Antioxidant och stärkelsehydrolyserande enzymer Hämmande egenskaper hos Striga-resistenta gul-orange majshybrider

För mer information kontakta:tina.xiang@wecistanche.com

Abstrakt: De flesta av de hälsofördelar som härrör från spannmål tillskrivs deras bioaktiva föreningar. Denna studie utvärderade nivåerna av de bioaktiva föreningarna ochantioxidantoch stärkelsehydrolyserandeenzymerhämmande egenskaper hos sex pipeline Striga-resistenta gul-orange majshybrider (kodad AS1828-1, 4, 6,8, 9, 11) in vitro. Majshybriderna odlades vid International Institute of Tropical Agriculture (ITA), Nigeria. De bioaktiva föreningarna (totala fenoler, tanniner,flavonoider, och fytat), antioxidant (DPPH" och ABTS rensande kapacitet och reducerande kraft) och stärkelsehydrolyserandeenzymer(-amylas och x-glukosidas)hämmande aktiviteter hos majshybriderna bestämdes genom spektrofotometri. Samtidigt kvantifierades karotenoider med användning av ett omvändfas HPLC-system. Intervallet för de bioaktiva föreningarna var: 11.25-14.14 mg GAE/g (totalt fenol),3.62-4.67 mg QE/g (totalt antal flavonoider), 3.{{1{ {34}}}}.29 mg/g (tanniner),3.66-4.31 procent (fytat),8.92-12.11ug/g (totalt xantofyller),2.{{19 }}.89 ug/g (totalt -karoten) och 3.17-3.77 ug/g(totalt provitamin A-karotenoider). Extrakt av majshybriderna rensade DPPH"(SC50: 9. 07-26.35 mg/mL) och ABTS*(2.{{30}}.68 TEACmmol/g), reducerade Fe3 plus till Fe2 plus (0.25±0.64-0 0,43±0,01 mg GAE/g), och hämmade -amylas och -glukosidas, med IC50-intervall på 26.28-52.55 mg/ml respektive 47.72-63.98 mg/ml. Bland de sex klonerna av majshybriderna hade AS1828-9 högst (s<0.05)levels of="" tannins="" and="" phytate="" and="" the="" strongest="">antioxidantoch stärkelsehydrolyserande enzyminhiberande aktiviteter. Signifikanta korrelationer observerades mellan totala fenoler och följande: ABTS*(s<0.01, r="0.757)," dpph"sc50=""><0.01,r=-0.867), reducing=""><0.05,r=0.633), α-amylase=""><0.01,r=-0.836) and="" α-glucosidase=""><0.05, r="-0.582).Hence," the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids(especially="" as1828-9)="" may="" be="" beneficial="" for="" alleviating="" oxidative="" stress="" and="" postprandial="">

Nyckelord: totala fenoler; totalt flavonoider; tanniner; karotenoider; fytinsyra; alfa-glukosidasinhiberingsanalys; alfa-amylas inhiberingsanalys

1. Introduktion

Tillhandahållande av högavkastande, näringsrika och hälsosamma matgrödor är avgörande för att möta de utmaningar som undernäring och de sjukdomar som är förknippade med den utgör. Därför har olika systematiska tillvägagångssätt, såsom förädling av sjukdomsresistenta basprodukter med förbättrad näringskvalitet, använts i forskningsprogram för växtförädling för att möta kostbehoven hos den snabbt ökande globala befolkningen. Detta har blivit mer nödvändigt med tanke på den drastiska minskningen av kvantiteten och kvaliteten på den globala livsmedelsförsörjningen orsakad av miljöföroreningar, global uppvärmning och utvecklingen av

nya biobränslekällor [1]. I Afrika söder om Sahara har majs (Zea mays L.) visat sig bidra till livsmedelssäkerhet och fattigdomsminskning bland låginkomstfamiljer [2].

