Ⅱ

3. Resultat och diskussion

3.1. HPLC-fingeravtryck

3.1.1. Metodvalidering

Valideringen för HPLC-metoden visade att den relativa standardavvikelsen (RSD) för metodprecision, reproducerbarhet och stabilitet var mindre än 2,85 procent för den relativa topparean (n = 11) och 0,77 procent för den relativa retentionstiden (n = 11). Precisionen för samma provlösning visade sig inom intervallet 0.05–{{10}},77 procent för relativ tid och 0,28– 2,70 procent för den relativa arean av de vanliga topparna. Experimentets reproducerbarhet låg inom intervallet 0.03–0,20 procent för den relativa tiden och 0,23–2,59 procent för den relativa arean av de vanliga topparna. Provstabiliteten var 0,09–0,24 procent för relativ retentionstid och 0,75–2,85 procent för den relativa arean av de vanliga topparna. Dessa resultat indikerade att det etablerade fingeravtrycket var uppfyllt. De linjära sambanden för geniposidinsyra,echinakosid, akteosid, tubulosid A, ochisoakteosidvisas i tabell S4. Värdet på R kvadrat var 1.0000, vilket indikerar god linjäritet. Resultaten av provåtervinningen visade att den genomsnittliga återvinningen av geniposidinsyra, echinakosid,akteosid, tubulosid A, ochisoakteosidvar 100,37 procent , 103,59 procent , 98,46 procent , 100,81 procent och 101,19 procent , och RSD för provåtervinning var mindre än 2,68 procent .

Klicka här för att få mer information om Cistanche Active Components

3.1.2. Topparea (PA) och relativ retentionstid (RRT)

Referensfingeravtrycken och fingeravtrycken av HMs, WEs och HRs från 11 partier av C. tubulosa presenteras i figur 2. Elva toppar, som uppvisade god separation och upplösning, identifierades som vanliga toppar bland HMs, WEs och HRs. De fem standardföreningarna identifierades som geniposidinsyra (A2),echinakosid(A8),akteosid (A9), tubulosidA (A10), ochisoakteosid(A11). Standardföreningen,echinakosid, som fanns närvarande i alla kromatogram (genomsnittlig retentionstid 12,86 min) med en lämplig topparea och god stabilitet, valdes som referenstopp och användes för att beräkna de relativa retentionstiderna (RRT) för de övriga tio vanliga toppar. RRT:erna för dessa olika former ligger i intervallet 0.16–1.51. PA och varianskoefficienten (CV procent ) för dessa vanliga toppar listas i tabellerna S5–S7. Från data är CV-procentvärdena för PA i olika former 25,78 procent –142,02 procent, 23,36 procent –150,38 procent och 28,91 procent –112,78 procent för HMs, WEs respektive HRs. Dessa resultat visar signifikanta skillnader i koncentrationen av var och enCistanche tubulosasammansatt bland de olika formerna. Fingeravtrycken för HMs, WEs och HRs visas i figur 3.

Figur 2 HPLC-fingeravtryck av standardprover

3.1.3. Innehållet i HM, WE och HR

Fem standardbeståndsdelar avC. tubulosamättes. Innehållet i huvudkomponenterna visas i tabell 1. Jämförelsen mellan HMs, WEs och HRs visas i tabell 2 och figur 4. PhGs i C. tubulosa är biologiskt aktiva men värmekänsliga. Värmekänsliga komponenter som löser sig i vatten kan effektivt utvinnas med en rimlig metod. I allmänhet extraheras Cistanche herba med vatten och indunstas sedan till en koncentrerad lösning för följande kemiska analys [26, 27, 30]. Efter extraktion och koncentrering användes spraytorkningsteknik och proceduren modifierades från föregående artikel. Vatten avlägsnades snabbt från den flytande ångan, och sedan erhölls torra extrakt av råmaterial från växter. I detta steg anses tillsats av maltodextrin vara en vanlig bärare för att förbättra dispersionen och förlänga lagringstiden. Genom en serie tillverkningsprocesser pressades sedan örtväxter till formelgranulat med tillsatser. Detta steg att tillsätta hjälpämnen inkluderades inte i experimentet. Generellt sett inkluderar vår produktionsprocess extraktion, koncentrering och spraytorkning, som beskrivs i avsnitt 2.2, parallellt med en process för framställning av formelgranulat. För att producera dessa halvfabrikat måste ovanstående tre steg följas. Proceduren för att bilda WEs involverar koncentration och spraytorkning, vilket lätt orsakar förlust av värmekänsliga komponenter, men HR erhålls efter extraktion och torkning av HM. Vi undrar om det är möjligt att aktiva komponenter finns kvar i HR. Enligt våra resultat minskade innehållet av verbascoside signifikant från HMs till WEs och HRs ( respektive ). Den termiska stabiliteten hos verbascoside undersöks genom att övervaka förändringarna i topparean genom HPLC under uppvärmningsprocessen. Efter uppvärmning i 4 timmar finns 41,6 procent av verbascoside kvar. Det indikerar att verbascoside är värmekänsligt [31]. Isoacteosid, tubulosid A och echinacoside i WEs förblev stabila efter komplexa bearbetningsprocedurer. Under den långvariga torkningsprocessen visade ackumuleringen av PhG en signifikant minskning, vilket kan tillskrivas den termiska nedbrytningen av dessa värmekänsliga komponenter [32]. När det gäller de andra målkomponenterna skilde sig HR och WE inte signifikant förutom för verbascoside. Vår förståelse för denna skillnad kommer att göra det möjligt för oss att utveckla bättre kvalitetsstandarder för växtbaserade drägg i framtiden och utveckla dem till produkter.

