Del ett Akteosid undertryckt Microglia M1-polarisering genom hämmad NF-KB-signalväg och AMPK-medierad mitokondrierfunktionsåterställning

för mer information:ali.ma@wecistanche.com

DEL 1 Hur ökar Cistanche Acteosider hjärncellernas vitalitet och lindrar Alzheimers sjukdom?

Klicka för att Cistanches produkter

Ying-Qi Li China Pharmaceutical University

Yi Chen China Pharmaceutical University

Si-Qi Jiang China Pharmaceutical University

Yuan-Yuan Shi Kina Pharmaceutical University

Xiao-Li Jiang China Pharmaceutical University

Shan-Shan Wu China Pharmaceutical University

Ping Zhou China Pharmaceutical University

Hui-Ying Wang China Pharmaceutical University

Ping Li China Pharmaceutical University

Sökord för forskning: akteosid, BV-2-celler, metabolism, RNA-seq, mitokondrier, neuroin§amation

Abstrakt

Bakgrund: Alzheimers sjukdom (AD) är den vanligaste typen av demens. Medanakteosid(ACT), en föreningisoleratfrånCistanche tubulosa, besitterneuroprotektiva egenskaper. Den underliggande mekanismen för att reglera mikrogliapolarisering förblir dock dåligt definierad. Metoder: Häri användes den AlCl3-inducerade AD-modellen i zebra¦shlarver för att avslöja den terapeutiska effekten av ACT. BV-2-celler användes för att demonstrera rollen av ACT på mikrogliapolarisering. RNA-sekvens, HPLC-Q-TOF-MS, western blot och molekylär dockning kombinerades för att bekräfta dess mekanism.

Resultat: ACT förbättrade signifikant den experimentella dyskinesien och störningar i nervsystemet hos zebra. Därefter undertryckte det M1-polarisering och främjade M2-fenotypen i LPS-inducerade BV-2-celler. Vi visade först att ACT utövade en djupgående transkriptomisk inverkan, som involverade reglering av viktiga signalvägar i in§amation, argininbiosyntes, såväl som pantotenat- och CoA-biosyntes, som korrelerade med mitokondriernas funktion. ACT-behandling minskade mikroglia M1-polarisering genom att hämma NF-KB-signalvägen. Och de metaboliska vägarna bekräftades ytterligare av HPLC-Q-TOF-MS. Dessutom korrigerade ACT överdriven ROS för att återställa mitokondriernas funktion genom AMPK-medierad PGC-1 och UCP-2 uppreglering, i överensstämmelse med metabola förändringar. Spännande nog kan ACT binda direkt till både NF-KB och AMPK, vilket framgår av molekylär dockning. Slutsatser: Forskningen gav en infusionsmekanism för ACT och illustrerade ett nytt perspektiv baserat på mitokondriell dysfunktion för att avslöja sambandet mellan metabolism och mikrogliapolarisering.

Bakgrund

Alzheimers sjukdom (AD) är en vanlig neurodegenerativ sjukdom som åtföljs av kognitiv funktionsnedsättning och dyskinesi[1]. Det kännetecknas av allvarlig neuronal förlust, senila plack och neuro-brillära trassel[2]. Patogenesen av AD är multidimensionell och kopplad till neuroin§amation. Neuroin§amation drivs av aktivering av gliaceller, nära relaterad till utvecklingen av AD[3, 4]. Under progressionen och exacerbationen av neuroin§amation anses mikroglia vara nyckelfaktorn. Microglia är de primära immuncellerna i det centrala nervsystemet. Det är nära förknippat med en kaskad av processer, som innehåller hjärnans utveckling, upprätthåller en neutral miljö, samt svarar på skador och reparationer[1]. Dessutom kan mikroglia stimuleras till en M1-fenotyp och uttrycket av pro-in§ammatoriska cytokiner ökar när neuroin§amationsrelaterade sjukdomar som AD inträffade[5]. Studier visar också att polariseringen till M1-fenotypen ofta åtföljs av metabola störningar[6], vilket orsakar obalans i energimetabolismen och mitokondriell dysfunktion[7]. Dessa negativa förändringar härrör från neurodegeneration, till och med AD.