Genotyper av gul-orange majs är välkända för sina utmärkta närings- och hälsofrämjande egenskaper på grund av de bioaktiva föreningar de innehåller, inklusive karotenoider, polyfenoliska föreningar, fytinsyra [3-5] och tokoferoler [6]. Men utsikterna till livsmedelsförsörjning och förbättrad näring genom ökad majsproduktion i Afrika söder om Sahara hotas av roten hemiparasitiska växten, Striga hermonthica(Del.)Benth orsakar skördeförluster så höga som 100 procent under allvarliga angrepp på grund av vattenförlust och näringsämnen genom parasitism [7,8]. Följaktligen utgör S. hermonthica en abiotisk begränsning för majsproduktionen i Afrika söder om Sahara, som härrör från ett paradigmskifte från det traditionella systemet för odling av spannmål som involverade förlängda trädaperioder. Ett sådant traditionellt system för odling av spannmål säkerställde att nivån av Striga fröbank i jorden var tolerabel för plantorna9]. För att mildra förlusterna i avkastning och kvalitet på majs som orsakas av S.hermonthica-angrepp är den bästa bekämpningsmetoden att plantera Striga-resistenta majsgenotyper. Denna strategi är lätt att anpassa, särskilt i kombination med andra förvaltningsmetoder [10].

Vår senaste studie visade att Striga-resistenta gul-orange majshybrider innehåller karotenoider, polyfenoler och fytinsyra [3]. Dessa bioaktiva föreningar är kända för att fungera som antioxidanter och undertrycka postprandial hyperglykemi, bland andra hälsofördelar [4,5,11,12]. Bland de bioaktiva föreningarna i apelsinmajskorn rapporterades antioxidanten [13,14] och matsmältningsenzymers hämmande aktiviteter [15] bero på fenolföreningarna, som huvudsakligen existerar i bunden form. Dessutom är fenolföreningar kända för att ha flera andra bioaktiviteter såsom hämning av xantinoxidas och angiotensin-{10}}omvandlande enzymer, vilka är inblandade i patogenesen av gikt respektive renninberoende hypertoni [11] och anti- inflammatoriska, antimikrobiella, anti-cancer, anti-Alzheimer och antiallergiska egenskaper bland andra biologiska aktiviteter[16]. Därför väcker fenolföreningar från kostkällor stor uppmärksamhet från både forskare och konsumenter på grund av deras fördelar för människors hälsa [16].

Syftet med denna studie var att utvärdera nivåerna av de bioaktiva föreningarna och de antioxidant- och stärkelsehydrolyserande enzymernas hämmande egenskaper hos sex pipeline Striga-resistenta gul-orange majshybrider in vitro. Studien testade också anslutningarna bland de bioaktiva beståndsdelarna ochantioxidantoch stärkelsehydrolyserande enzymhämmande aktiviteter av de sex pipeline Striga-resistenta gul-orange majshybriderna.

2. Resultat och diskussion

2.1.Bioaktiva komponenter i sex rörledningar Striga-resistenta gul-orange majshybrider

De bioaktiva komponenterna bestämdes i de sex rörledningarna Striga-resistenta gul-orange majshybrider(AS1828-1(AS1), AS1828-4(AS4), AS1828-6(AS6), AS{{ 8}} (AS8), AS1828-9(AS9), AS1828-11(AS11))i denna studie inkluderade totala fenoler,flavonoider, tanniner, karotenoider och fytinsyra. Nivåerna av totala fenoler, totala flavonoider, tanniner och fytinsyra presenteras i tabell 1. Den totala mängden fenoler varierade från 11,25 till 14,14 mg GAE/g i AS4 respektive AS9; totala antalet flavonoider varierade från 3,62 till 4,67 mg QE/g i AS11 respektive AS6; tanninhalt varierade från 3,64 till 6,29 mg/g i AS1 respektive AS9; och fytinsyrahalten varierade från 3,66 procent i AS6 till 4,47 procent i AS1.

Således innehöll AS9 den högsta (s<0.05)total phenolics="" and="" tannin="" levels,="" while="" as6="" had="" the="" highest="" total="" flavonoids="" content.="" the="" total="" phenolic="" concentrations="" detected="" in="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" are="" higher="" than="" the="" values="" previously="" reported="" in="" yellow="" maize="" hybrids,="" including="" 2.15="" mg="" gae/g[15]and="" 2.08="" mg="" gae/g[17].="" similarly,="" the="" levels="" of="" total="" flavonoids="" detected="" in="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" in="" this="" study="" are="" higher="" than="" the="" 0.93±="" 0.03="" mg="" oqe/g="" recently="" reported="" in="" provitamin="" a="" yellow="" maize="" flour="" [17].="" although="" the="" tannin="" levels="" are="" within="" the="" range(2.1-7.3="" mg/g)previously="" reported="" in="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" [3],="" the="" values="">

jämförelsevis högre än intervallet av kondenserade tanniner (33,70 till 158,55 mg/100g, motsvarande 0,34 till 1,59 mg/g) som rapporterats i pigmenterade majsgenotyper [13].

