Abstrakt
Syfte: Denna studie genomfördes för att bekräfta användbarheten av ett blandat örtextrakt (MHE) som ettanti-aging kosmetikaingrediens genom att undersöka desshudens anti-agingaktiviteter in vitro och in vivo. Metoder: I denna studie förberedde vi MHE med hjälp av en ultraljudsextraktion innehållande Forsythiae fructus, Tribuli fructus, Salomons sigill, Sibirisk ginseng, Ponciri Fructus och Ginseng. Vi undersökteanti-aging effekt av MHE för hud i dermala fibroblaster. Deanti-aging aktivitetbestämdes av typ I kollagensyntesnivåerna. Matrismetalloproteinas-1 (MMP1) och vävnadshämmare av metalloproteinaser 1 (TIMP1) mRNA-nivåer mättes med qRT-PCR. MMP1-proteinnivåer utvärderades genom blottinganalys. Kliniska tester av hudens fuktighet, elasticitet, struktur och rynkor utfördes med kosmetika innehållande 1 procent MHE. Resultat: MHE inducerade uppregleringen av pro-kollagen typ I-syntes och TIMP1-mRNA-uttryck. MHE ledde till nedreglering av MMP1 mRNA-nivåer och proteinnivåer. Dessutom, efter hudapplicering av kosmetika innehållande 1 procent MHE, förbättrades hudens återfuktning, elasticitet, textur och kråkfötter 4 veckor efter behandlingen. Slutsats: MHE har en anti-aging effekt genom att främja kollagensyntes och undertrycka MMP1 genuttryck in vitro, och det har en hudförbättringseffekt in vivo. Därför visade sig MHE ha värde som en funktionell kosmetisk ingrediens.
Nyckelord:Hudvård, Anti-åldring, Anti rynkor, Naturkosmetika, Örtmedicin
Örttillskotten Cistanche för ANTI-AGEING
Introduktion
Huden är ett organ som kommer i kontakt med den yttre miljön och är avgörande för vår överlevnad och fungerar som den primära barriärenmot yttre angreppsåsom smittämnen och fysisk skada; dessutom fyller den flera viktiga fysiologiska roller (Slominski et al., 2004; Vollmer et al., 2018). När vi åldras,hudfunktionförsämras gradvis med atrofiska förändringar på grund av ultravioletta (UV) strålar, föroreningar och stress och av hudens åldrande som uppstår när antalet hudceller och hudens tjocklek minskar (Farage et al., 2013).
Hudens åldrandekan delas in i endogent åldrande och exogent åldrande. Endogent åldrande av huden sker naturligt över tid oavsett yttre påverkan. Den dermala epidermalajunction (DEJ) sammanhållningen försvagas, och med differentieringenav keratinocyter minskar lipidbildningen (Makrantonakiet al., 2007). Å andra sidan orsakas exogent åldrande av yttrefaktorer som UV-strålar, infraröda strålar (IR), rökning, finadamm och livsstil. Bland dessa orsakas fotoåldring av UVstrålar som tränger in i huden och skadar kollagen och elastini dermis. I denna process, de elastiska fibrerna och kollagenfibrer i huden deformeras, vilket resulterar i minskad elasticitetoch hängande. Kollagen är en viktig komponent i det extracelluläramatris och har en viktig roll för att bestämma vävnadsfunktion.
Bland de olika kollagentyperna står kollagen typ 1 för cirka 75-80 procent av det totala kollagenet (Landau, 2007; Lovell et al., 1987; Mays et al., 1988). När huden utsätts förUV-strålar under lång tid, fria radikaler produceras. Dessa gratisradikaler stimulerar uttrycket av matrismetalloproteinas-1(MMP1) som främjar kollagennedbrytning och hämmar kollagensyntes som minskar hudens elasticitet och resulterar i rynkor.Därför, för att förebygga och förbättra hudrynkor orsakade avåldrande, är det nödvändigt att utveckla en ingrediens som främjarkollagenproduktion och hämmar uttrycket och aktiviteten avMMP1 (Wlascheket al., 2001).
Hudens åldrandeär nära relaterat till livskvalitet. Eftersom huden är det mest synliga organet gör den oss medvetna om åldrandeprocessen (Binic et al., 2013). Olika insatser pågår inom områdena medicin, läkemedel och kosmetikaförebygga och förbättra hudens åldrande. Deutveckling av anti-aging ingredienserär en av de viktigaste anti-aging-strategierna.
Vi har förberett örtextrakt med hjälp av ultraljudsextraktion för att utveckla nya anti-aging ingredienser som innehåller Forsythiae fructus, Tribuli fructus, Salomons sigill, Sibirisk ginseng, Ponciri fructus och Ginseng.
