Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Klicka här för information om del II (Introduktion, material och metoder) i denna artikel.

Nära encellig proteomisk profilering av proximala tubular och glomerulus i den normala mänskliga njuren

Tara K. Sigdel¹, Paul D. Piehowski², Sudeshna Roy¹, Juliane Liberto¹, Joshua R. Hansen², Adam C. Swensen², Rui Zhao³, Ying Zhu³, Priyanka Rashmi¹, Andrew Schroeder¹, Izabella Damm¹, Swastika Sur¹, Jinghui Luo4, Yingbao Yang4, Wei-Jun Qian²* och Minnie M. Sarwal¹* för Kidney Precision Medicine Project (KPMP) Consortium

¹Division of MultiOrgan Transplantation, Department of Surgery, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA

²Pacific Northwest National Laboratory, Biological Sciences Division, Richland, WA, USA

³Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA, USA

⁴Institutionen för patologi, University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA

Nyckelord:glomerulus, masspektrometri, encellsanalys, proteomik,njure

Molekylära bedömningar på encellsnivå kan påskynda biologisk forskning genom att tillhandahålla detaljerade bedömningar av cellulär organisation och vävnadsheterogenitet i både sjukdom och hälsa. Människannjurehar komplexa multicellulära tillstånd med varierande funktionalitet, varav mycket nu kan utnyttjas fullständigt med de senaste tekniska framstegen inom vävnadsproteomik på nästan encellsnivå. Vi diskuterar de grundläggande stegen i den första tillämpningen av denna masspektrometri (MS) baserade proteomikmetod för analys av undersektioner av den normala människannjure, såsom en del av projektet för njurprecisionsmedicin (KPMP). Med hjälp av ~30–40 laserfångade mikrodissekerade njurceller identifierade vi mer än 2 500 mänskliga proteiner, med specificitet förproximalt rörformigt(PT; n=25 proteiner) och glomerulära (Glom; n=67 proteiner) regioner injureoch deras unika metaboliska funktioner. Denna pilotstudie tillhandahåller färdplanen för tillämpning av vårt nästan encelliga proteomik-arbetsflöde för analys av andra njurmikrokompartment, i större skala, för att reda ut störningar av njurens subcellulära funktion i den normala njuren såväl som olika etiologier. av akut och kronisknjursjukdom.

cistanche kan förbättra njurfunktionen

Introduktion

Nya framsteg inom molekylär profilering, speciellt transkriptionsanalys på encellsnivå, kan avslöja sällsynta cellpopulationer inom heterogena kliniska vävnader, vilket bidrar till vår förståelse av njurbiologi och dess molekylära processer (1–7). Det finns ett otillfredsställt behov av att utveckla metoder som kan ge omfattande biologisk information på RNA- och DNA-nivåer och även möjliggöra encellig proteomisk vävnadsanalys.

Proteomteknik kan, till skillnad från genomik, ge funktionell information om celltillstånd och regulatoriska nätverk (2). En teknisk utmaning för masspektroskopi (MS) baserad proteomik är begränsningen av utgångsmaterial. Till skillnad från transkriptomik tillåter inte proteomik molekylär amplifiering. Denna fakta har resulterat i betydande ansträngningar för att förbättra den analytiska känsligheten hos MS-baserad proteomik, inklusive teknologiminiatyrisering och högre effektivitet vid elektrosprayjoniseringskällan (8, 9), så att den analytiska känsligheten nu är tillräcklig för att detektera proteiner i enstaka däggdjur celler. Trots hög analytisk känslighet har proteomapplikationer på små provvolymer infört ytterligare utmaningar, såsom ospecifik adsorption av proteiner och peptider till ytorna av reaktionsrör, ineffektiv matsmältningskinetik, behovet av rensning och utmaningar med leverans. Vår grupp har nyligen rapporterat om metoden nästan encellig proteomik (nscProteomics) i HeLa-celler, som tillhandahåller mycket innovativ och känslig teknologi för proteommätningar av prover med sub-nanogram mängder protein från ett litet antal celler (10). Denna metod kräver mycket anpassad provbearbetningsutrustning och är svår att överföra till andra forskningslabb i dess nuvarande utvecklingsläge. Bearbetar människanjurevävnader genom denna pipeline har krävt noggrann uppmärksamhet vid protokollutveckling för att optimera vävnadsbevarande och cellinfångning.