De högre nivåerna av totala fenoler, totala flavonoider och tanniner som observerades i de sex pipelines Striga-resistenta gul-orange majshybriderna, i förhållande till värden i den befintliga litteraturen för dessa polyfenoler i icke-Striga-resistenta gula majs-genotyper kan kopplas till ev. skillnader i deras genetiska sammansättning [3]. Det är välkänt att biosyntesen av polyfenoler och andra växtsekundära metaboliter ökar i närvaro av stressorer som ett cellulärt försvar och/eller adaptiv mekanism av växten för att motstå ogynnsamma förhållanden [16,18]. Dessutom stimuleras Striga-frögroningen av produktionen av strigolaktoner (växthormoner) i majsplantans rötter, som växten frigör under stress [19]. Det är således möjligt att egenskapen för resistens mot S. hermonthica kan ha uppreglerat biosyntesen av polyfenoliska föreningar i majsen för att motstå parasiten. Detta stöds av en tidigare rapport att resistens mot S. hermonthica efter fastsättning involverade förtjockning av växtcellväggen och ackumulering av många små vakuoler och fenolavlagringar som är tätt färgade i växtcellen [20].

Fenolföreningar är kända för sin antioxidantaktivitet på grund av sina redoxegenskaper, vilket gör att de kan fungera som släckare av singlettsyre, vätegivare och reduktionsmedel [21]. Dessutom rapporterades fenoliska föreningar också inaktivera matsmältningsenzymer, inklusive pankreaslipas, -amylas och a-glukosidas via ospecifik bindning till de individuella enzymerna [22]. Som tidigare rapporterats av Villiger et al. [23] har fenolföreningar en hög affinitet för proteiner via väte och hydrofob bindning, vilket förbättrar deras förmåga att hämma enzymer såsom -amylas och -glukosidas genom denaturering av protein.

The phytic acid contents were comparable (p>0.05)bland de sex rörledningarna Striga-resistenta gul-orange majshybrider. Detta intervall överensstämmer med vår tidigare rapport om fytinsyrahalten i Striga-resistenta gul-orange majshybrider [3]. Fytinsyra har antioxidantaktivitet, förutom sin hämmande effekt mot utvecklingen av njursten [24], samt anti-canceregenskaper [25]. Antioxidantegenskaperna hos de bioaktiva komponenterna, särskilt de fenoliska beståndsdelarna (flavonoider och tanniner) i de Striga-resistenta gul-orange majshybriderna, kan också förhindra och/eller bromsa ned den oxidativa nedbrytningen av vissa endogena näringsämnen i majsen som är mycket benägna att oxidation, såsom omättade fettsyror och vitaminer [16]. Dessutom kan de bioaktiva komponenterna i de Striga-resistenta gul-orange majshybriderna minska hastigheten med vilken vissa toxiska oxidativa produkter bildas, vilket bibehåller näringskvaliteten och förlänger hållbarheten för livsmedelsprodukter [26] gjorda av dem.

The carotenoid content in the Striga-resistant yellow-orange maize hybrids is presented in Table 2. Total β-carotene (9-cis-β-carotene + 13-cis-β-carotene + all-trans-β-carotene) ranged from 2.42 to 2.89ug/g; total xanthophylls (lutein+zeaxanthin) ranged from8.92 to 12.11l ug/g; and total provitamin A carotenoids(β-cryptoxanthin+β-carotene+α-carotene） ranged from 3.17 to 3.77 μg/g,in AS6 and AS9,respectively. There were no significant differences(p>0.05) i karotenoidhalten i den Striga-resistenta gul-orange

majshybrider. Intervallet av karotenoider som erhållits i denna studie bekräftar de som tidigare rapporterats av Alamu et al. för provitamin A bioberikade gul majshybrider [27]. Dessutom var det totala antalet xantofyller högre i värde än de totala provitamin A-karotenoiderna i de Striga-resistenta gul-orange majshybriderna, vilket bekräftar fynden av Ortiz et al. [28].

Karotenoiderna kan ha kompletterat de antioxidant- och stärkelsehydrolyserande enzymhämmande aktiviteterna hos fenolföreningarna i Striga-resistenta gul-orange majshybrider, i enlighet med deras rapporterade bioaktiviteter. Till exempel har karotenoider rapporterats ha antioxidantaktivitet som den huvudsakliga mekanismen bakom deras hälsofördelar [29]. De ger också skyddande effekter mot icke-smittsamma kroniska sjukdomar som cancer[30] och hjärt-kärlsjukdomar [31]. Dessutom rapporterades -cryptoxanthin signifikant minska risken för diabetes typ 2 (T2D) och lindra insulinresistens [32,33].