Akteosid(ACT), en fenyletanoidglykosid, härrör främst frånCistanchetubulosa. Allt fler bevis har antytt detSPELA TEATERinnehade många farmakologiskaaktiviteter, inklusive neuroprotektiva[8], anti-in§ammatoriska[9] och antioxidanteffekter[10]. Speciellt har ACT rapporterats förbättra inlärnings- och minnesförsämring samt uppreglera energimetabolismen hos streptozotocininducerade råttor [11]. Det har också föreslagits att hämma neuronal apoptotisk celldöd och mitokondriell skada i de experimentella autoimmuna encefalomyelitmössen [12]. Men färre studier har fokuserats på effekten av ACT på mikroglia M1/M2-polarisering. Speciellt olika mekanismer, såsom reparation av mitokondriernas funktion och reglering av cellmetabolism, har inte utförts. Dessutom mekanismen förSPELA TEATERbidrog till mikroglia M1/M2-polarisering har förblivit outforskad. Denna rapport syftade till att undersöka den terapeutiska effekten av ACT samt den underliggande molekylära mekanismen förSPELA TEATERiAD. Häri,SPELA TEATERvisade en signifikant neuroprotektionseffekt i AlCl3-inducerade AD-zebrafisklarver. Dessutom hämmade ACT effektivt M1-polarisering och främjade M2-fenotypen i LPS-inducerade BV-2-celler. RNA-Sequencing (RNA-Seq) integrerad med metabolomics metod för att bättre förstå den underliggande mekanismen för ACT för att reglera mikroglia polarisation. Överhörningen mellan metabolism och mikrogliapolarisering i termer av mitokondriell funktion undersöktes. Denna studie kommer att ge ny respekt för den fortsatta undersökningen av ACT som ett potentiellt terapeutiskt medel för behandling av AD.

Metoder

Djur och modellgruppering

Vildtypszebra¦sh (AB-stam, 4 månader gammal) valdes i denna studie (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). De hölls under en 14/10 timme ljus/mörkercykel vid 28 grader, enligt den tidigare metoden[13]. Naturligt gödningsmedel och normalt utvecklade embryon genererades och odlades till 3 dagar efter befruktning (pdf) i en belysningsinkubator. Alla zebrafiskexperiment utfördes under överinseende av Animal Ethics Committee of China Pharmaceutical University. Zebrafisklarver delades in i sex grupper och behandlades från 3 pdf till 7 pdf: kontrollgrupp, modellgrupp, modell plus donepezilhydroklorid (DPZ) grupp, modell plus ACT-grupper. Kontrollgruppen hölls i mediet med 0,2 procent DMSO och modellgruppen behandlades med 150 μM AlCl3 (pH 5,8). Modellen plus DPZ-gruppen sambehandlades med AlCl3 och 8 μM DPZ. Modellen plus ACT-grupper sambehandlades med AlCl3 och olika koncentrationer av ACT (200, 100, 50 μM). ACT (HPLC renhet större än eller lika med 98 procent) erhölls från Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, Kina). AlCl3·6H2O och DPZ köptes från Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., LTD. (Shanghai, Kina).

Beteendeanalys Sida 3/34 Zebrafisklarvers rörelser registrerades med en ViewPoint beteendeanalysator (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) vid 28 grader. Kortfattat, beteendeparametrarna och resultatbearbetningen överensstämde med den metod vi etablerade tidigare[13]. Här valdes medelhastighet (AS), hastighetsförändring (ΔS), återhämtningshastighet för dyskinesi (DRR) och svarseffektivitet (RE, procent) för att utvärdera återhämtning av dyskinesi hos zebrafisk.

Bestämning av acetylkolinesteras (AChE) och kolinacetyltransferas (ChAT) aktivitet

Efter behandling från 3 pdf till 7 pdf samlades zebrafisklarver för att mäta AChE- och ChAT-aktivitet.

Baserat på tillverkarens protokoll detekterades aktiviteten av de enzymkopplade immunosorbentanalyssatserna (ELISA) (MLBIO biotechnology Co. Ltd., Shanghai, Kina). Och proteinkoncentrationerna i olika prover bestämdes med BCA-metoden

Cellkulturer och behandlingar

BV-2-cellinje (odödlig murin mikrogliacellinje) köptes från American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). De odlades i DMEM (KeyGen Biotech Co., Ltd, Nanjing, Kina). Mediet kompletterades med 10 procent FBS (Gibco, Grand Island, NY, USA), 100 U/ml penicillin, samt 100 mg/ml streptomycin, med 95 procent luft/5 procent CO2 vid 37 grader. BV-2-celler inkuberades med ACT (50, 25, 12,5 μM) eller stimulerades med Lipopolysackaride (LPS, 1 ug/ml; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) i 24 timmar. Slutligen samlades alla celler eller supernatanten upp för de olika analyserna.