I denna studie har vi fokuserat på att tillhandahålla en färdplan för framgångsrik mätning av proteomisk utfrågning av olika underavdelningar avnjure, på nästan encellsnivå, med följande resultat: (i) Bedömning av optimal uppsamling och lagring av njurvävnad för nscProteomics; (ii) Identifiering av lämplig referensstandard för nscProteomics; (iii) Optimering av njurvävnadens tjocklek för laserinfångningsmikrodissektion (LCM); (iv) Optimering av LCM-parametrar; (v) Beskrivning av nscProteomics-metoden med användning av en LC-MS-baserad, helautomatisk mikro POTS-metod (μPOTS; Processing in One pot for Trace Samples) (11). (vi) Dataanalys för nscProteomics.

För att uppnå ovannämnda uppgifter har vi bearbetat 11 unika människornjurebiopsier och utvecklade protokoll och metoder för att samla in, bearbeta och förhöra det proteomiska uttrycket hos människornjureprover av μPOTS. När vi kombineras med mycket känslig LC-MS uppvisar vi en helt automatiserad μPOTS-metod som möjliggör reproducerbarhet och ger kvantitativa proteomiska mätningar av ~3,000 proteiner från 10 till 100 laserinfångade mikrodissekerade (LCM) njurceller, en täckningsnivå som endast uppnåtts tidigare för tusentals celler (12–17). Denna studie kommer att bidra till molekylär karakterisering av cellulär heterogenitet och patologi i vävnad i njurbiopsier från patienter med olika orsaker till akut och kronisk njursjukdom. Denna unika teknologi har potential att reda ut proteomisk heterogenitet och unika proteinmarkörer i olikanjuresjukdomsundertyper och understrukturer som kommer att korrelera med sjukdomspatogenes, prognos och riskstratifiering. Studien sammanfattas i figur 1.

Figur 1. Arbetsflödet för nära encellig proteomik (nscProteomics) är optimerat för bearbetning av människornjurevävnader. Arbetsflödet inkluderar identifiering av optimalanjurevävnadsinsamling och lagring, kvalitetskontrollerna för laserinfångning av mikrodissektion av nscProteomics-metoden för njurceller.

Experimentella procedurer

Studera design

Den schematiska representationen av de proteomiska studierna som genomförts på 11 unika mänskliga normalanjurarvisas i figur 2A. Totalt 28 masspektrometri (MS)-körningar utfördes för bulk- och laserinfångningsmikro-dissektion (LCM) nscProteomics på parade glomerulära (Glom) och proximala, konvoluterade tubulära (PT) sektioner. Vävnader från de två förstanjurarkonserverades som FFPE och i medium för optimal skärtemperatur (OCT). Njurvävnadsproblem från ytterligare 9 njurar bearbetades endast i oktober (Figur 2A).