2.2. Antioxidantaktivitet hos sex pipeline Striga-resistenta gul-orange majshybrider

Antioxidantaktiviteten hos de Striga-resistenta gul-orange majshybriderna (tabell 3) avslöjade att de sex pipeline-klonerna alla uppvisade antioxidantaktivitet genom att ta bort fria radikaler (ABTS grad plus och DPPH*) och reducera ferrijoner (Fe3 plus) till järnjoner (Fe2 plus). Antioxidantaktiviteten varierade avsevärt (s<0.05) among="" the="" hybrids,="" with="" as9="" having="" the="" strongest=""><0.05) free="" radicals="" scavenging="" abilities(7.28="" teac="" mmol/g="" and="" sc50,="" 9.07±="" 0.27="" mg/ml="" for="" abts+="" and="" dpph,="" respectively)and="" ferric-reducing="" power="" (0.43="" mg="" gae/g).="" it="" is="" pertinent="" to="" recall="" that="" as9-9="" also="" had="" the="" highest="" level="" of="" total="" phenolics="" and="" tannins,="" as="" presented="" earlier="" in="" table="" 1.="" the="" dpph°scavenging="" abilities="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" obtained="" in="" this="" study="" (sc50:="" 9.07="" to="" 26.35="" mg/ml)="" are="" more="" potent="" than="" those="" reported="" by="" rodriguez-salinas="" et="" al.="" [13]="" for="" pigmented="" maize="" genotypes(ic50:="" 31="" to="" 52="" mg/ml)="" since="" a="" lower="" sc50="" or="" ic50="" is="" indicative="" of="" a="" stronger="" activity="" [34].="" however,="" vitamin="" c,="" a="" standard="" antioxidant="" with="" a="" lower="" sc50(4.63±0.28="" mg/ml),="" had="" a="" stronger="" dpph*scavenging="" activity="" than="" all="" of="" the="" six="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids.="" similarly,="" the="" abts·+="" scavenging="" activity="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" (2.65-7.68="" teac="" mmol/g)is="" higher="" than="" the="" value="" (294.81±="" 2.23="" umol="" teac/g)reported="" by="" irondi="" et="" al.[17]="" for="" provitamin="" a="" yellow="" maize="" flour.="" the="" stronger="" antioxidant="" activity="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" over="" the="" non-striga-resistant="" pigmented="" maize="" genotypes="" may="" be="" attributed="" to="" the="" increased="" deposition="" of="" polyphenolic="" compounds="" in="" their="" defense="" against="" s.="" hermonthica="" [20],="" which="" may="" have,="" consequently,="" enhanced="" the="" antioxidant="" capacity="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="">

De fria radikalernas rensande förmåga och järn-reducerande kraften hos de Striga-resistenta gul-orange majshybriderna tyder på att de kan vara fördelaktiga för att skydda kroppen från oxidativa angrepp som utfälls av fria radikaler och reaktiva syrearter. Således kan Striga-resistenta gul-orange majshybrider ha en skyddande effekt mot oxidativ skada av biomolekyler i kroppen, inklusive nukleinsyror, proteiner, lipider och kolhydrater [35] och de kroniska sjukdomarna relaterade till oxidativ stress [36] .

2.3. Stärkelsehydrolyserande enzymhämmande aktiviteter hos de sex rörledningen Striga-resistenta bioberikade gul-orange majshybrider

