En effektiv metod för att behandla njurfibros
Mar 17, 2022
för mer information:ali.ma@wecistanche.com
Del Ⅰ: Endoplasmatiskt retikulumprotein TXNDC5 främjar njurfibros genom att förstärka TGF-signalering i njurfibroblaster
Yen-Ting Chen, Pei-Yu Jhao & et al.
Introduktion
Njurfibros, kännetecknad av tubulointerstitiellfibrosoch glomerulär skleros, är en vanlig patologisk manifestation av de flesta, om inte alla, typer avkronisknjuresjukdomar(CKD)(1). Utvecklingen avnjur-fibroshos patienter med CKD leder till en gradvis förlust avnjurefungera, vilket kan i slutändan resultera i njursjukdom i slutstadiet (ESRD) som kräver dialys ellernjuretransplantation (2). Medan flera molekylära determinanter och vägar har visat sig bidra till processen förnjurfibros, anses transformerande tillväxtfaktor-beta (TGF-) allmänt vara huvudregulatorn för njurfibrogenes (3). Efter en skada pånjure, skadade tubulära epitelceller (TEC) stoppas i G2/M-fasen och utsöndrar stora mängder TGF-, vilket utlöser aktiveringen och transformationen av intilliggande njurfibroblaster till myofibroblaster (4-6). Aktiverade myofibroblaster, som kännetecknas av uttrycket av a-slätmuskelaktin (en SMA), är mycket proliferativa och producerar extracellulära matriser (ECM)proteiner som fibrillärt kollagen, elastin, fibronektin och CCN2 (allmänt känd som bindvävstillväxtfaktor, CTGF)(7,8). Under de tidiga stadierna av njurskada,fibrosinitierades som ett adaptivt och självbegränsat fysiologiskt svar som hjälper till att reparera vävnad och bibehålla strukturell integritet(9). Efter kronisk, upprepad njurskada kvarstår emellertid aktiveringen och proliferationen av myofibroblaster, vilket resulterar i överdriven ECM-produktion och ackumulering, vilket leder till förlust av funktionellt njurparenkym och i slutändan njursvikt (1O,11).
Klicka för att Cistanche para que sirve för njursjukdom
Trots framstegen inom modern medicin har få kliniska terapier visat sig vara effektiva motnjurfibros. Angiotensinomvandlande enzymhämmare (ACEI) och angiotensinreceptorblockerare (ARB) har till exempel visat sig minska proteinuri, lindranjur-fibros, och bromsa utvecklingen av CKD (12,13). Pentoxifyllin, en ospecifik fosfodiesterashämmare, har å andra sidan visat sig hämma TGF- 1-inducerat ECM- och CCN2-uttryck, vilket leder till attenuerad tubulointerstitiellfibros(14). Användningen av ACEI och ARB begränsas dock av deras hypotensiva effekter och potentiella negativa effekter som hyperkalemi. Dessutom kunde varken ACEls/ARBs eller pentoxifyllinbehandling stoppa utvecklingen avnjur-fibrosoch CKD(15,16). Det är därför absolut nödvändigt att identifiera nya mediatorer eller vägar som är avgörande för patogenesen avnjur-fibrosatt utveckla effektiva terapier mot CKD(kroniska njursjukdomar).
Nyligen identifierade vi tioredoxindomän innehållande 5 (TXNDC5), ett ER-bosatt, fibroblastberikat protein med enzymaktiviteten hos ett proteindisulfide-isomeras (PDI), som en kritisk mediator för hjärtfibros(17). Vi visade att överdriven TXNDC5 främjar utvecklingen av hjärtfibrosgenom redoxberoende hjärtfibroblastaktivering och ECM-produktion. Genetisk deletion av Txndc5 förbättrar hjärtatfibrosoch kontraktil dysfunktion inducerad av agonist hos möss (17). Baserat på den observerade väsentliga rollen av TXNDC5 i myokardfibrogenes, antog vi att TXNDC5 också kunde bidra kritiskt till utvecklingen av vävnadfibrosi icke-hjärtorgan, särskiltnjurfibros.
