Antinociceptiv aktivitet av Cistanche Salsa Stolons, som växer i Republiken Kazakstan
Nov 07, 2022
Abstrakt
HerbaCistanche (Cistanchearter) i traditionell kinesisk medicin används för behandling av flera sjukdomar och symtom, inklusive smärta. Syftet med denna studie var att utvärdera den antinociceptiva effekten av hydroetanolextraktet avCistanche salsa(CAMey.) Beck, Orobanchaceae,stolons i djurmodeller av smärta. Kemisk sammansättning avHerba Cistanche analyserades med HPLC-UV. Möss Swiss Webster (25–30 g, n= 6) förbehandlades oralt medHerba Cistanche(10, 30 eller 100mg/kg) och utvärderades i formalintestet och i det capsaicin- eller glutamatinducerade slickningssvaret.KazakiskaHerba Cistanchebestår huvudsakligen avfenylpropanoidglykosider, från vilkenechinakosid, akteosidochtubulosid Bär huvudbeståndsdelarna. När Herba Cistanche administrerades till möss hade det effekt i båda faserna av formalintestet (77 procent aktivitet vid 30 mg/kg för fas 1 och 62 procent aktivitet vid 100mg/kg för fas 2) vilket tyder på smärtstillande ochantiinflammatoriskegenskaper. KazakiskaHerba Cistanchekunde minska djurens slicktid efter injektion av glutamat (81 procent minskning vid 30 mg/kg) och capsaicin (81 procents minskning vid 100mg/kg). Vi drar slutsatsen att fenoler som finns i hydroetanolextraktet avC. salsakan vara ansvarig för dess farmakologiska profil. För att få tillgång till ett råmaterial av god kvalitet för traditionell kinesisk medicin rekommenderade vi att denna kazakiska art standardiseras med echinakosid och acteosid som markörer.
Nyckelord
Herba Cistanche
HPLC-UV
Echinacoside
Akteosid
Tubulosid
Standardisering
Cistanche-extrakt för smärtlindring
Introduktion
Cistanchesalsa(CA Mey) Beck, Orobanchaceae, är en parasitisk växt från Republiken Kazakstan där den används som industriråvara (Sarsenbayev et al., 2011, Grudzinskaya och Gemedzhieva, 2012). Det vetenskapliga värdet av denna ört i traditionell kinesisk medicin relaterar till behandling av njurproblem (varierande från smärta till insufficiens), impotens, kvinnlig infertilitet, sjuklig leukorré, riklig metrorragi och senil förstoppning (Jiangsu New Medical College Dictionary of Traditional Chinese Drugs, 1977, Chinese Academy of Medical Sciences, 1988). Den kemiska sammansättningen av stoloner av andra arter avCistanchehar redan studerats i detalj av kinesiska forskare. Följande fenolföreningar identifierades: echinakosid, tubulosid,akteosid, förutom lignaner,iridoider och en komplex polysackarid (Yong och Tu, 2009, Zhang et al., 2003, Xie et al., 2005, Jiang et al., 2009, Sui et al., 2011, Liu et al., 2013, Zhou et al., 2014).
Shimoda et al. (2009) visade att denna ört besitterhypokolesterolemiskeffekt medan Yang et al. (2013) bestämde dess leverskyddande aktivitet. Nan et al. (2013) rapporteradeantiinflammatoriskaktivitet för dess extrakt. Ett komplexpolysackaridtidigare isolerade från denna växt visade immunmodulerande effekter (Wang et al., 2009).
Även om det finns en ansenlig mängdCistanchestoloner i Republiken Kazakstan, finns det ingen populär användning för denna växt av den kazakiska befolkningen även om grannarna i Kina använder den i stor utsträckning.På grund av det faktum att det finns ett stort problem nuförtiden i samband med substitution/förfalskning av medicinalväxter och det ökande behovet av att standardisera läkemedel för användning i traditionell kinesisk medicin, utformades denna studie för att fastställa den fenolkemiska sammansättningen av denna råväxt material som växer i grannlandet Kazakstan samt att bedöma dess användning somantinociceptivaför att eventuellt lindra smärta – vilket kännetecknar en av dess huvudsakliga användningsområden inom traditionell kinesisk medicin.