Den stärkelsehydrolyserande enzymerna (-amylas och -glukosidas) hämmande aktiviteten hos de sex pipelines Striga-resistenta gul-orange majshybriderna, uttryckt som IC50 (extraktkoncentration som hämmade enzymaktiviteten med 50 procent), presenteras i tabell 4. IC50 värden för Striga-resistenta gul-orange majshybrider på -amylas och -glukosidas varierade från 26,28 till 52,55 mg/ml och 47,72 till 63,98 mg/ml i AS9 respektive AS4. Bland de sex pipeline Striga-resistenta gul-orange majshybriderna, visade AS9 med de lägsta IC50-värdena för både -amylas och -glukosidas, den starkaste (p<0.05)inhibitory activity="" on="" these="" two="" enzymes.="" interestingly,="" there="" was="" no="" significant="" (p="">0.05) skillnad i IC50-värdena för AS9 och akarbos (ett standardläkemedel mot diabetes) på -amylas, vilket indikerar att de -amylashämmande förmågorna hos AS9 och akarbos var jämförbara. Men förutom den -amylas-hämmande förmågan hos AS9 som var jämförbar med den för akarbos, var de -amylas- och -glukosidasinhiberande aktiviteterna hos akarbosen starkare än de hos Striga-resistenta gul-orange majshybrider. Förmågan hos olika pigmenterade (gula, lila, röda och svarta) majsgenotyper att hämma stärkelsehydrolyserande enzymaktivitet (-glukosidas) rapporterades av Fabila-Garcia et al. [15]. Deras resultat avslöjade att gult majsextrakt hade den högsta glukosidashämmande aktiviteten, uttryckt i procent (69,8 procent), bland majsgenotyperna. Dessutom har Irondi et al. [17] nyligen rapporterade o-amylas- och -glukosidas IC50-värden på 237,12± 2,60 respektive 157,18±1,05 ug/mL för provitamin A-gult majsmjöl. I förhållande till majssilkeextrakt, som rapporterades [37] hämma a-amylas och -glukosidas med genomsnittliga IC50-värden på 218,4 respektive 221,4 ug/mL, hade de sex Striga-resistenta gul-orange majshybriderna en svagare hämmande effekt på c-amylas och x-glukosidas.

Både c-amylas och o-glukosidas är involverade i nedbrytningen av kostkolhydrater. Medan -amylas i tunntarmen hydrolyserar stärkelse -1,4 binder för att frigöra oligosackarider och disackarider, -glukosidas i tunntarmens borstkant fullbordar matsmältningen genom att ytterligare hydrolysera oligosackariderna och disackariderna för att ge absorberbara monosackarider, inklusive glukos och fruktos [38]. Därför är hämningen av dessa två matsmältningsenzymer ett väletablerat terapeutiskt tillvägagångssätt för att lindra postprandial hyperglykemi vid T2D-hantering och en nyckelverkningsmekanism

av många antidiabetiska medel [39], inklusive läkemedel, naturprodukter och funktionell mat. Dessutom hade de Striga-resistenta gul-orange majshybriderna en mer påtaglig hämmande effekt på -amylas än på -glukosidas. Detta mönster av hämning av stärkelsehydrolyserande enzymer har fördelaktiga terapeutiska implikationer och överensstämmer med mönstret som rapporterats i tidigare studier [17,A0]. Således kan de sex pipeline Striga-resistenta gul-orange majshybriderna, särskilt AS9, ha vissa fördelar för att kontrollera postprandial hyperglykemi.

2.4. Korrelationer mellan de bioaktiva komponenterna, antioxidant och stärkelsehydrolyserande enzymhämmande aktiviteter av de sex rörledningen Striga-resistenta gul-orange majshybrider

Bland de bioaktiva komponenterna korrelerade totala fenoler signifikant med ABTS· plus (s<><0.01,r=-0.867), reducing=""><0.05,r=0.633), α-amylase="" ic50=""><0.01,r=-0.836)and α-glucosidase="" ic50=""><0.05,r=-0.582) (table="" 5).="" as="" earlier="" stated,="" lower="" dpph"="" scs0="" and="" enzyme="" ics0="" values="" are="" indicative="" of="" stronger="" scavenging="" and="" inhibitory="" activities="" of="" a="" given="" sample="" on="" dpph*="" and="" enzymes,="" respectively="" [34].="" thus,="" when="" taken="" together,="" the="" negative="" correlations="" between="" total="" phenolics="" and="" dpph·sc50,="" α-amylase="" ic50="" and="" α-glucosidase="" ic50,="" as="" well="" as="" the="" positive="" correlations="" between="" total="" phenolics="" and="" abts="" scavenging="" ability="" and="" reducing="" power,="" suggest="" that="" phenolic="" compounds="" may="" have="" contributed="" majorly="" to="" the="" observed="" antioxidant="" and="" starch-hydrolyzing="" enzymes="" inhibitory="" activities="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="">

3. Material och metoder

3.1. Kemikalier och reagenser

Trolox, quercetin, L-askorbinsyra, gallussyra, ABTS (2,2'-azino-bis-(3-etylbenstiazolin-6-sulfonsyra)), DPPH(2,2-difenyl -2-picrylhydrazyl), -glukosidas från Bacillus stearothermophilus, p-nitrofenylglukopyranosid (PNPG), -amylas, löslig stärkelse och akarbos köptes från Sigma (St. Louis). Analytiska kvaliteter av alla andra kemikalier och lösningsmedel användes.