I den aktuella studien visade vi att TXNDC5 var starkt uppreglerad i fibrotiska njurar från både människa och mus, särskilt i de kollagenutsöndrande njurfibroblasterna. Global radering av Txndc5 försvagade markant omfattningen avnjur-fibrosi flera musmodeller av njurskada. Mekanistiskt visade vi att överdriven TXNDC5, inducerad av TGF- 1 via ATF6-beroende ER-stressväg, ökarnjur-fibrosgenom att främja fibroblastaktivering/proliferation och ECM-produktion genom posttranslationell stabilisering och uppreglering av TGF-receptor typ I(TGFBR1). Viktigt är att vi visade att inducering av fibroblastspecifik deletion av Txndc5 effektivt förbättrade utvecklingen och progressionen avnjurfibrosinducerad av olika typer av skador hos möss, vilket tyder på att inriktning på TXNDC5 kan vara en ny och kraftfull metod för att behandlanjur-fibrosoch bevaranjurefungera.
Figur 1. TXNDC5 var signifikant uppreglerad i musfibrotiska njurar och njurprover från patienter med kronisk nycknesjukdom( kroniska njursjukdomar).
(A) IHC-färgning (n=3) och (B) immunoblots (n=6) visade att proteinuttryck av TXNDC5 var uppreglerat i musfibrotiska njurar inducerade av UUO eller uIRI, jämfört med kontralaterala njurar (CL) . Skalstång: 50 μm.
(C) Kvantitativ RT-PCR visade att Txndc5-transkriptet var uppreglerat i musfibrotiska njurar inducerade av UUO och uIRI (n=4-7).
(D) Omanalyser av mikroarraydata på humana njurprover från patienter med CKD (GSE66494) visade att TXNDC5, COL3A1 och FN1 var signifikant uppreglerade i njurvävnaden från CKD-patienter (frisk kontroll n=8, CKD n {{ 6}}). För A–C är data representativa för 3 eller fler oberoende experimentella replikat.
För alla paneler presenteras data som medelvärde ± SEM. *P < {{0}}.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" med="" 2-sidigt="" t-test="" (a–c)="" eller="" mann-="" whitney="" test="">
Resultat
TXNDC5 var signifikant uppreglerad i fibrotiska njurar från människa och mus. För att undersöka den potentiella inblandningen av TXNDC5 i patogenesen avnjurfibros, bestämde vi först dess proteinuttrycksnivåer i fibrotiska musnjurvävnader inducerade av unilateral ureteral obstruktion (UUO), unilateral ischemi-reperfusionsskada (uIRI) eller genom administrering av folsyra (FA). Immunhistokemistudier avslöjade markanta ökningar i intensiteten av TXNDC5-färgning i njursektionerna från alla tre musmodellerna avnjur-fibros(Figur 1A och tilläggsbild 1A; kompletterande material tillgängligt online med denna artikel; https://doi.org/10.1172/JCI143645DS1). Immunoblotting och kvantitativ omvänd transkriptions-PCR (RT-PCR) visade också signifikant uppreglering av proteinet (Figur 1B) och transkript (Figur 1C och Kompletterande Figur 1B) expressionsnivåer av TXNDC5 i fibrotiska musnjurar. I enlighet med dessa resultat visade omanalys av mikroarraydata erhållna från njurbiopsiprover från patienter med CKD(GSE66494)(18) att expressionsnivåerna av TXNDC5 (med 2,24 gånger, P<0.001), as="" well="" as="" of="" markers="" for="">njurfibrossåsom COL3A1 och FN, ökade också signifikant i njurproverna från patienter med CKD jämfört med de från friska kontroller (Figur 1D och Kompletterande Figur 1C). Sammantaget antyder den observerade uppregleringen av TXNDC5/Txndc5-uttryck i fibrotiska mänskliga/musnjurar och dess positiva korrelation med fibrogena ECM-proteingener en potentiell roll för TXNDC5 i patogenesen avnjurfibros.
Figur 2. TXNDC5 var starkt uppreglerad i njurfibroblaster, men inte i TEC, endotelceller eller podocyter i de fibrotiska njurarna.