Tabell 1 Innehåll i 11 satser av C. tubulosa

Tabell 2 Jämförelse av innehållet i huvudkomponenter (n = 11).

,

Figur 4 Innehållsbestämning av fem komponenter från olika former (n = 11). , ns: ej signifikant.

3.1.4. Fingeravtryckslikhetsanalys

Likheterna mellan de tre C. tubulosa-grupperna utvärderades. Likhetsvärdena för örtmaterial-vattenextrakt, örtmaterial-örterester och vattenextrakt-örterester låg inom intervallen 0.943–0.994, 0.847–{ {9}}.995 respektive 0.938–1.000 (tabell 3).

Tabell 3 Likheter mellan HM-WE, HM-HR och WE-HR för 11 satser av C. tubulosa.

3.2. Resultat av antioxidantaktivitetstest

Antioxidantaktiviteterna för de olika formerna av C. tubulosa bestämdes med DPPH, , och renskapacitetsanalyser, och de relevanta resultaten presenteras i figur 5. I tabell S8 var intervallen för DPPH- och renskapacitetsanalysen { {2}}.04–37,80, 0,98–843,90 och 0,32–27,65 mg/ml för de tre olika formerna bland de 11 satserna av C. tubulosa. I tre antioxidantaktivitetstester uppvisade HMs och WEs nära hämningsaktivitet, medan HRs visade den svagaste hämningen.

De spraytorkade WE:erna visade sig uppvisa betydande aktiviteter även vid låga koncentrationer. En tidigare rapport indikerade att en spraytorkad Vernonia amygdalina WE uppnådde 50 procent rensande hämning vid 0,17 mg/ml [33]. Tillämpningen av långa extraktionstider och höga temperaturer är ett tveeggat svärd. Å ena sidan förbättrar en ökning av extraktionstiden och spraytorkningsinloppstemperaturen utbytet och effektiviteten. Dessutom uppnår extrakten stark antioxidantaktivitet och högre koncentrationer av biologiska komponenter än dessa växter [34]. Å andra sidan bryter alltför varm inloppsluft ned de bioaktiva föreningarna. Sådana förhöjda luftintagstemperaturer ledde till förluster av antioxidant Bidens pilosa-extraktaktivitet och tillskrevs minskningar av fenoliska föreningar [35]. Nuvarande resultat överensstämmer med den tidigare nämnda rapporten. Till exempel uppvisade WE i S6 svagare radikalhämmande förmågor än både HM och HR. Dessutom uppvisade HR i S5 starkare DPPH- och superoxidanjonfångande förmåga än HM och WE. Strukturen hos PhGs består av glykosidbindningar och acetylgrupper som lätt hydrolyseras under enzymatisk verkan eller sönderdelas vid höga temperaturer. Dessa reaktioner kan förklara minskningar av vissa huvudkomponenter under storskalig produktion. Emellertid kan hydrolysen eller isomeriseringen av vissa komponenter påskynda syntesen av andra komponenter. Sådana transformationer är vanliga vid bearbetning av Cistanches-örter [36–38]. Att PhG är vattenlösligt innebär att de flesta biologiska komponenter kan utnyttjas via vattenextraktion. Påståendet att majoriteten av de aktiva komponenterna finns kvar i WEs har hållits i årtionden, så det verkar rimligt att anta att de våta restmaterialen kan kasseras efter extraktion. Det är dock felaktigt att betrakta HRs av C. tubulosa som avfall. Forskare påpekar att PhG är instabila och att de är mottagliga för enzymatisk eller hydrolytisk nedbrytning [39]. Hydrolys- eller isomeriseringsreaktioner som bidrar till minskningar av biologiska ingredienser inom fytoläkemedel under bearbetning kan samtidigt ge nya möjligheter att utnyttja HR. Genom att konvertera traditionella extraktionsmetoder kan läkemedelsrester utvecklas och utnyttjas mer effektivt. Enzymatisk hydrolys utfördes för att omvandla Panax ginseng-rester till monosocker. Utbytet av polysackarider och ginsenosider ökade, såsom socker, bärnstenssyra, ginsengpolysackarider och ginsenosider [40]. Sophora flavescens-rester extraheras på nytt med ultraljudsvågor med etylacetat [41]. De uppdaterade teknikerna för att använda växtbaserade rester sammanfattas av Huang et al. [42].