3.2. Provsamling

Torra fröprover av sex pipeline Striga-resistenta gul-orange majshybrider (kodade AS1828-1,4,6,8,9,11) alla odlade i Saminaka (8 grader 39'E, 10 grad 34' N; höjd på 760 m; årlig nederbörd på 1149 mm; temperaturen på 18.1-37,3 grader; jordtyp, dystriska nitosoler) och Zaria (7 grader 45'E, 11 grader 8'N ; höjd på 622 m; årlig nederbörd på 1076 mm; medeltemperatur på 13.9-35.5 grader; jordtyp, Ferric Luvisols) samlades in från Maize Improvement Program vid International Institute of Tropical Agriculture (IITA), Ibadan, Nigeria. Hybriderna planterades i maj under två säsonger, i en randomiserad komplett blockdesign i tre replikationer, under regnperioden. Proverna maldes till mjöl (0,50 mm siktstorlek) med Perten Laboratory Hammer Mill (3102, USA) och packades hermetiskt i ogenomskinliga provpåsar för ytterligare laboratorieanalyser.

3.3. Beredning1 av provextrakt

För att framställa ett extrakt från Striga-resistenta gul-orange majshybridmjöl, blötlades 1 g av mjölet i 10 ml metanol i ett täckt 50 ml centrifugrör över natten (12 timmar) med intermittent skakning. Därefter centrifugerades blandningen vid 3000 rpm i 10 minuter, och sedan samlades supernatanten (metanoliskt extrakt) upp och lagrades vid -4 grader C tills analys [41].

3.4.Bestämning av totalt fenolinnehåll

Folin-Ciocalteu-metoden beskriven av Singleton et al. [42] användes för att bestämma den totala fenolhalten i Striga-resistenta gul-orange majshybriders mjölextrakt. En del (300 uL) av extraktet dispenserades i ett provrör (i tre exemplar). Därefter tillsattes 1,5 mL Folin-Ciocalteu-reagens (Folin-Ciocalteu-reagens utspädd 10 gånger med destillerat vatten) och 1,2 mL Na2CO3-lösning (7,5 % vikt/volym) och blandningen inkuberades i mörker under 30 minuter vid kl. rumstemperatur. Därefter avlästes absorbansen vid 765 nm mot ett ämne. Den totala fenolhalten beräknades med användning av en gallussyrakalibreringskurva och uttrycktes som gallussyraekvivalent (GAE) i ett mg/g prov.

3.5. Bestämning av totalt innehåll av flavonoider

Protokollet som beskrivs av Kale et al. [43] användes för att bestämma den totala flavonoidhalten i Striga-resistenta gul-orange majshybriders mjölextrakt. Kortfattat, 0,5 ml av extraktet dispenserades i provrör; detta följdes av tillsats av 1,5 ml metanol, 0,1 ml aluminiumklorid (10 procent), 0,1 ml 1 M kaliumacetat och 2,8 ml destillerat vatten. Reaktionsblandningen virvlades och inkuberades vid rumstemperatur under 30 minuter, varefter absorbansen avlästes vid 514 nm. Den totala flavonoidhalten i extrakten uttrycktes som quercetinekvivalent (QE) i mg/g prov.

3.6. Bestämning av Tan1nin-innehåll

Tanninhalten i de Striga-resistenta gul-orange majshybridernas mjölextrakt kvantifierades med den kolorimetriska metoden som tidigare beskrivits av Joslyn [44], med en liten modifiering. En del av provet (0,5 g) dispergerades i 5 ml 1 procent HCl i metanol och lämnades i 15 minuter. Därefter centrifugerades blandningen vid 3{{10}}00 rpm under 10 min. En portion av 0,1 ml av supernatanten dispenserades i provröret innehållande 7,5 ml destillerat vatten, varefter 0,5 ml Folin-Dennis-reagens och 1 ml Na2CO3-lösning (35 procent) tillsattes och volymen höjdes till 10 ml med 0,9 ml destillerat vatten Efter blandning inkuberades reaktionsblandningen i 30 minuter vid rumstemperatur och absorbansen avlästes vid 760 nm. Tanninhalten, uttryckt som garvsyraekvivalent (TAE) i mg/g prov, beräknades från en garvsyrastandardkurva.