Sex växtbaserade läkemedel valdes ut från växter med olika medicinska effekter och hudeffekter. Forsythiae fructus, den torkade frukten av Forsythia suspense (familjen Oleaceae), känd som Lian Qiaoi Kina, spelades först in i Shennong Bencao Jing, enprestigefylld monografi om traditionell kinesisk medicin (TCM)(Donget al., 2017). Den har använts som värmerengöring ochavgiftande TCM för behandling av infektionssjukdomar, som t.exakut nefrit, erysipelas och sår (Wanget al., 2018). Det äranvänds i stor utsträckning på kliniker som recept på enstaka läkemedel eller sammansatta.Modern farmakologi har visat att den har en mängd olikabioaktiviteter, inklusive antiinflammatoriska, antibakteriella, antiviral, antioxidant, antitumör, antidiabetiker, antihyperlipidemi,antiandrogen alopeci, anti-kräkningar, anti-aging och anti-fetma aktiviteter och neuroprotektiva, leverskyddande ochvasorelaxerande effekter (Donget al., 2017). Dessutom har det varitrapporterade detForsythiae fructushar hudblekning, anti-atopisk dermatit och anti-aging effekter. Enligt Taiwansrikstäckande receptdatabas,Forsythia Fructushar varitingår i topp 10 örter som oftast används för att behandla atopiskdermatit (15,9 procent), urtikaria (11,49-13,4 procent) och akne (22,3 procent)(Donget al., 2017). Forsythiae fructusinnehåller saponiner,flavonoider,och alkaloider och oleanolsyra som har en användbarfarmakologisk verkan. Dessutom innehåller den arctigenin ochmatairesinol. Som fysiologiskt aktiva hudingredienser är deär tyrosinashämmare som verkar på melaninmetabolismenväg inducerad av -melanocytstimulerande hormon ( -MSH)och väcker uppmärksamhet som kosmetiska blekningsmaterial(Yang & Choe, 2011).Tribuli fructus, som är den torkade frukten avTribulus terrestrisL, har rapporterats ha farmakologiskaaktiviteter för att förbättra sexuell funktion, förebygga och behandlahjärt-kärlsjukdom, och förbättra neuroprotection ochminne. Den har också antidiabetiker, antiinflammatorisk ochantioxidanteffekter (Chhatreet al., 2014). Tribuli fructusextrakt innehåller stora mängder diosgenin, tigogein, olikasaponiner, etc. Dessa saponiner är de viktigaste bioaktivakomponenter som ansvarar för olika biologiska effekter som t.exafrodisiakum effekt, antihypertensiv effekt och skyddandeeffekt mot ischemi-reperfusionsskada och anticancer,antibakteriella och svampdödande aktiviteter (Chhatreet al., 2014).
Andra ingredienser inkluderar furostanol och spirostanol saponiner, polysackarider, flavonoidglykosider, alkaloider och amider. Dessutom är den effektiv mot atopisk dermatit hos råttor och har antiinflammatoriska effekter (Chhatre et al., 2014). Det har rapporterats att anti-aging-effekten av Tribuli fructus extrakt ökar produktionen av typ I pro-kollagen och elastin i HS68-celler, främjar lipidackumuleringen av adipocyter och i slutändan förbättrar hudens rynkor och elasticitet (Kim et al., 2016) ). Sibirisk ginseng (Acanthopanax senticosus) är en lövfällande buske som tillhör familjen Oga tillsammans med ginseng och vild ginseng. Sibirisk ginseng har många likheter med ginseng och används som örtmedicin mot stroke, högt blodtryck och diabetes. Sibiriskt ginsengextrakt har använts i orientalisk medicin under lång tid, och farmakologiska och fysiologiska resultat har rapporterats i olika studier tills nyligen. Sibiriska ginsengkomponenter som hittills har identifierats inkluderar eleuthero-sidorna A, B, C, D, E, I, K, L och M, och sesamin, chiisanosid, koffeinsyra, klorogensyra, campesterol, vitaminer och mineraler (Park et al., 2010).