Cellviabilitetsanalys

Cell Counting Kit-8 (CCK-8)-analys (JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kina) användes för att utvärdera livsdugligheten hos BV-2-celler. Cellerna såddes i en 96-brunnsplatta (1×104 celler/brunn, Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.). Kortfattat togs mediet bort i slutet av behandlingen och 100 μL serumfritt medium innehållande CCK-8-lösning sattes till varje brunn under 2 timmar vid 37 grader. Absorbansen mättes vid 450 nm med en mikroplattläsare (Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA). Cellviabilitet uttrycks som en procentandel av kontrollgruppen. Experimentet upprepades tre gånger.

Kväveoxid (NO) produktionsanalys

NO bestämdes genom att mäta nitritnivåer i BV-2-kultursupernatanten med Griess-reagens. Kort sagt, i slutet av behandlingen överfördes mediet (100 μL) till en ny 96-brunnsplatta. Samma volym Griess-reagens sattes till varje brunn och reagerade i 15 minuter i mörker. Absorptionen vid 540 nm bestämdes med en mikroplattläsare.

Inflammatoriska cytokinnivåer i supernatanten

Koncentrationerna av TNF-, IL-1 och IL-10 i BV-2-cellsupernatant bestämdes med ELISA-kit enligt tillverkarens instruktioner (MLBIO biotechnology Co. Ltd., Shanghai, Kina ).

Observation av cellulär morfologi

För att bestämma effekten av ACT på BV-2-cellens M1/M2-polarisation pläterades cellerna i en 6-brunnsskål och observerades under det inverterade mikroskopet (Nikon ECLIPSE Ti2, Japan).

Cellulär metabolism bestämning genom HPLC-Q-TOF-MS-analys

BV{{0}}-celler såddes i en 6-brunnsskål separat (n=6/grupp). Efter behandling avlägsnades mediet och cellerna tvättades tre gånger med kall PBS. Sedan omedelbart utsatt för flytande kväve för att undertrycka cellernas ämnesomsättning. Cellerna skördades med kall 80 procent metanol (1 ml/brunn) och suspensionen överfördes till ett 2 ml Eppendorf-rör. För att underlätta proteinutfällning, virvlade kraftigt i 1 min och centrifugerades vid 13, 000 rpm i 15 minuter vid 4 grader. Cellsuspensionen överfördes till ett nytt 2 mL Eppendorf-rör och torkades under en ström av kväve och lagrades vid -80 grad fram till analys. Den torkade återstoden rekonstituerades i 15 {{40}} μL förkyld 25 procent acetonitril. För att säkerställa stabiliteten och noggrannheten i sekvensanalysen kombinerades lika volymer (10 μL) av varje cellprov som kvalitetskontrollprover (QC). Under metabolitdetektion injicerades dessa prover efter var sjätte cellprov för att bekräfta deras stabilitet. En 1 μL alikvot injicerades för HPLC-Q-TOF-MS. HPLC-Q-TOF-MS-analys utfördes på Agilent 1290 HPLC-system kopplat till Agilent 6530 Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) masspektrometer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Separationen utfördes på en ACQUITY UPLC BEH C18-kolonn (2,1×100 mm, 1,7 μm). Den mobila fasen bestod av 0,1 procent myrsyra-vatten (v/v; A) och acetonitril (B). §ow-hastigheten sattes till 0,4 ml/min med följande optimala gradientelueringsvillkor: 0 till 2 min, 5 procent B; 2 till 20 min, 5 procent till 95 procent B (positivt jonläge); O till 2 min, 5 procent B; 2 till 20 min, 5 procent till 95 procent B (negativ jonläge). Masspektrometerns driftsparametrar ställdes in enligt följande: gastemperatur, 320 grader; torkgas, 10 l/min; nebulisator, 35 psi; VCap, 4000 V; fragment, 120 V. Rådata kördes under MassHunter Workstation Software version B.07.00 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Rådata förbehandlades av XCMS-plattformen. Huvudkomponentanalys (PCA) och partiell minsta kvadraters diskriminantanalys (PLS-DA) av normaliserade data utfördes med MetaboAnalyst (https://www.metaboanalyst.ca). I kombination med litteratur identifierades de differentiella metaboliterna (VIP > 1, T-test P < 0,05)="" på="" hmdb="" (https://hmdb.ca).="" slutligen="" genomfördes="" väganalys="" med="">