Figur 2. (A) En sammanfattning av studieprover och analyser. (B) QC-diagrammet för reproducerbarhet av processen med användning av OCT-vävnad. Spektralantalskillnader mellan proteiner för 2 separata körningar med OCT-vävnad plottades mot det genomsnittliga proteinspektralantalet för 1 257 proteiner. I handlingen visar den blå linjen medelskillnad; de röda och gröna linjerna visar 2 SD- respektive 3 SD-gränser. 97,96 procent av proteinerna ligger inom den beräknade reproducerbarhetsgränsen på 13,52, vilket indikerar en hög grad av reproducerbarhet. Det kan också ses att variabiliteten mellan körningarna för processen som involverar OCT-vävnad är lägre än den för processen som involverar FFPE-vävnad (beräknad reproducerbarhetsgräns: 24,43). (C) Jämförelse av spektralräkningsfördelningar av 374 vanliga proteiner i OCT och FFPE. Ett större antal proteiner från OCT-vävnad uppvisar höga spektrala antal medan en högre övervikt av låga spektraltal ses för proteiner från FFPE-vävnad. (D) Jämförelse av spektralräkningsfördelningar av 76 unika proteiner i FFPE och 244 unika proteiner i OKT. Den högre övervikten av proteiner med lågt spektralt antal ses i OCT-vävnad. Detta kan indikera att OCT-vävnadsteknik är bättre för att upptäcka proteiner med låg mängd i det aktuella scenariot. Korrelationskoefficienten mellan proteiner identifierade från 2 OCT frusna vävnader var 0.96 (P <>

Provtagning av njurvävnad

Mänsklignjurvävnadersamlades in från totalt 11 avidentifierade partiella nefrektomier, erhållna från University of California San Francisco (UCSF) och University of Michigan (UM), med godkänd IRB, som en del av en pilotteknisk genomförbarhetsstudie i NIH Kidney Precision Medicine Projekt (KPMP). Endast det friska områdetnjuresom bestämts av en utbildad patolog användes för detta ändamål. Prover anonymiserades med den enda varningen att vävnaderna samlades in från vuxna. För att bedöma det optimala provtagningsprotokollet för tekniken delades initialt ~100 mg vävnad från 2 njurar lika och antingen preparerades som formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) vävnadssnitt eller frystes i Tissue-Plus™ OCT-förening (Fisher Scientific). En 5 μm och tre 10 μm tjocka på varandra följande sektioner skars från varje OCT-block med en kryomikrotom och monterades på 1,0 polyetylentereftalat (PET) membranglas (Zeiss) för glomerulär ochproximal tubulidissektion. Den 5 μm tjocka sektionen H&E-färgades för visualisering av stora histologiska strukturer. De återstående 10 μm tjocka sektionerna lämnades ofärgade. Alla objektglas lagrades vid -80 grader tills dissektion.

Cistanche för att förbättra njurdysfunktion

Bedömning av inverkan av vävnadstransport och bearbetning på proteomisk produktion

För att bedöma effekten av förseningar på den proteomiska analysen av fryst vävnad i OLT,njuretissue samples were collected at one center, shipped to a second site >4 timmars resa bort, och bearbetas vid det andra centret, och vice versa. Bulk proteomics utfördes på två 2 unikanjurar(njure #3, #4), inhandlad vid University of Michigan och skickad till 2 olika platser (Ohio State University och UCSF) för MS-analys, med samma protokoll och MS-parametrar på båda platserna. Resultaten av MS-körningarna jämfördes sedan mellan de två platserna.