Den innehåller triterpenoidsaponiner, lignaner, kumariner ochflavonoider, bland vilka de fenoliska föreningarna anses vara de mest aktiva komponenterna (Huang et al., 2011). Det finns många rapporter om effektiviteten av sibiriskt ginsengextrakt på huden.Den anti-rynkeffekt,antioxidant effekt,kollagensyntes, och kollagenashämmande aktivitet mot fotoåldring har rapporterats (Park et al., 2010). Det har rapporterats att sibiriskt ginsengextrakt reglerar syntesen av typ IV kollagen, vilket påverkar proliferationsförmågan hos epidermala stamceller och förtjockar epidermis (Choi et al., 2016). Salomons sigill är en rhizom av Polygonatum odoratum (synonym: P.officinale) som har en tonisk effekt och används för att behandla hjärtsvikt och diabetes inom orientalisk medicin. Salomos sigill är anti-cykel och hostdämpande; det lindrar hjärtspänningar och är ett diuretikum, energigivande, hypoglykemiskt, lugnande och styrkande medel; det används för att behandla lungsjukdomar, inklusive tuberkulos och gastrointestinala sjukdomar (Haroon et al., 2012). Dessutom används det i stor utsträckning vid behandling av blodsjukdomar; det har gynnsamma effekter på njurkanalerna och förhindrar grått hår, synproblem, yrsel och ringorm. Det är en nervtonic och används vid diabetesbehandling (Haroon et al., 2012). Salomonssäl har en hög fenolhalt och antioxidantaktivitet. Homoisoflavanoner från Solomons sigill hämmar bildningen av avancerade glykosyleringsslutprodukter. Salomos sigill har visat en stark tarmimmunsystemreglerande aktivitet och förmågan att inducera osteoklastdifferentiering och lektininducerad apoptos. När det gäller P. odoratum bladextrakt rapporteras sårläkningsfunktionen som ett exempel (Fathi et al., 2014). Ponciri fructus imatures är den omogna frukten av Poncirus trifoliata Rafinesque, som tillhör familjen Rutaceae (Jung et al., 2016). Nyligen har antiinflammatoriska och anti-överkänslighetseffekter rapporterats, och effekten av extraktet av fettslam har rapporterats inducera apoptos av cancerceller (Lee et al., 2008). Ponciri fructus är känt för att vara effektiv vid behandling av atopisk dermatit. Genom hudapplicering av Ponciri fructus-extrakt har dess effekter mot atopiska dermatitider, såsom epidermal hyperkeratos, dermalt ödem och cytokiner, rapporterats. I synnerhet har betydande minskningar rapporterats i klåda, antalet mastceller, IgE-produktion och uttryck av nervtillväxtfaktorer. Ponciri fructus-extrakt har visat en effektiv antiinflammatorisk effekt mot atopisk dermatit och klådstillande effekt genom att reglera immunmekanismer. Dessutom är oral administrering av Ponciri fructus-extrakt känt för att vara till hjälp för behandling och förebyggande av allergiska sjukdomar (Hwang et al., 1997). Ginseng är en allmänt använd traditionell örtmedicin med multifunktionella aktiviteter. Ginseng har använts för dess antiinflammatoriska, antioxidant-, antitumör- och anti-aging-aktiviteter (Choi, 2008; Kim & Ko, 2020). Många studier har genomförts på effekten av ginseng på huden (He et al., 2018). Bland dem finns det många rapporter om saponiner och ginsenosider, som är representativa ingredienser i ginseng. Saponiner är föreningar som finns mycket i de flesta växter och finns i olika former. Saponiner kan påskynda olika biologiska aktiviteter såsom hemolys och antibakteriella, antivirala och antioxidantfunktioner. Dessutom har saponiner antiinflammatoriska egenskaper som kan minska svullnad och hudinflammation. Ginsenosider ökar interleukin (IL)-1, en av de inflammatoriska cytokiner som är kända för att främja angiogenes och inducera vaskulär endoteltillväxtfaktor och ackumuleringvid hudbrännplatser hos möss. Deras effekt att ta bort makrofager från hudsår och främja sårläkning har också rapporterats (Kim et al., 2011).
Syftet med denna studie var att belysa hudens anti-aging-effekt av ett blandat örtextrakt (MHE) in vitro och in vivo.
Metoder
1. Effektutvärdering in vitro
1) Förberedelse av MHE
Torkad frukt av Forsythia suspense, torkad frukt av Tribulus Terrestris L., Sibirisk ginseng (Acanthopanax senticosus (Eleuthero) rot), Salomons sigill (Rhizom och rot från Polygonatum Officinale), frukten från Poncirus Trifoliata Rafinesque och ginseng (Panax) köpt från en lokal marknad. Baserat på teorin om "Yin-Yang" och "Fem element" för traditionell kinesisk medicin (TCM), Forsythia suspensa, Tribulus terrestris L. och Poncirus trifoliata Rafinesque motsvarande "Yang" och sibirisk ginseng, ginseng och Salomons sigill motsvarande "Yin" valdes. De sex medicinska örterna delades återigen upp i de egenskaper som motsvarar de fem elementen (trä, eld, vatten, metall eller guld och jord eller jord). Dessa medicinska örter blandades i samma förhållande för balansen mellan varje element, och Poncirus trifoliata och ginseng motsvarande jorden kombinerades med de andra elementen för att matcha proportionerna (tabell 1). De sex medicinalväxterna extraherades i 30 procent etanol genom ultraljudbehandling (20 kHz, 2 timmar). Efter koncentrering med en rotationsindunstare tillsattes 30% (v/v) butylenglykol och lösningen späddes för att framställa ett extrakt innehållande 1% fast innehåll.