Mätning av mitokondriell membranpotential (MMP)

MMP upptäcktes med §uorescerande sond JC-1 (Beyotime, Kina) i enlighet med tillverkarens instruktioner. Kortfattat sköljdes celler från olika grupper med PBS och inkuberades med JC-1-färgningslösning i 20 minuter vid 37 grader. Efter färgning tvättades cellerna två gånger med användning av färgningsbuffert. Sedan detekterades fluorescerande signaler med flödescytometri (BD Accuri C6).

Mätning av mitokondriellt adenosin 5'-trifosfat (ATP)

ATP-koncentration i mitokondrier detekterades av ett ATP-analyskit (Beyotime, Kina) i enlighet med tillverkarens instruktioner. Kortfattat kasserades odlingsmediet av BV-2-celler från olika grupper och cellerna homogeniserades med lysbuffert på is. Supernatanten som erhölls efter centrifugering (12, 000 g, 5 min) användes för att bestämma ATP-koncentrationen. Luminescensen (luciferaskatalyserad §uoresceinreaktion) detekterades av EnVision Multimode Microplate Reader (PerkinElmer).

Mätning av nivån av intracellulära reaktiva syreämnen (ROS).

ROS Assay Kit (Beyotime, Kina) användes för att mäta ROS-nivån. Cellerna från olika grupper inkuberades med DCFH-DA (10 μM) i 20 minuter vid 37 grader. Efter laddning av sond tvättades cellerna tre gånger med DMEM. Sedan detekterades §uorescerande signaler med flödescytometri (BD Accuri C6)

Transmissionselektronmikroskopi (TEM)

BV-2-celler såddes i en 6-brunnsskål. Mediet avlägsnades och 1 ml 2,5 procent glutaraldehyd tillsattes snabbt till varje brunn. Därefter överfördes cellerna till ett 1,5 ml Eppendorf-rör och centrifugerades vid 1000 rpm under 3 min. Cellerna fixerades över natten med ny 2,5 procent glutaraldehyd vid 4 grader. Efter ¦xation, uttorkning och inbäddning observerades cellerna med ett HT7800 transmissionselektronmikroskop (Hitachi, Tokyo, Japan).

RNA-seq och bioinformatisk dataanalys

Totalt RNA från BV-2-celler (n=3/grupp) extraherades med Trizol-reagens (Vazyme Biotech, Kina) enligt reagenstillverkarens instruktioner. Alla analytiska prover skickades till Majorbio (Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd.) för att utföra RNA-sekvensanalysen. Data analyserades på den kostnadsfria onlineplattformen Majorbio Cloud Platform. Parametrarna för den differentiella uttrycksanalysen varP-adjust < 0.05 och |log2FC|Större än eller lika med1. De ursprungliga sekvensdata har skickats till databasen för NCBI Sequence Read Archive (SRA).

Kvantitativ realtidspolymeraskedjereaktion (qRT-PCR)

Det totala RNA:t av BV-2-celler i varje grupp skördades med ett 500 μL RNA-easyTM Isolation Reagent (Vazyme Biotech, Kina), och en omvänd transkriptionsreaktion utfördes med FastKing-RT SuperMix (TIANGEN Biotech, Kina) . Reaktioner utfördes enligt tillverkarens protokoll. cDNA utsattes för qRT-PCR-analyser med specifika primrar och TransStart TOP Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech, Kina). Primerna är listade i tabell S1 (se ytterligare fil 1) och -aktin användes som intern kontroll. 2-ΔΔCT-metoden användes för kvantitativ analys.

Western blot-analys

BV-2-celler lyserades med RIPA-lysbuffert (KeyGen Biotech Co., Ltd, Nanjing, Kina) innehållande 1 procent Proteashämmare Cocktail (Thermo Fisher) för att erhålla totalt protein. En 10-procentig SDS-PAGE utfördes för att separera proteinerna, som överfördes till NC-membran. Efter blockering med 5 procent skummjölk/BSA i 2 timmar, inkuberades membranen med AMPK (Proteintech), p-AMPK (A¨nity Biosciences), PGC-1 (Proteintech), NF-KB (Proteintech), p-NF-KB (ABclonal), eller GAPDH (ABclonal) antikroppar i 5 procent TBST vid 4 grader över natten. Membranen inkuberades med en sekundär pepparrotsperoxidaskonjugerad antikropp (ABclonal) under 1 timme vid rumstemperatur. High-sig ECL western blotting-substratet (Tanon, Kina), gelbildsystemet (Tanon, Kina) och ImageJ-mjukvaran användes för visualisering och kvantifiering.