(A och C) IF-färgning av TXNDC5 (röd) på sektioner av fibrotiska njurar inducerade av UUO i Col1a1-GFPTg-möss visade att TXNDC5 huvudsakligen uttrycktes i kollagenutsöndrande njurfibroblaster (gröna), både i njurbarken och medulla (n=6). Cellkärnor färgades med DAPI (blå). Skalstång: 100 μm.
(B) IF-färgning av TXNDC5 (grön) på sektionen av fibrotiska njurar inducerad av UUO i Cdh16-Cre, NPHS2-Cre och Tie2-Cre/ERT2 tdTomato-möss. Cellkärnor färgades med DAPI (blå). Skalstång: 100 μm.
(D) Ett cirkeldiagram för att illustrera andelen TXNDC5 plus-celler i olika typer av njurceller i de UUO-inducerade fibrotiska njurarna.
Data är representativa för 3 eller fler oberoende experimentella replikat. Data i C presenteras som medelvärde ± SEM.
TXNDC5 var starkt berikad i kollagenutsöndrande njurfibroblaster i de fibrotiska njurarna. Flera typer av njurceller har varit inblandade i processen för njurfibrogenes. Efter njurskador visades residenta (19) och perivaskulära (20) renala fibroblaster differentiera till aktiva myofibroblaster och resultera i ackumulering av ECM. TEC och endotelceller rapporterades också bidra till utvecklingen avnjurfibrosgenom epitel- respektive endotel-till-mesenkymal övergång (10,21). För att bestämma de celltyper där TXNDC5 uttrycktes under njurprocessenfibros, flera reportermuslinjer som tillåter fluorescensmärkning av njurfibroblaster(Colla1-GFP', GFP driven av Collal-förstärkare/promotor, ref.22), TECs(Cdh16-Cre ROSA26- tdTomato), endotelceller (Tie2-Cre/ERT2 ROSA26-tdTomato) och podocyter (NPHS2-Cre ROSA26-tdTomato) utsattes för UUO, uIRI eller FA-behandling för att induceranjurfibros. Immunfluorescens (IF)-färgning av njursektionerna från dessa djur avslöjade att TXNDC5 var markant uppreglerad och starkt kolokaliserad med GFP-positiva, kollagenutsöndrande njurfibroblaster i fibrotiska musnjurar inducerade av UUO (81 procent) (Figur 2, A och C) , uIRI (76,8 procent) och FA-behandling (73,4 procent) (kompletterande figur 2, A och B). I UUO-inducerade fibrotiska njurar uttrycktes TXNDC5 endast sporadiskt i TEC (5,94 procent), podocyter (0.63 procent), och endotelceller (2,05 procent) (Figur 2, B och D). Flödescytometrianalys av fibroblaster isolerade från musnjurar utsatta för UUO avslöjade en markant expansion i TXNDC5* njurfibroblaster såväl som en signifikant uppreglering av TXNDC5 i dessa celler, jämfört med de från kontralaterala kontrollnjurar (kompletterande figur 2C). Den observerade starka anrikningen av TXNDC5 i njurfibroblaster i fibrotiska antyder att TXNDC5 kan bidra tillnjurfibrosgenom att reglera aktiviteten/beteendet hos dessa kollagenutsöndrande fibrogena celler.