Tabell 1. Sammansättning av blandade örter
2) Cellkulturer och reagens
Humana primära fibroblastceller (HDFn) erhölls från PromoCell (normala humana dermala fibroblaster juvenil förhud, C-12300; PromoCell, Tyskland). Cellkulturer med Dulbeccosmodifierad Eagle's medium high glucose (DMEM high glucose, SH30243.01, Hyclone, Cytiva) innehållande 10 procent (v/v) fetalt bovint serum (FBS, SH30084.03, Hyclone) och 1 procent antibiotikaantimykotiska medel (Anti-anti, 15240-062, Gibco, USA) odlades vid 37 grader i en 5-procentig CO2-inkubator.
3) Cellviabilitetsanalys (MTT-analys)
MTT-analysen mätte cellviabiliteten och bestämde cytotoxiciteten för MHE. Celler såddes med 5 × 103 celler/brunn på en 96-brunnsplatta och odlades i 24 timmar under cellkulturbetingelser. Sedan kasserade vi mediet, tvättade cellerna med en lösning av fosfatbuffrad saltlösning (PBS, 21-040-CV; Corning, USA), placerade cellerna i nya serumfria medier ochbehandlade cellerna med koncentrationer av {{0}}.01, 0.025, {{10}}.05. 0,10, 0,25, 0,50, 0,75 och 1,00 procent av proverna och inkuberade cellerna i 24 och 48 timmar. Sedan tillsatte vi 100 μL MTT-lösning(0,5 procent, 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyl-2H-tetrazoliumbromid) till varje väl och inkuberade cellerna i ytterligare 2 timmar. Efter att ha tagit bort odlingsmediet tillsatte vi 100 μL 100 procent dimetylsulfoxid (DMSO), skakade cellerna i 10 minuter och mätte absorbansen vid 590 nm med en mikroplattläsare (Epoch 2 mikroplattläsare, BioTek, USA).
4) Mätning av pro-kollagen typ I-generering
Koncentrationen av pro-kollagen typ I i cellodlingsmediet mättes med ett kommersiellt tillgängligt ELISA-kit (Procollagen typ I C-peptid EIA Kit, MK101, TaKaRaBio, Japan) enligt tillverkarens instruktioner. Varje prov analyserades i tre replikat.
5) Mätning av mRNA-expressionsnivåer med användning av kvantitativa
Realtidspolymeraskedjereaktion (qRT PCR) Celler såddes vid 1×105 celler/brunn på 6-brunnsplattor. HDFn-celler odlades under 24 timmar; sedan synkroniserades cellerna med DMEM-högglukos utan FBS under 24 timmar. Mediet ersattes med serumfritt medium och behandlades med koncentrationer av 0.05, 0.10, 0.25, 0.5 och 0.75 procent av proverna i 24 och 48 timmar. RNA-extraktion utfördes med HDFn-cellerna med användning av ett RNA-extraktionskit (TaKaRa MiniBEST Universal RNA-extraktionskit, 9767A, Takara Bio, USA), och prover renades enligt tillverkarens protokoll. Det isolerade RNA:t (1 ug) syntetiserades till cDNA med användning av ett TR-reagenskit (PrimeScriptTM RT-reagenskit med gDNA Eraser, RR047A, Takara Bio, USA). Genom att använda en SYRB Green Realtime PCR Master Mix (Power SYBRTM Green PCR Master Mix, 4367659, Applied BiosystemsTM, USA) och QuantStudioTM 3 (QuanStudioTM 3 Real-Time PCR-instrument, A28132, Thermo Fisher Scientific, USA) PCR-maskin i realtid, genuttrycksnivåer standardiserades till hushållsgenen glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenas (GAPDH). Primers som används i denna studie presenteras i tabell 2. Experimenten utfördes i duplikat för tre oberoende upprepningar. Analys av smältkurvanutfördes för varje primeruppsättning.