Molekylär dockning

Molekylära dockningsanalyser utfördes med hjälp av Autodock-mjukvaran (version 4.2). Affiniteten mellan ACT och proteiner observerades av AutodockTools programvara. De tredimensionella (3D) proteinstrukturerna för AMPK (PDB ID: 5g5j) och NF-KB (PDB ID: 4q3j) hämtades från Protein Data Bank

Statistisk analys

Alla data uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse (SD). Skillnaderna mellan de olika grupperna analyserades genom envägsvariansanalys (ANOVA), följt av Tukeys multipel.

Resultat

ACT lindrade dyskinesi och förbättrade det kolinerga systemets funktion i zebrafisklarver

AlCl3-inducerad AD-modell i zebrafisklarver användes för att demonstrera effekten av ACT på AD. För det första observerades zebrafisklarvernas rörelse inom ljus/mörker-cykler och deras simstigar registrerades (Fig. 1a, 1b). AS och ΔS för zebrafiskrörelse inducerad av AlCl3 under motsvarande tid efter administrering beräknades. Resultaten visade att olika doser av ACT effektivt ökade AS och ΔS för zebrafisk (Fig. 1c). DRR och RE avslöjade en mer intuitiv jämförelse av ACT och DPZ (Fig. Id). Följaktligen lindrade ACT dyskinesi och uppvisade liknande effekter som DPZ. Det är allmänt överens om att det kolinerga systemet spelar en viktig roll i inlärnings- och minnesprocesser. Således användes aktiviteterna av AChE och ChAT för att avslöja effekten av ACT. AlCl3-exponering i zebrafisk med kolinerg förändring i hjärnan (Fig. 1e). Det var enastående att ACT-behandling undertryckte aktiviteten av AChE. Dessutom uppvisade aktiviteten av ChAT en minskning efter ACT-behandling. I korthet visade ACT en djupgående inverkan på det kolinerga systemets funktion i AlCl3-inducerade AD zebrafisklarver.

ACT undertryckte M1-polarisering och främjade M2-polarisering i LPS-inducerade BV-2-celler

Effekterna av ACT på mikrogliapolarisering studeradesin vitromed BV-2 mikrogliaceller. LPS minskade avsevärt BV-2 cellviabiliteten efter att ha behandlats 24 timmar. Lyckligtvis ökade ACT cellviabiliteten för LPS-inducerade BV-2-celler (Fig. 2a). Dessutom observerades morfologin för BV-2-celler. Efter 24 timmars LPS-stimulering visade det att BV-2-celler genomgick ett M1-polarisationstillstånd. Och de morfologiska förändringarna förhindrades genom ACT-sambehandling (Fig. 2b). Dessutom visade resultaten att till skillnad från BV-2-celler stimulerade av LPS, visade BV-2-celler sambehandlade med ACT signifikant undertryckt TNF- (Fig. 2c), IL-1 ( Fig. 2d), och NO (Fig. 2f) uttryck i cellsupernatant. Dessa är klassiska pro-in§ammatoriska cytokiner som indikatorer på M1 mikroglia polarisering. I likhet med resultaten av ELISA upptäckte resultaten av qPCR att uttrycken TNF-, kväveoxidsyntas (iNOS), IL-1 och CD86 mRNA var signifikantakan inte hämmas av ACT-behandling jämfört med LPS-gruppen (Fig. 3a). Vidare mätte vi M2 mikroglia polarisationsnivåer med ELISA (Fig. 2e) och qPCR (Fig. 3b), vars resultat indikerade att ACT signifikant ökade M2 ​​mikroglia-relaterade marköruttrycksnivåer (IL-10, CD206 , TGF- och Arg-1). Sammantaget visade dessa resultat att ACT undertryckte M1 mikroglia-polarisering och främjade M2-fenotypen.

