Antioxidant och anti-aging potential för en peptidformulering (Gal2–Pep) konjugerad med gallsyra
May 04, 2023
Huden är mycket känslig för för tidigt åldrandepå grund av yttre stress, därför, i denna studie, en peptidformulering, (galloyl)2–KTPPTTP (Gal2–Pep) syntetiserades genom att kombinera TPPTTP-peptid och gallicsyra (GA). Alla peptider syntetiserades på 2-klorotritylkloridharts med användning av fastfaspeptidsyntes (SPPS), och analyseras på en elektrosprayjonisering (ESI)/quadrupol-time-of-FLFLight (Q-TOF) tandemmasspektroskopi (MS) system. Till en början, Gal2–Pep visade ingen toxicitet under koncentrationen 100mM med en cellöverlevnadsgrad på 88 procent för keratinocyter ochfibroblaster. Dereaktiva syrearter(ROS) rensningsaktivitet av Gal2–Pep var mer stabil jämfört med enbart GA; och efter fyra veckor på rummettemperatur, dessROS-rensande aktivitetförblev högre än 50 procent. Dessutom, peptidformuleringen,Tjej2–Pep uppvisade också en elastashämmande effekt i CCD-1064Skfibroblastceller. Baserat på resultaten av RT-qPCR, bevisades det i denna studie att Gal2–Pep ökade uttrycket av PGC-1a tillförhindraoxidativ stress, och validerade dess potential som enanti-aging medelförbiöka uttrycket avtyp I kollagenoch genom attminska uttrycket av matrismetalloproteinas-1 (MMP1). Defynd erhållna förstärker förslaget att peptidformuleringen som syntetiserats i denna studie skulle kunna användas som ennaturlig antioxidantochanti-aging medelför dess kosmetiska tillämpningar.
Klicka här för att få mer information om Cistanche Anti-Aging-produkter
1. Introduktion
Hudens åldrandeuppstår som ett resultat av den gradvisa minskningen av och eventuellt stopp av celldelningen av keratinocyter och brorsprängningar i huden. Rynkor på huden utvecklas när antalet celler minskar, med den resulterande denaturering av den extracellulära matrisen som leder till torrhet och förlust av elasticitet i huden.1 Skador på intracellulärt mitokondrie-DNAoch en minskning av hastigheten för proteinsyntes inträffar ocksåunder hudens åldrandeprocess.2 Hudens åldrande har två huvudvägarsätt, inneboende och yttre, med ultraviolett (UV) exponering
en stor drivkraft föryttre åldrande. UV-ljuset reagerar med viktiga hudkomponenterinklusive lipider, proteiner och nukleinsyror, för att producera reaktiva syrearter (ROS) som leder till celldöd.3–5 För höga ROS-nivåer leder också till klyvningen ochonormal bindning av kollagen- eller elastinkedjor och främjar uttrycket av matrixmetalloproteinaser (MMP), såsom MMP-1, som bryter ner kollagen, vilket leder till att huden rynkas ochpåskynda hudens åldrande.6,7 Därför antioxidant terapi för att ta bortROS och att aktivera mitokondriell potential har fördelarna att skydda huden från åldrande.
Förutom ROS har elastas en betydande roll i förlusten avhudens elasticitet, som bryter ner elastin, ett viktigt protein iextracellulär matris.8 Elastin, på grund av dess betydande elastiska rekylegenskaper, ger elasticitet till huden, medan elastas harförmågan att klyva elastin och andra proteiner.8 Därför inhiberationen av elastasenzym kan vara en nyckelstrategi för att huden slappnar av förhindra förlust av hudens elasticitet.
I den här studien designade vi ett nytt material som kombinerarperoxisomproliferatoraktiverad receptor-gamma-koaktivator1-alfa (PGC-1a)-härledd peptid TPPTTP och gallsyra (GA)för användning i anti-aging kosmetika. GA är en fytokemikalie som finns i olika frukter och grönsaker, inklusive vindruvor, tomater och grönt te, som är känt för att ha höga antioxidanter och antibakteriella effects.9 Även om GA används i kosmetika- och livsmedelsindustrin på grund av dessa fördelaktiga t.exffects, dess formulering tenderar att vara instabil.10 Vi utvecklade alltså (galloyl)2–KTPPTTP (Gal2–Pep) för att öka stabiliteten hos GA genom att binda den till PGC-1a-härledd peptid TTPTTP.
I denna studie syntetiserade vi en (galloyl)2–KTPPTTP (Gal2– Pep) peptidformulering i konjugering med gallussyra och bekräftaddess potential som en antioxidant och antiaging medel.
2. Material och metoder
2.1. Material
Dulbeccos modifieradeEagle's Medium (DMEM), penicillin/streptomycin, fetalt bovint serum (FBS), fosfat-bufferedsaltlösning (PBS) och trypsin köptes från Gibco (Carls
dåligt, CA). Hydroxibensotriazol (HOBt), diisopropylkarbodiimid (DIC), 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en (DBU),N, N-diisopropyletylamin (DIEA), gallsyra ochN-succinyl-tri-alanyl-pnitroanilid erhölls från Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).L-Forma aminosyror (Fmoc-Lys (Boc)–OH, Fmoc-Thr (tBu)–OH och Fmoc-Pro–OH) köptes från Bead-Tech (Seoul,Korea).