Material och metoder
Växtmaterial
Cistanche salsa(CAMey.) Beck, Orobanchaceae,stoloner samlades in i öknen Moinkum, byn Bakanas, i juli 2014 i Almaty. Växtmaterialet identifierades av Dr. G. Sitpayeva från Institute of Botany and Phytointroduction, Ministry of Education and Sciences i Republiken Kazakstan där det deponerades under numret 01-04/306.
Kemisk analys
Stolons avC. salsa(2 g) utsattes för en mikrovågsextraktion. Inledningsvis maldes materialet till 0.001–2.000 mm och placerades sedan i ett hermetiskt kärl för att extraheras i 10 minuter vid 100–1100 grader med etanol 80 procent ( förhållande 1:10). Hydroetanolextraktet (CSHE) analyserades med HPLC-MS. Råextrakt löstes i metanol (9,6 mg/ml) och filtrerades genom en 0,45mm teflonmembran före analysen. En vätskekromatograf HP 1100-seriens modell (företaget Agilent Technologies, Inc., CA, USA), utrustad med en strömmande vakuumavgasare, en fyrkanalig lågtrycksgradientpump och en automatiskinjektor. Fenolföreningar separerades kromatografiskt med en kolonn Zorbax Eclipse XDB-C18, 2.1× 50 mm, fylld med oktadecylsilyl kiselgelpolymer (1.8μ). Kromatografisk analys utfördes med ett mobilt fasflöde på 0.2ml/min, eluentdriftstryck på 175–200 kPa, kolonnugnstemperatur på 30 grader, 2 ml provvolym, gradienteluentmatningsläge: 0–36 min 10 procent A – 90 procent B; 36 min – 100 procent B (eluent A: metanol, eluent B: 0,2 procent myrsyralösning). Detektion utfördes med UV vid våglängderna 254, 334, 350, 410, 450 och 550nm. Jämförelse av de erhållna retentionstiderna, UV- och masspektra med de för referensföreningar användes för identifiering av de kemiska föreningarna i extraktet. Kvantitativ analys utfördes med användning av standardverbascosideoch echinakosid analyserades under samma kromatografiska betingelser. Deras kalibreringskurvor möjliggjorde beräkningen av mängden av varandras fenylpropanoidglykosid i etanolextraktet från denna växt. Metoden validerades inte.
Djur
Schweiziska Webster-möss (20–25g, två månader gammal) användes i denna studie (donerad av Instituto Vital Brazil, Niterói, RJ, Brasilien). Djuren hölls under standardförhållanden (ljus-mörker cykel på 12 timmar, 22 ± 2 grader och 70–80 procent luftfuktighet. Mat och vattenAD libitum). Djur fick endast vatten för att undvika födoinblandning av ämnets absorption 12h före början av experimenten. Acklimatisering till laboratorieförhållandena skedde under minst 1 h före varje test. Alla protokoll genomfördes i enlighet med riktlinjerna för etiska standarder för undersökning av experimentell smärta hos djur och följde de principer och riktlinjer som antagits av National Council for Control ofDjurförsök (CONCEA), godkänd avBiomedical Science Institute/UFRJ, Ethical Committee for Animal Research, och fick numret DFBCICB015-04/16. Alla experimentella protokoll utfördes under ljusfasen. Antalet djur per grupp hölls på ett minimum och enligt regler från CONCEA. Vid slutet av varje experiment dödades möss genom överdosering av ketamin/xylazin.
Behandlingar
I denna studie utvärderades CSHE till 10, 30 och 100 mg/kg. Extraktet löstes i dimetylsulfoxid (DMSO, Fisher Biotech) för att framställa en stamlösning vid 100 mg/ml. PBS användes som utspädningsmedel för framställning av de olika doserna. Lösningar som innehåller 10, 30 och 100mg/kg av hydroetanolextraktet avC. salsavar förberedda. Standardläkemedlen som användes var morfin 2,5mg/kg (Merck, utspädd i fosfatbuffertsaltlösning (PBS)), acetylsalicylsyra 200mg/kg (Sigma Aldrich, löst med 5M av natriumhydroxid(NaOH) i 0,9 procent saltlösning) och kapsazepin 10 nMol per tass. Saltlösning plus DMSO (i samma koncentration som vid den högsta behandlingen med extrakt) gavs till den negativa kontrollgruppen. Alla behandlingar (testade extrakt och standarder) administrerades oralt. Det enda undantaget var kapsazepin som administrerades genom intraplantar injektion.