TXNDC5 var både väsentligt och tillräckligt för att inducera aktivering, proliferation och ECM-produktion av njurfibroblaster. Därefter bestämde vi den funktionella rollen för TXNDC5 i njurfibroblaster. Primära humana njurfibroblaster (HKF) stimulerade med TGF- 1(10 ng/ml) visade stark uppreglering i proteinet (Figur 3A) och transkriptionsnivåer (Figur 3B) av TXNDC5, såväl som av fibroblastaktiveringsmarkör periostin och ECM-proteiner (COL1Al, fibronektin och CCN2). Knockdown av TXNDC5 med shRNA försvagade signifikant TGF- 1-inducerad protein/mRNA-uppreglering av periostin och flera ECM-proteiner i HKFs (Figur 3, A och B). Dessutom förbättrade TGF1-behandling den proliferativa aktiviteten hos HKFs, som upphävdes fullständigt genom TXNDC5 knockdown (Figur 3D). Dessa resultat tyder på att TXNDC5 är avgörande för TGF- 1-inducerad HKF-aktivering, proliferation och ECM-produktion. Överuttryck av TXNDC5, å andra sidan, resulterade i markant uppreglering av periostin, COL1A1 och fibronektin (Figur 3C), såväl som ökad proliferativ aktivitet (Figur 3E) i HKFs. Sammantaget visar dessa resultat att TXNDC5, nedströms om TGF- 1, är både väsentligt och tillräckligt för att främja aktivering, proliferation och ECM-produktion av njurfibroblaster.
Figur 3. Nedbrytning av TXNDC5-försvagad TGF- 1-inducerad HKF-aktivering och ECM-produktion; överuttryck av TXNDC5 var tillräckligt för att utlösa HKF-aktivering och ECM-produktion.
(A) Protein och (B) transkriptuttrycksnivåer av fibroblastaktiveringsmarkör (periostin) och ECM-proteiner (COL1A1, fibronektin och CCN2) ökade i kontroll (Scramble) HKF efter TGF- 1 (10 ng/ml) behandling. Knockdown av TXNDC5 dämpade uppregleringen av dessa fibrogena markörer inducerade av TGF - 1 i HKFs (n=5–10).
(C) Överuttryck av TXNDC5 var tillräckligt för att inducera uppreglering av fibroblastaktiveringsmarkör (Periostin) och ECM-proteiner (COL1A1, fibronektin) i HKFs (n=3-10).
(D) Behandling av TGF- 1 (10 ng/ml) ökade den cellulära proliferationsaktiviteten av HKFs, som upphävdes av TXNDC5 knockdown.
(E) Överuttryck av TXNDC5 ökade den cellulära proliferationsaktiviteten hos HKF. I D och E, n=10. Data är representativa för 3 eller fler oberoende experimentella replikat.
För alla paneler presenteras data som medelvärde ± SEM. Den statistiska signifikansen av skillnader för 2 grupper bestämdes med ett 2-sidigt t-test och bland 3 eller flera grupper bestämdes det med 1-vägs ANOVA, följt av Sidaks post hoc-tester. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p=""><>
Global deletion av Txndc5 skyddad mot njure b. För att bestämma kravet på TXNDC5 i utvecklingen avnjurfibrosin vivo, WT och Tndc5-/möss utsattes för UUO-, uIRI- och FA-behandling. Picrosiriusröd och Massons trikromfärgning på njursektionerna visade omfattandenjur-fibrosi WT-möss efter UUO (Figur 4A), uIRI (Figur 5A) och administrering av FA (Supplemental Figur 3A). Global radering av Txndc5 minskade avsevärt omfattningen avnjur-fibrosi alla tre njurskademodeller (Figur 4A, Figur 5A och tilläggsfigur 3A).
Figur 4. Deletion av Txndc5-försvagad njurfibros inducerad av UUO.
(A) Picrosirius röd färgning (översta 2 paneler) och Massons trikromfärgning (nedre 2 paneler) av njursektioner från WT och Txndc5-7möss 10 dagar efter UUO. Stapeldiagram över de kvantitativa resultaten av Picrosirius röd och Massons trikromfärgningsområden visas till höger (n=5-10). Skalstapel∶ 100 μm.
(B)SHG-bilder av njursektionerna från WT och Txndc5-/möss 10 dagar efter UUO. De kvantitativa resultaten av SHG-positiva områden visade ökad ackumulering av fibrillärt kollagen (grönt) i WT men inte i Txndc5-mössens njurar efter skada.
För var och en av njursektionerna avbildade för SHG erhölls TPEF-avbildning för att visa profilen för den skannade vävnaden (röd färg i bottenpanelerna)(n=3). Skalstapel: 50 um. (C)Immunoblots visade proteinuttrycksnivåer av fibroblastaktiveringsmarkör (Periostin) och ECM(COL1A1) i helnjurextraktet från WT och Txndc5-/möss 10 dagar efter UUO (n= 3-6). Data är representativa för 3 eller fler oberoende experimentella replikat.