2.2. Syntes av peptider och gallussyrakopplade peptider
Alla peptider syntetiserades på 2-klorotritylkloridharts (200mmolskala, substitutionsvärde¼ 1,46 mmol g 1) med HOBt–DIC-medierad peptidsyntes i fast fas (SPPS).
Peptidsyntes med användning av SPPS-metoden utfördes med lätt modikatjoner som hänvisar till tidigare studier.11–13 2-klorotritylklorid (CTC) harts svälldes i diklor
metan (DCM, 8 ml) under 30 min. Hartset tvättades meddimetylformamid (DMF). Alla reaktioner utfördes vid rumstemperatur. Fmoc-skyddade aminosyraderivat (2 ekvivalenter(motsv.), förFIförsta bundna aminosyran eller 5 ekv. för de andra aminosyrorna) kopplades med antingen DIEA (5 ekv. för en bunden aminosyra) eller HOBt/DIC (6 ekv./5 ekv.) i DMF amedehutför avskyddning av Fmoc med användning av 2 procent (v/v) DBU i DMF (2 gånger, 2 minuter i taget, 8 ml). Och alla steg tvättades 5 gånger med DMF. Slutlig gallussyra kopplades med lysinbundna peptider.Efter kopplingen av gallussyran var hartsetafiltrerade, tvättade,och torkades under högvakuum. Klyvningslösningen (TFA:avjoniserat [DI] vatten: TIS¼ 95 : 2,5 : 2,5, v/v/v procent) behandlades i 2 timmarför att erhålla de råa peptiderna. De råa peptiderna fälldes ut och tvättades tre gånger med kall dietyleter.
Analytisk omvänd fas högpresterande vätskekromatografi(RP-HPLC) utfördes på en Waters 2695 SeparationsModul med en Capcell Pak C18-kolonn (4,6 mm 250 mm, 5mm, Shiseido). Den mobila fasen bestod av 0,05 procent TFA i H2O (mobil fas A) och 0,05 procent TFA i acetonitril (mobil fas B).
Eluering uppnåddes genom att använda en linjär gradient för mobilfas B på 5 procent till 65 procent under 30 min vid aflödeshastighet på 1,0 mL min 1. Peptidtopparna detekterades vid en våglängd av 230 nm. Semi-preparativ RP-HPLC utfördes på ett Waters HPLC-system (Pump 600E, Detector UV-484) med en Gemini RP-C18kolumn (21,2 mm 250 mm, 5mm, Phenomenex). Den mobila fasen bestod av 0,05 procent TFA i H2O (mobil fas A)och 0,05 procent TFA i acetonitril (mobil fas B). Eluering uppnåddes genom att använda en linjär gradient för mobil fas B av7 procent till 22 procent under 15 min vid enlflödeshastighet på 10 ml min 1. Depeptidtoppar detekterades spektrofotometriskt vid en våglängd av 230 nm.
De syntetiserade peptiderna löstes i 5 procent myrsyra i vatten och analyserades på en elektrosprayjonisering (ESI)/quadrupol-time-of-light (Q-TOF) tandemmasspektroskopi(MS)-system (TripleTOF6600, ABSciex, Foster City, CA). Proverna injicerades i Q-TOF-systemet utrustat meden nano-spraykälla vid enlow rate på 1mL min 1. ESI-jonenKällparametrarna var följande: en jonsprayspänning på 1,5 kV, gardingas vid 10 psi och mantelgas vid 5 psi. Spektrat ifullskanningsläge och MS/MS samlades in inom intervalletm/z
100–1200 Da vid en ackumuleringstid av 25 ms per spektrum.Kollisionsenergin rampades från 10 till 80. Resultatetdata förvärvades med hjälp av analytiker TF soware och automatiskttilldelas av tyngdpunkt 80 procent med en minsta topp, brusreducering på 10 procent, medium deisotoping med en 3 procent tröskel, ingen brusreducering och ingen utjämning. De syntetiserade peptiderna identifieradesmed en masstolerans på 0.05 Da och manuellt sekvenserad med en MS/MS-tolerans på 0.01 Da.
2.3. Cellkulturer och viabilitetsanalyser
Mänskliga, vuxna celler med låg kalcium, hög temperatur (HaCaT).och CCD-1064Sk (normal människohudfibroblast) celler varodlas i DMEM med 10 procent FBS och 1 procent penicillin/streptomycin. Cellerna inkuberades vid 37 C i en fuktad luftkammare med 5 procent CO2.För livsduglighetsanalyserna användes cellräkningskit-8 (CCK-8, Dojindo Co. Ltd. Beijing, Kina). HaCaT och CCD-1064Sk-cellersåddes i 96-brunnars mikroplattor (5 103 celler per brunn) och inkuberades vid 37 C i 5 procent CO2 i 24 timmar. Kulturerna exponerades sedan för olika koncentrationer av de syntetiserade peptiderna eller GA och inkuberades vid 37 C i 5 procent CO2 i 24 timmar. Cellviabilitetmättes därefter med en CCK-8 enligt tillverkarens riktlinjer.