ACT reglerade M1/M2-polarisering via hämning av NF-KB-signalvägen i LPS-inducerade BV-2-celler

Den transkriptomiska analysen utfördes av RNA-seq för att förstå mekanismen för ACT i BV-2-celler från en övergripande nivå. PCA illustrerade att kontroll-, LPS- och ACT-grupperna kunde särskiljas väl (Fig. 4a). Den avslöjade 899 differentiellt uttryckta gener (DEG) mellan kontrollgruppen och LPS-gruppen, medan 49 grader var mellan LPS-gruppen och ACT-gruppen (Fig. 4b). Genomgående, Gene Ontology (GO) anrikningsanalys (Fig. 4c) och Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) anrikningsanalys (Fig. 4d) avslöjade att effekten av ACT var involverad i NF-KB-signalvägen. Uppsättningen gener associerade med NF-KB-signalvägen bekräftades ytterligare och deras homeostas påverkades säkert av LPS. Som väntat påverkade ACT signifikant deras uttryck (fig. 4e). En NF-KB-signalväg är en klassisk väg för att reglera progressionen av in§amation, vilket slutligen resulterar i frisättning av pro-in§ammatoriska faktorer. För att få mekanistiskt stöd utvärderades ett nyckelprotein i NF-KB-signalvägen genom western blot-analys. LPS-stimulering ledde till aktivering av NF-KB, associerad med att främja M1-polarisering. I enlighet med RNA-seq-analys inhiberade ACT LPS-stimulerad NF-KB-fosforylering (Fig. 4f). Därför lindrade ACT den LPS-inducerade M1-polariseringen via NF-KB-signalvägen i BV-2-celler.

ACT försämrade argininbiosyntesen samt pantotenat- och CoA-biosyntesen i LPS-inducerade BV-2-celler

RNA-seq visade att de vägar som påverkades av ACT också inkluderade biosyntes av arginin (Arg) såväl som pantotenat- och CoA-biosyntes (Fig. 4d). Och det har föreslagits att LPS-stimulering orsakar BV-2-cellers metabolismstörningar associerade med M1-polarisering[14]. Således användes en oriktad cellmetabolom av HPLC-Q-TOF-MS för att identifiera effekten av ACT på cellmetabolism. PCA (fig. 5a) och PLS-DA (fig. 5b) visade att kontroll-, LPS- och ACT-grupperna kunde särskiljas väl baserat på intracellulära metaboliter. Nivåerna av olika metaboliter i LPS-inducerade BV-2-celler ändrades efter ACT-behandling (Fig. 5c). Jämfört med kontrollgruppen var det 11 metaboliter förändrade signifikant i LPS-gruppen (tabell S2, se ytterligare ¦le 2). Medan 14 metaboliter tydligt förändrades efter behandling av ACT (Tabell S3, se ytterligare avsnitt 3), som involverade 11 metaboliska vägar (Fig. 5d). Effekten av ACT bestod huvudsakligen av att reglera aminosyrametabolismen (biosyntes av fenylalanin, tyrosin och tryptofan, metabolism av D-glutamin och D-glutamat, biosyntes av Arg, metabolism av fenylalanin), nukleotidmetabolism (purinmetabolism, pyrimidinmetabolism), energimetabolism (nitrogenmetabolism). metabolism), såväl som metabolismen av kofaktorer och vitaminer (pantotenat- och CoA-biosyntes). Intressant nog överensstämde de metaboliska vägarna som erhölls av metabolom med RNA-seq, inklusive Arg-biosyntes såväl som pantotenat- och CoA-biosyntes. Ovanstående visade att ACT kunde reglera Arg-biosyntes såväl som pantotenat- och CoA-biosyntes i LPS-stimulerade BV-2-celler.

Act Mitigated Lps-induced Bv-2 Mitokondriell dysfunktion

Mitokondrier är kärnan i metabola vägar. Bevis utvecklas för att mitokondrier är nyckelspelare i mikroglial M1/M2-polarisering. Tidigare forskning har visat att LPS kan orsaka mitokondriell dysfunktion. En översikt över mitokondriernas status i morfologi och cellfördelning bedömdes av TEM. Efter LPS-stimulering visade BV-2-celler kärnkromatinkondensation, minskad cytoplasma, såväl som färre mitokondrier (Fig. 6a). Dessutom var LPS-gruppens mitokondriella cristae disarrangerade eller till och med försvann, vilket uppvisade partiell kristolys, minskad storlek och rundformad morfologi. Intressant nog kan ACT-behandling lindra LPS-inducerade morfologiska förändringar i mitokondrier. Efter tur undersökte vi mitokondriefunktionen hos LPS-behandlade BV-2-celler, inklusive MMP, och mitokondriell ATP-produktion. MMP (fig. 6b, 6c) och ATP-produktion i mitokondrier (fig. 6d) förbättrades signifikant i celler behandlade med ACT jämfört med de i LPS-gruppen. Mitokondriell dysfunktion kan vara relaterad till den ökade nivån av ROS i cellen. Flödescytometrianalys visade att innehållet i ROS var överbelastat i LPS-gruppen (Fig. 6e, 6f). Lyckligtvis eliminerade ACT överdriven ROS. Det tyder på att ACT kan återställa mitokondriernas funktion genom att rensa ROS.