För alla paneler presenteras data som medel ± SEM. Den statistiska signifikansen av skillnader mellan 3 eller fler grupper bestämdes med hjälp av 1-way ANOVA, följt av Sidaks post hoc-tester.**P<><>
För att kvantifiera patogent fibrillärt kollagen (typ I och II) specifikt och för att undvika överskattning av fibrotiska områden med traditionella färgningsmetoder, andra harmoniska generationens (SHG) mikroskopi, ett nytt optiskt vävnadsavbildningssystem som tillåter visualisering av fibrillära, men inte icke-fibrillära, kollagen i fibrotiska organ(23,24), användes för att bedöma omfattningen avfibrosi WT och Tndc5 plus musnjurar efter skada. I överensstämmelse med ovannämnda resultat visade SHG-mikroskopi markanta ökningar i fibrillär kollagenavsättning i WTkidneys efter UUO (Figur 4B), uIRI (Figur 5B) och FA-behandling (Supplemental Figur 3B), vars omfattning reducerades signifikant i Txndc{{ 4}}/ möss (figur 4B, figur 5B och tilläggsfigur 3B).
I överensstämmelse med det försvagade fibrotiska svaret efter skada i Txndc5-musnjurar som observerats av bildstudier, mildrade deletion av Tendc5 också uppregleringen av ECM-proteingener, inklusive Collar, Eln, Fnl och Ccn2 i musnjurarna efter skada (tilläggsfigur 3, CE). Immunoblots av helnjurvävnadslysat visade också minskad proteinnivå av ECM(COLIA1) och fibroblastaktiveringsmarkör (periostin) i Txndc5-/möss jämfört med WT-möss efter UUO och uIRI (Figur 4C och Figur 5C).
Figur 5. Deletion av Txndc5-förbättrad njurfibros inducerad av ulRI.
(A) Picrosirius rödfärgning (översta 2 panelerna) och Massons trikromfärgning (nedersta 2 panelerna) av njursektioner från WT och Txndc5-7möss 28 dagar efter ulRI. Stapeldiagram över de kvantitativa resultaten av Picrosirius red och Massons trichrome färgningsområdena visas till höger (n=6). Skalstång∶ 100 μm.
(B) SHG-bilder av njursektionerna från WT- och Txndc-5-möss 28 dagar efter ulRI. De kvantitativa resultaten av SHG-positiva områden visade ökad ackumulering av fibrillärt kollagen (grönt) i WT men inte i Txndc5-mössens njurar efter skada. För var och en av njursektionerna som avbildats för SHG erhölls TPEF-avbildning för att visa profilen för den skannade vävnaden (röd färg i bottenpanelerna) (n=3). Skalbar ~50 μm.
(C) Immunoblots visade proteinuttrycksnivåer av fibroblastaktiveringsmarkör (Periostin) och ECM(COL1A1) i helnjurextraktet från WT och Txndc5/möss 28 dagar efter ulRI (n=5-9). Data är representativa för 3 eller fler oberoende experimentella replikat.
För alla paneler presenteras data som medelvärde ± SEM. Den statistiska signifikansen av skillnader mellan 3 eller fler grupper bestämdes med 1-väg ANOVA, följt av Sidaks post hoc-tester.*P<><><>
För att utesluta möjligheten att TXNDC5 uttryckt i andra njurcellstyper såsom TEC, podocyter och endotelceller fortfarande kan bidra till utvecklingen avnjur-fibros, genererade vi Txndc5 villkorliga knockout-möss specifika för TECs (Cdh16-cre*Txcndc5i eller Txndc5Epeko), podocyter (NPHS2-cre*Txndc5/n eller Tendc5Podxko) och endotelceller (Tie{{ 7}}cre/ERT2*Tendc5/, eller Txndc5Endo.eko). I experiment med Txndc5Pieko och Txndc5 Poio-cko möss användes Txndc5Wmöss som kontroller; i experiment på Txndc5EMio-eko-möss inducerades Txndc5-deletion med tamoxifen som beskrivs i figur 9A, där tamoxifenbehandlade Tie2-Cre/ERT2-möss användes som kontroller. Riktad radering av Txndc5 i TEC, podocyter eller endotelceller påverkade dock inte omfattningen avnjurfibrosinducerad av UUO eller FA (tilläggsfigur 6, BE). Dessa resultat tyder på att TXNDC5 uttryckt i TEC, podocyter och endotelceller bidrar lite, om något, till patogenesen avnjurefibros.