6) Western blot-analys
Proteinlysat från fibroblastceller extraherades med en lysbuffert (EzRIPA Lysis Kit, WSE-7420; ATTO Corporation, Japan). Bradford-metoden användes för att kvantifiera proteinerna.Lika mängder proteiner blandades med 5X provbuffert (TLP-102-01, TransLab, Korea) och denaturerades vid 99 grader i 10 minuter. Proteinerna separerades med 10 procent SDS-PAGE vid 150 V under 150 minuter och överfördes till PVDF-membran (Clear Blot Membrane, 3322546, ATTO Corporation, Japan). Membranen blockerades med 0,5 procent bovint serumalbumin (BSA, A4503-10G; Sigma) under 1 timme och tvättades med Tris-buffrad saltlösning som inkluderade Tween-20 (10X TBS med Tween 30, TR{ {17}}; Biosesang, Korea) tre gånger; membran inkuberades sedan med primära antikroppar mot MMP-1 (Rekombinant Anti-MMP1 antikropp [EP1249Y], ab134184, Abcam, USA), -Actin (Anti- -Actin (N-tern) och PA0207 (Abfrontier) , Korea) vid 4 grader över natten. Efter sköljning behandlades membranen med anti-kanin IgG-pepparrotsperoxidas (HRP) (Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody, #7074; Cell Signaling Technology, USA) som den sekundära antikroppen i 1 timme. Kemiluminescensdetektion utfördes med ECL Prime western blotting-detektionsreagens (GE Healthcare, USA) och ATTO WSE-6100 LuminoGraph (ATTO Corporation, Japan). För kvantitativ analys analyserades de tagna bilderna med Image programvara (CS analyzer 4, ATTO Corporation, Japan).
7) Statistisk analys
Statistisk analys utfördes med GraphPad Prism version 3.03 för Windows (GraphPad Software, USA). Resultaten presenteras som medelvärdet ± SD för 3 experiment. En oparadElevens t-test användes och p-värden<0.05 were considered statistically significant.
2. Effektutvärdering in vivo
1) Reagens och kosmetiska produkter
Testprodukterna var hudlotion, essence cream och ögonkräm; dessa krämer innehöll 1 procent av MHE som den aktiva ingrediensen som visas i tabell 3.
2) Mänskliga deltagare
Alla volontärer gick med på syftet och innehållet i testet och undertecknade skriftliga informerade samtyckesformulär innan testet påbörjades. De fick inte använda några andra hudvårdsprodukter och testprodukterna applicerades i ansiktet i storleksordningen hud-ögonkräm (endast på kråkfötterna)-essenskräm-lotionkräm. Studien genomfördes i enlighet med riktlinjerna i Helsingforsdeklarationen och godkändes av Koreas National Institute for Bioethics Policy (#P01-202108-13-001).
3) Effektivitetstest
Tjugoen kvinnliga försökspersoner i åldern mellan 45 och 55 (medelvärde ±SD 50,81±2.86) år med normal hud deltog i denna studie. Testprodukter applicerades två gånger dagligen (morgon och kväll) under 4 veckor. Deltagarna besökte forskningscentret varannan vecka och testplatserna mättes i laboratoriet, där den omgivande temperaturen och den relativa luftfuktigheten hölls vid 22±2 grader respektive 50±5 procent. Deltagarna acklimatiserade sig i 20 minuter i laboratoriet efter att ha tvättat sina ansikten och bedömdes för hudhydrering, elasticitet, textur och kråkfötter. Hudhydratisering mättes med användning av en Corneometer® CM825 (C plus K electronic GmbH, Köln, Tyskland); elasticiteten mättes med en Cutometer® MPA 580 (C plus K electronic GmbH, Köln, Tyskland), och texturen och kråkfötterna mättes med en DermaTOP 3D-HE (EOTECH SAS, franska).
4) Utvärdering av biverkningar av huden
Biverkningar kontrollerades varje besök genom frågeformulär och observation. I utvärderingen klassificerades de subjektiva parametrarna som klåda, stickande, kittlande, sveda, sveda,stelhet och åtdragning, och de objektiva parametrarna klassificerades som erytem, ödem, fjäll och papel.
5) Statistisk analys
Data analyserades med SPSS®-mjukvaran. Den statistiska signifikansen av skillnaderna mellan tidpunkter bestämdes med hjälp av analys av upprepade mätningar; ett p-värde<0.05 ansågs statistiskt signifikant. Förändringshastigheten ( procent ) från baslinjevärdet beräknades enligt följande:
Förändringshastighet=((efter behandling-baslinje)/baslinje)×100 procent