Proteinextraktion och utfällning

Detta utfördes på både OCT- och FFPE-vävnadsförberedelsemetoderna för valet av den optimala metoden för vävnadsproteomik. OCT-vävnad sektionerades i 10 μm tjocka sektioner med hjälp av en kryomikrotom. För att välja den minimala mängd vävnad som behövs för proteinextraktion för MS, skars tre lockar (en sektion som placeras i ett Eppendorf-rör istället för att spridas på objektglaset) och 5 lockar av frusen vävnad, tinades och överfördes till mikrocentrifugrör innehållande en 5 mm pärla av rostfritt stål (Qiagen), exponerad för däggdjurscelllysbuffert (inklusive Benzonase® Nuclease and Protease Inhibitor Solution; Qiagen), och homogeniserad i en TissueLyser LT (Qiagen) vid 50 r/s i 3 min. Proteinkoncentrationen kvantifierades (Bradford-analys; Thermo Scientific) och lagrades vid -20 grader fram till användning. Vävnad lagras för<2 months="" in="" ffpe="" was="" sectioned="" into="" ten="" 10="" μm="" thick="" sections="" using="" a="" microtome.="" three="" and="" five="" curls="" of="" tissue="" were="" cut,="" deparaffinized="" in="" xylene,="" centrifuged,="" and="" incubated="" in="" extraction="" buffer="" exb1="" (qiagen)="" supplemented="" with="" β-mercaptoethanol.="" samples="" were="" incubated="" on="" ice,="" followed="" by="" incubation="" at="" 80°c="" for="" 2="" h.="" protein="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" further="" use.="" protein="" was="" precipitated="" by="" the="" addition="" of="" cold="" acetone,="" followed="" by="" centrifugation="" to="" pellet="" and="" dry="" the="" precipitated="" protein.="" the="" pellet="" was="" re-suspended="" in="" 6="" m="" urea/100="" mm="" tris-hcl="" ph="" 7.8,="" and="" protein="" concentration="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" trypsin="">

Trypsin nedbrytning

Ungefär 15 0 ug totalt protein (~15 procent av tillgänglig insats) exponerades för reduktionsmedel (200 mM DTT och 100 mM Tris-HCl) och alkylerande reagens (200 mM jodacetamid och 100 mM Tris-HCl) och späddes sedan med RNAse/DNAs-fritt vatten för att reducera ureakoncentrationen till 0,6 M. Fyra ug svintrypsin (Sigma) tillsattes och provet digererades vid 37 grader. Proteinkoncentrationen kvantifierades (Bradford-analys; ThermoScientific) och 10 ug protein användes för MS.

MS för Bulk Proteomics för att bedöma den optimala njurvävnadsbearbetningsmetoden

Den tryptiska peptidblandningen surgjordes med myrsyra, rengjordes med C18 Monospin-kolonner och analyserades på Orbitrap Q Exactive HF-X (Thermo Scientific). MS/MS utfördes med hjälp av Higher-Energy C-Trap Dissociation (HCD). Masspektra analyserades med användning av Byonic v2.14.27 (Protein Metrics) vilket medgav 12 ppm masstoleranser. Variabla posttranslationella modifieringar tillåts, inklusive oxidation, metylering, karbamylering och fosforylering. Proteiner var begränsade till de som fick bättre betyg än 1 procent falsk upptäckt (FDR). Jämförelser av proteinöverflöd och MS-data gjordes för att välja den optimala metoden förnjurevävnadsinsamling mellan FFPE och OKT.

Laser Capture Microdissection

Ofärgade 5, 10 och 20 μM tjocka sektioner monterade på PET-objektglas placerades på scenen i Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection-systemet (Zeiss) för att testa optimal skärtjocklek. Glomerulär ochproximal tubuliregioner valdes med hjälp av frihandsverktyget och dissektioner utfördes vid 10X objektiv. Sektioner med ~4 580 μm2 area och 10 uM tjocklek fångades in, vilket stod för ~40 glomerulära celler baserat på den tidigare publicerade formeln för uppskattning av glomerulära celler hos en frisk vuxennjure(18). Förproximalt rörformigtceller, vi fångade ~2 900 μm2 avproximalt rörformigtceller, som stod för ~36 celler. Utskurna sektioner katapulterades i en 200 μL ogenomskinlig självhäftande lock (Zeiss) (LPC Energy, 66; LPC Focus, 79) och lagrades vid -80 grader.