Formalin-inducerad akut smärta
En lösning av 2,5 procent formalin (37 procent formaldehyd) injicerades (20ul) i plantarområdet på höger baktass på möss 60min efter behandling (hydroetanolextrakt avC. salsaeller acetylsalicylsyra 200 mg/kg eller morfin 2,5 mg/kg) (Matheus et al., 2005). Djuren placerades individuellt i en genomskinlig glaskammare och varaktigheten i sekunder som de tillbringade med att slicka sin tass efter injektion av formalin registrerades och analyserades under två separata perioder, tidig fas-neurogen smärta (0–5 minuter efter injektion) och sen fas-inflammatorisk smärta (15–30 min efter injektion).
Nociception inducerad av capsaicin
Detta test baserades på den metod som beskrivs av Sakurada et al. med vissa modifieringar (Sakurada et al., 1992). Capsaicin (20 ul) C18H27NEJ3(Galena, Campinas, SP) injicerades i plantarområdet på höger baktass på mössen (1,6 ug/tass) en timme efter behandling (hydroetanolextrakt avC. salsaeller kapsazepin 10 nMol/tass). Djuren placerades individuellt i en glaskammare och tassslickningstid(er) registrerades mellan 0 och 5min efter capsaicininjektionen och analyserades sedan.
Glutamat-inducerad nociception
I metoden som beskrivs av Beirith et al. (2002), glutamatlösning i PBS (20 ul) (l-glutaminsyra, Sigma–Aldrich, 3,7 ng/tass) injicerades i plantarområdet på höger baktass på mössen en timme efter behandling (hydroetanolextrakt avC. salsaeller morfin 2,5 mg/kg). Djuren placerades individuellt i en glaskammare och tassslickningstiden (sekunder) registrerades mellan 0 och 15 minuter efter glutamatinjektionen och analyserades sedan.
Statistisk analys
De kemiska data presenteras som medelvärde ± SD för fem experiment. Alla farmakologiska experimentella grupper bestod av minst sex möss. Analys av envägsvarians (ANOVA) följt av Dunnetts test möjliggjorde visualisering av statistisk signifikans mellan grupper med programvaran GraphPad Prism 5.0.pvärden ansågs signifikanta när de var mindre än 0.05 (p < 0.05).
Resultat
C. salsahydroetanolextrakt (två olika spädningar) kromatogram visas i fig. 1. Tabell 1 visar bestämningen av fenolföreningarna tillsammans med deras respektive retentionstider i kromatogrammet.
figur 1. Kromatogram av CSHE.
bord 1. Identifiering av fenylpropanoidglykosider iHerba Cistanche.
Effekt av CSHE på formalin-inducerad akut smärta
I det formalin-inducerade akuta smärttestetCSHE vid 10, 30 och 100 mg/kg kunde minska tassslickandet i den första fasen av testet som kallas neurogen smärtfas, dessa minskningar var 60, 77 respektive 58 procent. Dessutom var de också effektiva för att minska inflammatorisk smärta inducerad under den andra fasen av testet, den procentuella hämningen av inflammatorisk smärta var 42, 46 respektive 62 procent (Fig. 2). Morfin (2.5mg/kg) och acetylsalicylsyra (200mg/kg) gav följande resultat: 55 procent /33 procent och 31 procent /54 procent för den första respektive andra fasen.
Fig. 2. Effekt av CSHE på formalin-inducerad slickning hos möss. Djuren förbehandlades med CSHE 10 mg/kg, 30 mg/kg eller 100 mg/kg (p.o.), acetylsalicylsyra 200 mg/kg (p.o.), morfin 2,5 mg/kg (p.o.) eller vehikel (DMSO). Resultaten presenteras som medelvärde ± SD (n= 6). Envägs ANOVA med Dunnetts multipeljämförelse med fordon, eftertest (*p < 0.05). GraphPad Prism version 5.1.