Baserat på PLSR- och BCA-resultaten screenades de fem översta topparna av olika former med hjälp av DPPH-, superoxidanjon- och hydroxylradikal-rensande analyser för att identifiera de viktigaste topparna. Resultaten illustreras i Venn-diagrammet (Figur 7). A2, A6, A8 och A10 är de vanliga topparna som delas av HM, WE och HR (figur 7(a) och 7(c)) i superoxidanjon- och hydroxylradikal-fångningsanalyserna, medan HM, WE och HR delar inga DPPH-analystoppar. Samtidigt visar BCA-modellerna att A1, A2, A3 och A6 är de vanliga topparna som delas av HM, WE och HR (figur 7(d)–7(f)). Anmärkningsvärt är att överlappningarna i Venn-diagrammet indikerar att BCA-modellen verkar mer lämplig än PLSR-modellen, den förra uppvisar fler upprepningar. BCA-modellkoefficienterna och antioxidantförmågans IC50-värden analyserades via RDA. Som RDA som visas i figur 8 är A1, A3 och A6 från HM och HR positivt relaterade till antioxidantindexen, förutom att A3 är negativt relaterat till hydroxylradikalfångningskapaciteten. A1 och A6 från WE har starka korrelationer med DPPH och superoxidanjonen. A6-topparna noterade från de olika formerna uppvisar den starkaste kopplingen till DPPH, superoxidanjon och hydroxylradikaler. A1 och A3 uppvisar också en liknande koppling.

Figur 7

Venn-diagram av PLSR- och BCA-modell: (a) DPPH-analys. (b) rensningsanalys. (c) rensningsanalys analyserades med PLSR-modellen. (d) DPPH-analys. (e) rensningsanalys. (f) rensningsanalys analyserades med BCA-modellen. Den överlappande sektionen var de vanliga topparnas skärvor av HM, WE och HR.

3.4. Nätverksfarmakologibaserad analys

3.4.1. Konstruktion av CT-nätverk

Totalt 4359 mål relaterade till antioxidantaktiviteten erhölls från GeneCards-databasen och OMIM-databasen. Samtidigt screenades aktiva komponenter från TCMSP-databasen och SwissTargetPrediction-databasen. Sedan samlades 198 mål in och standardiserades genom UniPort-databasen. Det fanns 159 målgener som delades av aktiva komponenter och antioxidantrelaterade sjukdomar (se figur S1). CT-nätverket konstruerades för att illustrera korrelationen mellan föreningarna och nyckelgenmålen (Figur 9).

Figur 9 CT-nätverk. Nätverket visade korrelationen mellan aktiva komponenter och nyckelgenmålen.

3.4.2. Konstruktion av PPI-nätverket och screening av nyckelmål

PPI visualiserades med användning av STRING-databasen (Figur 10). Nätverket inkluderade 159 noder och 2528 kanter. I hela interaktionsnätverket kan de anslutande komponenterna eller noderna med fler målpunkter vara nyckelkomponenten eller målgenen som spelar en antioxidantroll i C. tubulosa. Resultaten laddades ner och introducerades i Cytoscape för visualisering. Ju högre DC-värde, desto mörkare färg, och ju högre kombinerat poängvärde, desto tjockare kant. Vi fann att RAC-alfa-serin/treonin-proteinkinas (AKT1), interlukin-6 (IL6), tumörnekrosfaktor (TNF) och vaskulär endotelial tillväxtfaktor A (VEGFA) var centralt belägna (Figur 11), vilket indikerar att de var nyckelmål när aktiva komponenter utövade en antioxidanteffekt. Det rapporteras att echinakosid minskar mitokondriell dysfunktion via reglering av mitogenaktiverade proteinkinaser (MAPK) och AKT och deras fosforylerade former [43]. Forskare spekulerade i att den antidiabetiska effekten av glykosider av C. tubulosa kan bero på antioxidantaktiviteten hos PhG genom att nedreglera proinflammatoriska cytokiner, såsom IL-6 och TNF- [44]. Dessutom kan echinakosid försämra tillväxten av äggstockscancerceller genom att nedreglera uttrycket av VEGFA för att hämma angiogenes [45], vilket är nära korrelerat till ROS-systemet för ROS inducerar uttrycket av VEGF-signalering [46].