ACT återställde mitokondriernas funktion genom uppreglering av PGC-1 och UCP-2

Peroxisomproliferativ aktiverad receptor-co-activator-1 (PGC-1) spelar en viktig roll i mitokondriell biogenes[15]. Stimuleringen av LPS minskade uttrycket av PGC-1, vilket visade mitokondrierdysfunktion. Anmärkningsvärt nog reverserades PGC-1-genens mRNA och proteinuttryck signifikant genom ACT-behandling i LPS-behandlade BV-2-celler (Fig. 7a). Det mitokondriella frånkopplingsproteinet-2 (UCP-2) var också känt för att reglera mitokondriella funktioner. Som ett nedströms protein av PGC-1 kan det kontrollera LPS-inducerad MMP-depolarisering och ROS-produktion. Nya rapporter indikerar att det är centralt i processen för mikroglialaktivering, med motsatt reglering av M1- och M2-polarisering[16]. Western blot-resultat visade att UCP-2-proteinnivån minskade efter LPS-stimulering. Samtidig behandling av LPS och ACT kan uppreglera uttrycket av UCP-2 jämfört med LPS-behandlingen. mRNA-expressionsnivån för UCP-2 visade också liknande förändringar (Fig. 7b). Sammantaget återställde ACT mitokondriernas funktion genom uppreglering av PGC-1 och UCP-2.

ACT undertryckte mikroglia M1-polarisering genom återhämtning av mitokondriell funktion via AMPK-aktivering

AMP-aktiverat proteinkinas (AMPK), som den centrala cellulära energisensorn, spelar en viktig roll för att upprätthålla balansen i cellernas metabolism. Samtidigt är PGC-1 ett nedströmsprotein av AMPK. Resultaten avslöjade att LPS hämmade aktiveringen av AMPK, vilket resulterade i cellmetabolismstörningar och mitokondriell dysfunktion. Det är anmärkningsvärt att ACT kan dosberoende öka proteinuttrycket av p-AMPK (Fig. 8a). Det föreslås att ACT kan öka uttrycket av PGC-1 och återställa mitokondriell funktion genom att aktivera AMPK-signalvägen. I denna studie, för att undersöka om aktiveringen av AMPK bidrog till regleringseffekten av ACT på M1/M2-polarisering, användes förening C (CC) för att hämma effekten av AMPK. I motsats till den nedreglerade NO-nivån i ACT-behandlingsgruppen blockerade CC delvis effekten av ACT på NO-nivån (Fig. 8d). Baserat på dessa resultat kan ACT reglera M1/M2-polarisering av BV-2-celler genom aktivering av AMPK.

ACT binder till och hämmar NF-KB såväl som aktiverad AMPK

Molekylär dockning tillämpades för att bekräfta om ACT binder till NF-KB- och AMPK-proteinerna. Fynden visade att bindningsenergin för ACT och NF-KB var -8,4 kcal/mol, vilken av ACT och AMPK var -10,8 kcal/mol. Betydande a¨niteter verifierade att ACT är direkt bundet till NF-KB och AMPK (Fig. 9). Därefter undersöktes de möjliga bindningssätten och interaktionerna i aminosyrafickan ytterligare, inklusive Phe A146, Pro A147, Asn A240, Leu A236, Arg A232, His A183, Arg A239, Glu A179, Cys A149 och Tyr A227 av NF -KB (Fig. 9c) såväl som Phe A213, Gly A481, Ala A370, Leu A482, Arg A212, Ile A369, Arg A106, Phe A215, Phe A108, Thr A309, Ser A119 och Thr A2Fig4 9f). Dessa resultat indikerade att ACT direkt kan påverka NF-KB och AMPK för att dämpa BV-2 mikroglia M1-polarisering och främja M2-fenotypen.