Effekt av CSHE på glutamatinducerad nociception
CSHE minskade slickandet som inducerades av glutamat vid de tre testade doserna, 10, 30 och 100mg/kg med 76, 81 respektive 53 procent (fig. 3). Morfin på 2,5 procent resulterade i 76 procents minskning.
Fig. 3. Effekt av CSHE på glutamatinducerad nociception hos möss. Djuren förbehandlades med CSHE 10 mg/kg, 30 mg/kg eller 100 mg/kg (p.o.), morfin 2,5 mg/kg (p.o.) eller fordon (DMSO). Resultaten presenteras som medelvärde ± SD (n= 6). Envägs ANOVA med Dunnetts multipeljämförelse med fordon, eftertest (*p < 0.05). GraphPad Prism version 5.1.
Effekt av CSHE på capsaicin-inducerad nociception
För att verifiera om CSHE skulle påverka nociceptiongenom TRPV1-receptorer testades det i en modell av smärta inducerad av capsaicin. Den antinociceptiva effekten genom denna modell observerades för CSHE i de tre testade doserna, med 76, 79 respektive 81 procent (Fig. 4). Capsazepin 10nMol/tass resulterade i 60 procents minskning.
Fig. 4. Effekt av CSHE på capsaicin-inducerad nociception hos möss. Djuren förbehandlades med CSHE 10 mg/kg, 30 mg/kg eller 100 mg/kg (p.o.) eller fordon (DMSO). Resultaten presenteras som medelvärde ± SD (n= 6). Envägs ANOVA med Dunnetts multipeljämförelse med fordon, eftertest (*p < 0.05). GraphPad Prism version 5.1.
Diskussion
Totalt tio fenylpropanoidglukosider identifierades iC. salsa(odlar i Kazakstan) hydroetanolextrakt. Echinakosid (10,98 mg/g), akteosid (9,44 mg/g) och tubulosid B (7,94 mg/g) var huvudföreningarna som identifierades. De erhållna data var korrelerade med tillgänglig litteratur för arter avCistancheväxer i olika regioner i Asien (Zhou et al., 2014, Xie et al., 2005, Jiang et al., 2009). Echinakosid och akteosid är huvudkomponenterna, som ligger till grund för standardisering av de officinala arternaC. deserticolaochC. tubulosa, listade i den kinesiska farmakopén 2005. Vi föreslår att dessa föreningar också kan användas för standardisering avC. salsastoloner från Kazakstan, eftersom de är de viktigaste i det studerade hydroetanolextraktet.
Enligt de farmakologiska resultaten av denna studie är det möjligt att antyda att CSHE är ett effektivt medel mot neurogen smärta och inflammation som observerats i formalintestet. Som vi förstår detC. salsahar aldrig testats i förhållande till dess antinociceptiva verkan. En studie från 2002 medC. deserticola(Lin et al., 2002) har visat att denna växt uppvisade antinociceptiva och antiinflammatoriska aktiviteter när den analyserades i modeller som total vridning, formalin och tassödem. Även om det inte gjordes något försök att undersöka huvudbeståndsdelarna i extrakten som var aktiva, ansåg de butanolextraktet och vattenskiktet som de aktiva. Inte överraskande är dessa lösningsmedel i den polaritetsskala som matchar fenylpropanoidenglykosider som finns iC. salsa. Dessutom fastställde Lin och medarbetare att den antinociceptiva verkan avC. deserticolaextrakten berodde inte på verkan av föreningen i opiatreceptorneller relaterat till immunsystemet. I vår studie visade det fenylpropanoidrika extraktet aktivitet i båda faserna av formalintestet. Den observerade aktiviteten berodde i själva verket på det farmakologiska målet som undersöktes och inte på någon möjlig motorisk förändring, vilket framgår av rota stav-testet. Formalintestresultat indikerar potential för neurogen smärta såväl som smärta inducerad avinflammatoriska mediatorer. Till en början bestämde vi oss för att undersöka den neurogena smärtvägen. Eftersom liknande föreningar från andra arter som tidigare studerats inte visade någon opiatreceptoraktivitet, bestämde vi oss för att testa andra modeller, såsom glutamat- och capsaicinmodeller.