Figur 10 PPI-nätverk.

3.4.3. Anrikningsanalys och CTP-nätverksetablering

De potentiella antioxidantföreningarna verkade på många biologiska funktioner, inklusive BP, CC och MF. I figur 12(a) visas de 10 översta vägarna. De förutsagda målen från PPI-nätverket svarade främst på många biologiska processer, såsom organiska cykliska föreningar, främlingsfientliga stimulanser, oorganiska ämnen, syrenivåer och positiv reglering av cellkomponenternas rörelse. Den cellulära komponentanalysen visade att generna huvudsakligen var relaterade till membranflotten, extracellulär matris, sekretorisk granullumen, transkriptionsregulatorkomplex och den apikala delen av cellen. Dessa mål är också involverade i många molekylära funktioner, inklusive DNA-bindande transkriptionsfaktorbindning, proteinhomodimeriseringsaktivitet, proteindomänspecifik bindning och cytokinreceptorbindning.

Figur 12 Anrikningsanalys: (a) GO-anrikningsanalys. (b) KEGG-anrikningsanalys.

För att undersöka de biologiska funktionerna hos dessa stora nav genomfördes en anrikningsanalys av vägar. Från KEGG-anrikningsresultat ritades ett bubbeldiagram för att visa de 20 bästa vägarna. Ju större fläcken var, desto fler gener inkluderades i vägen. Som visas i figur 12(b) var nyckelvägarna för C. tubulosa relaterade till vägar i cancer, lipid och ateroskleros, AGE-RAGE-signalväg vid diabetiska komplikationer, kemisk karcinogenes-receptoraktivering och MAPK-signalväg. Effekter av C. tubulosa på apoptos och cellulär redoxhomeostas undersöktes. Data tyder på att C. tubulosa kan vara en lovande kandidat för terapi mot tjocktarmscancer [47]. C. deserticola-extrakt finns hos äldre människor [48].

Figur 13 illustrerar korrelationen mellan vägarna och deras relaterade mål och förhållandet mellan de överlappande målgenerna och biologiskt aktiva komponenter av C. tubulosa. En global bild av CTP-nätverket skapades, som bestod av 12 ingredienser, 159 mål och 20 vägar. De flesta av målen delades av de aktiva kandidatföreningarna. Dessa aktiva kandidatingredienser med höga sammankopplingsgrader var ansvariga för den höga sammankopplingen av CTP-nätverket, särskilt quercetin (grad = 131). Majoriteten av målen, såsom AKT1, IL6, TNF och VEGFA, kartlades till KEGG-vägar associerade med vägar i cancer.

Figur 13 CTP-nätverk.

4. Sammanfattningar

I denna studie undersökte vi i första hand komplexa situationer när vi övervägde spektrum-effektsambanden mellan HM, WE och HR avC. tubulosa. HPLC-fingeravtrycken ochantioxidantanalyseranvändes för att identifiera skillnaderna mellan Hs, WEs och HRs ofC. tubulosa. Enligt HPLC-fingeravtrycken var 11 toppar vanliga bland de 11 satserna av Hs, WEs och HRs. Geniposidinsyra,echinakosid, verbascoside, tubulosid A, ochisoakteosididentifierades bland dessa toppar. Innehållet i dessa fem komponenter bestämdes. Dessutom har antioxidanteffekterna avC. tubulosaHs, WEs och HRs varierade på grund av förändringarna i de kemiska sammansättningarna orsakade av komplexa tillverkningsförhållanden. Baserat på diversifierade statistiska modeller, visade spektrum-effektsambandsstudien att topp A6 kan vara den mest avgörande komponenten bland de tre formerna avC. tubulosa. Studien baserades på nätverksfarmakologi för att utforska potentiella mekanismer förC. tubulosapåantioxidationgenom screening av föreningar, förutsägelse av nyckelmål, konstruktion av nätverk och genomförande av anrikningsanalys. Våra resultat ger en teoretisk grund för återvinning av växtbaserade rester och potentialen förC. tubulosavid behandling avantioxidantrelaterade sjukdomar.