3.7. Kvantifiering av karotenoidinnehållet i provet

Karotenoidhalten i Striga-resistenta gul-orange majshybriders mjöl bestämdes genom att använda metoden som beskrivs av Howe och Tanumihardjo [45]. Karotenoider extraherades från mjölet genom att blanda 0,6 g av provet med 6 ml etanol (innehållande 0,1 procent butylerad hydroxyltoluen). Blandningen placerades i ett vattenbad vid 85 grader i 5 min. Därefter förtvålades den störande oljan i blandningen med kaliumhydroxid (80 % vikt/volym) vid 85 grader i ett vattenbad under 5 minuter. Suspensionen blandades sedan med användning av en virvelmaskin och återfördes till vattenbadet i ytterligare 5 min. Den överfördes omedelbart till ett isbad och 3 ml kallt avjoniserat vatten tillsattes. Karotenoidinnehållet från blandningen separerades tre på varandra följande gånger med 3 ml n-hexan genom centrifugering vid 1000 rpm under 10 s. Det övre skiktet av blandningen dispenserades i ett 50 ml koncentratorrör. Den kombinerade hexanfraktionen tvättades tre gånger med avjoniserat vatten, vortexbehandlades och centrifugerades under 10 s vid 1000 rpm. N-hexanfraktionen torkades med användning av en TurboVap (LIV) koncentrator under kvävgas under 25 min. Det torkade extraktet rekonstituerades med metanol/diklormetan (1 mL, 50:50 v/v), och en 100 μL alikvot injicerades i HPLC-systemet för att kvantifiera karotenoiderna. HPLC-systemet (Water Corporation, Milford, MA, USA) bestod av en skyddskolonn, C30 YMC karotenoidkolonn (4,6×250 mm, 3 μM), binär HPLC-pump (Waters 626), autoprovtagare (Waters 717) och en fotodiod array detektor (Waters 2996). Systemet drivs med Empower 1 programvara (Waters Corporation). Den mobila fasen bestod av lösningsmedel A, innehållande metanol:vatten (92:8 v/v) med 10 mmol/L ammoniumacetat, och lösningsmedel B, innehållande 100% metyl-tertiär-butyleter. Gradienteluering utfördes med en flödeshastighet av 1 ml/min under följande förhållanden: 29 min linjär gradient från 83 procent till 59 procent A; 6 min linjär gradient från 59 procent till 30 procent A; 1 min av uppehåll vid 30 procent A;4 min linjär gradient från 30 procent till 83 procent A och en 4-min hållning vid 83 procent . Kromatogram av karotenoiderna genererades vid 450 nm, och de specifika karotenoiderna identifierades och kvantifierades med hjälp av den externa standardmetoden baserad på kalibreringskurvan från rena standarder och jämförelse av absorptionsspektrum och sameluering med standardkarotenoider.

3.8. Bestämning av fytinsyrainnehåll

Metoden enligt Wheeler och Ferrel [46] användes för att bestämma fytinsyrahalten i mjölet. Extraktion gjordes genom att mekaniskt skaka en blandning av 1 g mjöl och 25 ml 3 procent triklorättiksyra (TCA) under 1 timme och suspensionen centrifugerades i 15 minuter vid 35 00 rpm. En 10 ml alikvot av supernatanten blandades med en 4 ml järn(III)kloridlösning och blandningen upphettades i ett kokande vattenbad under 45 min. Den resulterande suspensionen centrifugerades vid 3500 rpm under 15 min och supernatanten dekanterades försiktigt. Därefter tvättades fällningen två gånger genom att dispergera i 25 ml 3 procent TCA, upphettning i ett kokande vattenbad under 10 minuter och centrifugerades vid 3500 rpm under 10 minuter. Fällningsvolymen höjdes till 30 ml med destillerat vatten och blandningen upphettades i ett kokande vattenbad under 30 min. Den varma suspensionen filtrerades med hjälp av Whatman-filterpapper (nr 2), och fällningen tvättades med 60 ml varmt destillerat vatten för att säkerställa fullständig filtrering. Därefter löstes fällningen kvar på filterpapperet med 40 ml het 3,2 M HNO3 i en 100 ml mätkolv. En 0,5 ml alikvot överfördes till ett centrifugrör och späddes med 7 ml destillerat vatten, varefter 2 ml 1,5 M KSCN tillsattes och volymen gjordes till 10 ml med 0,5 ml destillerat vatten. Absorbansen avlästes (inom 1 min) vid 480 nm. Fytinsyrahalten i mjölen beräknades med användning av ett Fe/P-atomförhållande av 4:6.