Nära-encellig proteomik (nscProteomics)

För att solubilisera proteiner som samlats i fångstlock med LCM sattes en 10 μL droppe av 0,1 procent DDM 50 mM Tris pH 8 direkt till locket. Prover inkuberades i 30 minuter vid 37 grader i en Eppendorf ThermoTop termomixer för att minska avdunstning, följt av centrifugering vid 2,000 x g under 1 minut för att överföra lysatet till flaskan. Proteiner reducerades med 5 mM ditiotreitol och inkuberades vid 37 grader i 30 minuter. Alkylering utfördes vid 10 mM jodacetamid med en 45 minuters inkubation i mörker vid 25 grader. Därefter tillsattes en 10 ng alikvot av Ls-C följt av en 3 timmars inkubation vid 25 grader. En 10 ng alikvot trypsin tillsattes sedan följt av nedbrytning över natten vid 25 grader. De digererade peptiderna blandades med en 15 μL alikvot av 18 MΩ vatten.

LC-MS-plattform för ultrasmå prover

Peptidprover (25 μL) separerades med en 60 cm kolonn, med en 50 μm innerdiameter och en integrerad emitter (New Objective). Kolumnerna packades internt med 1,7 μm diameter Waters BEH media. En 100-min gradient producerades med en Dionex Ultimate 3000 RSLC nanopump (Thermo Scientific). Detta system kopplades till en QExactive Plus masspektrometer (Thermo Scientific). Masspektra samlades in från 300 till 1 800 m/z, med användning av en topp 12 databeroende insamlingsmetod. MS1-spektra samlades in med en massupplösning på 35K och MS2 med 17,5K. En maximal IT på 100 ms användes för att öka identifieringen från joner med låg förekomst.

Proteomisk dataextraktion

Alla råfiler bearbetades med MaxQuant (version 1.5.3.30) för funktionsdetektion, databassökning och protein/peptidkvantifiering (19) enligt inställningar som beskrivits tidigare (10). Tandemmasspektra söktes i den mänskliga databasen UniProtKB/Swiss-Prot (nedladdad den 29 december 2018 och innehöll 20 417 granskade poster). MS-proteomikdata för nscProteomics har deponerats till ProteomeXchange Consortium via PRIDE (20) partnerförråd med datauppsättningsidentifieraren PXD015058 och 10.6019/PXD015058.

Dataanalys

MS-data erhölls från körningar utförda vid PNNL (nscProteomics) och Stanford University (bulk proteomics). För bulkproteomik. Följande statistiska metoder användes för att välja den optimalanjurevävnadsinsamlingsmetod, antingen fryst i OLT eller bearbetad som FFPE, bedömd med kvantitativ vävnadsbulkproteomik, (i) Proteinutbyte/mg av ekvivalent ingående vävnad beräknades; (ii) MS-reproducerbarhet testades på MS-utdata från FFPE- och OCT-sektioner från var och en av två njurar, framställda av samma individ med samma protokoll, analyserade på samma MS-instrument med ett fast protokoll, med några dagars mellanrum (21). En reproducerbarhetsgräns (22) användes för att ge en ungefärlig gräns för mätskillnader mellan på varandra följande körningar av en enskild process samt en uppskattning av precision för jämförelse mellan processer. Korrelationskoefficienten, som gav graden av överensstämmelse mellan på varandra följande körningar (med användning av samma vävnad), beräknades; (iii) Proteinöverflöd och peptidfragmentstorleksfördelning beräknades för att bedöma variationer som härrörde från proteinnedbrytning, tvärbindning på grund av formalin, etc. Andra aspekter av QC, inkluderade (iv) bedömning av processdrift över replikat och tid genom att använda en gemensam poolnjurereferens och (v) beräkning av bias. Stringent kvantitativ analys och identifiering av unika proteiner använde data endast med proteiner med spektralantal större än eller lika med 5 (23). Fishers exakta test användes för att bedöma anrikningen av vanliga och unika proteiner kartlade mellan två normala mänskliga njurar (#1 och #2). Baserat på ovanstående analys (se resultat) valdes OCT frusen vävnad som insamlingsmetod för alla efterföljande analyser.