Glutamat är en excitatorisk signalsubstanssom har en viktig roll i att modulera smärta i det perifera och centrala nervsystemet. Denna verkan förmedlas av ligandstyrda jonotropa glutamatreceptorer(iGluRs) och metabotropa glutamatreceptorer. iGluRs kan delas in iN-metyl-d-aspartat (NMDA) och -amino-3-hydroxi-5-metylisoxazol-4-propionsyra (AMPA) (Kolber, 2015). Forskning har visat att när man antagoniserar NMDA- och AMPA-receptorer med ketamin ochkainateen antinociceptionseffekt observeras. Emellertid har antagonister som riktar sig mot dessa receptorer hittills inducerat en avsevärd negativ effekt och av denna anledning har ett nytt forskningsfokus på mGluRs i hopp om att medicin som medieras via denna receptor skulle orsaka mindre biverkningar genomförts (Palazzo et al., 2014). Resultaten av att testa CSHE visade att denna behandling var effektiv för att minska smärta inducerad av glutamat. Det är dock fortfarande okänt om denna effekt förmedlas genom jonotropa och/eller metabotropa receptorer. Morfin är ett av de tillgängliga läkemedel som har effekt på glutamatergisk överföring (Deyama et al., 2007)). Det rapporteras i litteraturen att glutamatreceptoraktivering ökar TRPV1-svar (Szteyn et al., 2015). Av den anledningen är det möjligt att effekten som observerats för CSHE kan bero på aktivitet på TRPV1 och inte nödvändigtvis genom ett direkt svar på glutamatreceptorer.
Nästa steg i denna forskning var att utföra ett tassslickningstest med capsaicin som det algetiska medlet, vilket är en TRPV1-receptoragonist. Resultaten visade att CSHE verkligen minskade smärta genom TRPV1-receptorn.
När det gäller CSHE, nästan i alla testade metoder, kunde vi observera att dosen 30 mg/kg gav bättre resultat än 100 mg/kg. Detta kan bero på att lösningens mättnad leder till utfällda föreningar och att mindre mängder läkemedel är biotillgängliga.
Att bekräfta den etablerade kemiska sammansättningen för det kazakiska extraktet CSHE var ett viktigt steg eftersom de viktigaste beståndsdelarna som finns i det redan har fått sina antinociceptiva/antiinflammatoriska effekter bekräftade på något sätt. Till exempel etablerades echinakosid som en av de aktiva principerna som ansvarar för den antinociceptiva verkan avEchinaceae(Hostettmann, 2003). En tidigare studie av Schapoval och medarbetare (Schapoval et al., 1998) pekade också ut akteosid som en av de huvudsakliga aktiva beståndsdelarna i ett etanolextrakt framställt medStachytarpheta cayennensissom bedömts av tassödem och värmeplatta modeller. Backhouse och medarbetare (Backhouse et al., 2008) ansåg också att akteosid var den aktiva principen förBuddlejaglobosaanvänder flera modeller för smärtbedömning, inklusive formalintest. Nya formuleringar utvecklas nu med hjälp av den senaste kunskapen för att öka stabiliteten och förlänga den antinociceptiva effekten av akteosid (Isacchi et al., 2016).
Slutsats
Tio ämnen av fenolisk natur identifierades i kazakiska stolonsC. salsagenom HPLC/MS-analys. Dessa föreningar kan vara ansvariga för den antinociceptiva aktivitet som observeras i de experimentella modellerna utförda häri. Med hänsyn till att på Kazakstans territorium släktetCistancherepresenteras huvudsakligen av arterC. salsa, kan vi rekommendera skörd och standardisering med echinakosid och akteosid som standardföreningar, för att hämta ett råmaterial av god kvalitet för traditionell kinesisk medicin.
Stöd:
wallence.suen@wecistanche.com 0015292862950