Borttagning av Txndc5 i njurfibroblaster skyddar mot TEC-apoptos som svar på njurskada. Håller på attnjur-fibros, skadade TEC förlorar mitokondriell funktion och apikobasal polaritet, följt av apoptos och celldöd(30). För att undersöka om radering av Txndc5 påverkar apoptos av TEC som svar på skada, utförde vi TUNEL-färgning på WT och Txndc5-mus avsnitt 10 dagar efter UUO. Antalet apoptotiska TEC ökade signifikant i de UUO-inducerade fibrotiska njurarna hos WT-möss, medan deletion av Txndc5 försvagade omfattningen av TECapoptos. Det har rapporterats att aktiverade njurfibroblaster skulle kunna inducera TEC-apoptos genom parakrina effekter (31). Eftersom Tendc5 knappt uttrycks i TEC, är det troligt att den minskade TEC-apoptos som observerades i Txndc5-7möss efter UUO inte var en cellautonom effekt utan snarare sekundär till minskad interstitiell effektfibrosoch därmed färre proapoptotiska signaler från omgivande njurfibroblaster. I enlighet med denna hypotes försvagade fibroblastspecifik deletion av Txndc5 (Tendc5kO) TEC-apoptos i en omfattning liknande den som observerades i Txndc5-/möss 10 dagar efter UUO (Supplemental). I motsats till den observerade minskningen av TECapoptos, antalet F4/80-positiva makrofager och CD31-positiva endotelceller var jämförbara i WT- och Txndc5-musnjurar, med eller utan UUO, vilket tyder på att Txndc5-deletion inte påverkar makrofaginfiltration eller peritubulär kapillärtäthet i musnjurarna. Sammantaget tyder dessa data på att de reno-skyddande effekterna av Txndc5-deletion är ett resultat av minskad tubulär interstitiellfibrosoch TEC-apoptos, utan att påverka njurkapillärdensiteten eller makrofager.
Inducerad deletion av Tendc5 i njurfibroblaster minskade progressionen av etableradenjurfibros. För att avgöra om inriktning på Txndc5 i njurarna kan vara fördelaktigt vid etableradnjur-fibros, Txndc5-deletion i njurfibroblaster inducerades i Txndc5eko-möss 10 dagar efter UUO, en tidpunkt då omfattandenjur-fibroskan observeras. I dessa experiment användes tamoxifenbehandlade Colla2-Cre-möss som kontroller. Som visas hade Colla2-Cre- och Tcndc5eko-möss en liknande omfattning avnjur-fibros10 dagar efter UUO före tamoxifenbehandling. Elva dagar efter tamoxifeninjektion fortsatte dock omfattningen av njurfibros att utvecklas hos kontrollmöss (fibrotisk yta ökade från 5,1 procent till 10,6 procent), medan progressionen avnjurefibrosvar nästan stoppad (fibrotisk yta ändrades från 5,3 procent till 6,9 procent) hos Txndc5eko-möss. Immunoblotting visade också markant försvagad uppreglering av CCN2, periostin och TGFBR1 i Txndc5eko-möss jämfört med kontrollmöss mellan D10 och D21 efter UUO. Dessa resultat visar att interventionell deletion av Txndc5 i njurfibroblaster signifikant minskar utvecklingen avnjurfibros, vilket tyder på att in vivo-inriktning av TXNDC5 kan vara en ny och kraftfull terapeutisk metod för att förbättranjurefibrosoch att bromsa utvecklingen av CKD.