Nästa steg i dataanalysfokus var att identifiera, kvantifiera och validera proteinuppsättningar berikade i eller specifika för de ~10–100 celler som erhållits från var och en av två utvaldanjureunderavdelningar—Glom- och PT-regioner, erhållna från sammanjure, i bulk och LCM av OCT frystnjurvävnad(n=9; njurar #3–11) och drivs av nscProteomics.

En semi-konservativ filtreringsmetod i {{0}}steg användes för att hantera problem med saknade/ofullständiga data, och G-testet (24) användes för att identifiera om data saknades slumpmässigt (MAR) eller Missing Not At Random (MNAR). Ytterligare datatillförlitlighetsbedömning gjordes genom att strikt selektera proteiner som observerats i mer än eller lika med 50 procent av alla prover. T-test användes för att identifiera för proteiner signifikant anrikning av glomming eller PT och multipla testkorrigeringar (Benjamini-Hochberg FDR) med en signifikanströskel på 0,1 tillämpades. För analysens syfte, MS-data för relativ intensitet (log 2 transformerad) erhållen från Glom, PT och bulkfraktioner från en endanjureansågs vara ihopkopplade. Vi identifierade proteiner berikade i Glom (med låga nivåer i PT/bulk) och unika för Glom (frånvarande i PT) samt proteiner berikade i PT (med låga nivåer i Glom/bulk) och unika för PT (frånvarande i Glom) . Anrikningsanalys gjordes endast på data utan att sakna värden i varje grupp för att öka förtroendet. Korrelationen mellan överflödsvärdena för vanliga proteiner användes för att bedöma graden av överensstämmelse mellan anrikade sub-kompartmentproteiner mellan separata körningar av samma experiment. Vi utförde också korsvalidering av signifikant anrikade proteiner i varje fack genom att analysera dessa jämförelser från unika provuppsättningar mellan 2 olika körningar, Körning 1 och Körning 2. Biologisk validering för anrikade subkompartment (Glom och PT) uppsättningar av proteiner utfördes av fråga om kända subkompartmentberikade proteiner kunde lokaliseras tillbaka till sina specifika regioner i offentliga data från Human Protein Atlas (https://www.proteinatlas.org/) (25).

Cistanche för symtom på njursvikt

Cross-Omics datajämförelse/integrering

För att bedöma överensstämmelsen mellan proteinuttryck på RNA-nivå användes data genererade från encellig RNA-sekvensering (scRNA Seq) utförd på 10 infödda nefrektomier, varav 9 överlappade mednjuraranvänds i nscProteomics. För detta användes 10x Genomics Chromium-plattform med v3-kemi med metoden optimerad i Sarwal-labbet som en Tissue Interrogation Site (TIS) av KPMP Consortium (ett manuskript som beskriver metoden och resultaten är under förberedelse). För denna cross-omics-analys använde vi transkriptomdata från 45 411njureceller löses upp i nio huvudcelltyper: Podocyter, mesangialceller, glomerulärt endotel, stroma/interstitium, immunceller,proximal tubuli, tjock uppåtgående lem av öglan av Henle, distal/anslutande tubuli och uppsamlingskanal. Analys av encellsdata gjordes med Seurat R-paketversion 2.3.4. Mer djupgående analys av dessa data är under utveckling (26).

Från: 'Nära-encellsproteomikprofilering avProximalt rörformigtochGlomerulusav den normala människanNjure' av Tara K. Sigdel1, Paul D. Piehowski2, Sudeshna Roy1, Juliane Liberto1, Joshua R. Hansen2, Adam C. Swensen2, Rui Zhao3, Ying Zhu3, Priyanka Rashmi1, Andrew Schroeder1, Izabella Damm1, Swastika Sur1, Yinghui Luo4, Yinghui Luo4 Yang4, Wei-Jun Qian2* och Minnie M. Sarwal1* förNjurePrecision Medicine Project (KPMP) konsortium

---ORIGINAL FORSKNINGSartikel Front. Med., 17 september 2020 |