2.4. Bestämning av antioxidantaktivitet
2.4.1. DPPH-analys.Antioxidantaktiviteten hos de syntetiseradepeptider och GA utvärderades individuellt med användning av DPPH-analys. DPPH-analyser utfördes efter en tidigare rapporterad
metodik med mindre modikatjon.12,14–16 Först en 0,12 mg ml 1 DPPH-lösning framställdes i metanol, sedan 100mL DPPH-lösning och 100mL av de syntetiserade peptiderna eller GA blandades i olika koncentrationer ({{0}}.1 mM, 0.05 mM, 0.01 mM och 1mM) i 96-brunnsmikroplattor. I en orbital skakningsinkubator, denblandningar fick reagera under 30 minuter vid 37°C C och 100 rpm utanljus. Absorbansen mättes sedan vid 517 nm och antioxidantkapaciteten beräknades.
2.4.2. ROS-rensande aktivitet.
Intracellulär ROS-fångande aktivitet utvärderades med ett 20,70-diklorfluoresceindiacetatkit(DCF-DA, Abcam, USA). HaCaT-celler såddes i 96-brunnars mikroplattor (5 103 celler per brunn) och inkuberades vid 37 C i 24 timmar.AmedEfter inkubation exponerades kulturerna för de syntetiserade peptiderna eller GA (100mM) och inkuberades vid 37 C i 24 timmar. Cellerna exponerades sedan för en 10mM DCF-DA-lösning och inkuberades i 30 min. AmedEfter inkubation tvättades lösningen med PBS. Deceller analyserades med användning av en mikroplattläsare vid excitation och
emissionsvåglängder på 485 nm respektive 530 nm.
figur 1Syntetisk steg- och sekvensbekräftelse av peptider med hjälp av kvadrupoltid avflyg(Q-TOF) masspektrometri: (a) detaljerad syntesprocedur (b) TPPTTP, (c) galloyl–TPPTTP och (d) (galloyl)2–KTPPTTP.
2.5. Mitokondriell membranpotentialanalys
JC-1-färgämne (Thermo Fisher, USA) användes för mitokondriernamembranpotentialanalys (MmP). CCD-1064Sk- och HaCaT-celler såddes i 96-brunnars mikroplattor (5 10 3celler per brunn)
och inkuberade vid 37 C och i 5 procent CO2 i 24 timmar. Aktereh inkubation,kulturerna exponerades för olika koncentrationer av de syntetiserade peptiderna och inkuberades vid 37 C i 5 procent CO2 i 24 timmar.JC-1-färgämne lades till CCD-1064Sk- och HaCaT-cellerna för attproducera a slutkoncentration på 10mM. Amedefter 10 min inkubation tvättades cellerna två gånger med 37 C PBS. Grönt och röttfluorescensmättes med en Varioskan LUXMultimode Microplate Reader (ThermoFisher, USA) vid en excitation (lEx)/utsläpp (lEm) på 475/530 nm och enlEx/lEmav 475/590 nm, respektive.
2.6. Analys av elastashämmande aktivitet
CCD-1064Sk-celler såddes i 6-brunnsplattor och inkuberades vid 37 C i 5 procent CO2 i 24 timmar. Kulturerna exponerades sedan för en koncentration av 100mM av de syntetiserade peptiderna eller GA och inkuberades vid 37 C i 5 procent CO2 i 24 timmar. Celler tvättades med dPBS två gånger och vi samlade upp varje cell med användning av cellskrapa. Aer lägger till 0.2 M Tris–HCl (pH 8.0) med 0,1 procent Triton-X till det uppsamladeceller homogeniserades celler med ultraljudsapparat. Den homogeniserade lösningen centrifugerades under 20 minuter vid 3000 rpmoch 4 C. Sedan, amedjag tar supernatanten, proteinkvanti-katjon utfördes med användning av BCA-proteinanalys. Protein för varjeprovet dispenserades vidFIslutkoncentration på 100mgmL 1, ochN-succinyl-tri-alanyl-p-nitroanilid tillsattes vidslutlig koncentration av 1,6 mM och reagerade vid 36 C i 1 timme.Sedan mättes absorbansen vid 405 nm med användning av en mikroplattläsare.
2.7. RT-qPCR
mRNA-nivåerna av anti-aging-markörer i CCK-1064Sk-cellerutvärderades med RT-qPCR. Totalt RNA samlades in med användning av TRIzol-reagens (Life Technologies, Carlsbad, CA) och omvänt
transkriberas med PrimeScript RT-reagenssatsen (Takara BioInc., Kusatsu, Japan). Ett CFX96-system (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) och iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Labora
tories) användes för RT-qPCR.b-Aktin användes för att normalisera mRNA-nivåerna av typ I-kollagen, MMP-1 och PGC-1a.
2.8. Statistisk analys
Data presenteras som medelvärde standardavvikelse fråntre oberoende mätningar och analyserade med hjälp av Studentst-test, med enp < 0.05 considered to be a signikan ingen skillnad.
Fråga för mer:
E-post:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950