3.9. 2,2-Azinobis(3-etylbensotiazolin-6-sulfonsyra) Radikal katjon(ABTS· plus )ScaOenging Assay/

Förmågan hos Striga-resistenta gul-orange majshybriders mjölextrakt att avlägsna ABTS" undersöktes genom att använda förfarandet som rapporterats av Reet al. [47]. ABTS* plus arbetsreagens framställdes genom att noggrant blanda lika volymer vattenlösningar av ABTS plus (7 millimol/L) och K2S2Os (2,45 millimol/L) och inkubering av blandningen

i ett mörkt skåp i rumstemperatur i 16 timmar. Efteråt justerades reagensens absorbans till 0.70±0.02 med etanol (95 procent) vid 734 nm. Sedan dispenserades 0,2 ml av extraktet och 2,0 ml av ABTS*-reagenset i provröret, blandades väl och inkuberades vid rumstemperatur under 15 minuter i mörkt tillstånd. Slutligen avlästes absorbansen i en UV-Visible spektrofotometer (Milton Roy Company, USA) vid 734 nm. Mjölextraktens ABTSe ​​plus rensande förmåga beräknades senare från en Trolox standardkurva och uttrycktes som Trolox ekvivalent antioxidantkapacitet (TEAC).

3.10. 2,2-Diphenyl-2-picrylhydrazyl Radical (DPPH") rensningsanalys

Protokollet som rapporterats av Cervato et al. [48] ​​användes för att bestämma mjölextraktens förmåga att ta bort DPPH", med användning av vitamin C(askorbinsyra) som referensantioxidant. Kortfattat, en reaktionsblandning innehållande 1,0 mL olika koncentrationer (8, 16) , 24, 32 mg/mL) av extraktet (eller vitamin C) och 3,0 ml DPPH-gradslösning (60 μM) inkuberades vid rumstemperatur i mörkt tillstånd i 30 minuter. Därefter inkuberades absorbansen avlästes vid 517 nm, och DPPH"fångningsförmågan (procent) av extrakten beräknades och uttrycktes som koncentrationen av extrakt som avlägsnade 50 procent av DPPH"(SC50).

3.11. Reducing Power Assay

Förmågan hos mjölextrakten att reducera Fe3 plus till Fe2 plus testades genom att använda protokollet som beskrivs av Oyaizu [49]. I korthet inkuberades en blandning av extraktet (2,5 mL), 200 mM natriumfosfatbuffert (pH 6,6) (2,5 mL) och 1 procent kaliumferricyanid (2,5 mL) vid 50 grader i 20 minuter varefter 2,5 ml 10% triklorättiksyra tillsattes. Därefter centrifugerades blandningen vid 650 x g under 10 min. En portion om 2,5 ml av supernatanten dispenserades i ett provrör och 2,5 ml destillerat vatten och 1 ml 0,1 procent ferriklorid tillsattes och blandades noggrant, och absorbansen avlästes vid 700 nm. Slutligen beräknades extraktens reducerande kraft och uttrycktes i milligram gallussyraekvivalent per gram prov.

3.12. Alfa-amylasinhibitionsanalys

Alfa-amylas-inhiberingsanalys utfördes genom att använda förfarandet beskrivet av Kwon et al. [50]. Porcin pankreas-amylas (EC3.2.1.1) och löslig stärkelse (substrat) användes i denna analys. Olika utspädningar av mjölextrakten, totalt 500μL och 500μL av 0.02 M natriumfosfatbuffert (pH6,9) med 0,006 M NaCl) innehållande 0,5 mg/ml -amylaslösning blandades och inkuberades vid 37 grader under 10 min. Därefter tillsattes 500 μL 1 procent stärkelselösning i 0,02 M natriumfosfatbuffert och reaktionsblandningen inkuberades vid 37 grader i 15 minuter. Därefter avslutades den -amylas-katalyserade hydrolysen av stärkelse genom tillsats av 1,0 ml DNSA-färgreagens (1 procent 35-dinitrosalicylsyra och 12 procent natriumkaliumtartrat i 0,4 M NaOH). Reaktionsblandningen inkuberades senare under 5 minuter i ett kokande vattenbad, kyldes till rumstemperatur och späddes med 10 ml destillerat vatten. Absorbansen av blandningen avlästes vid 540 nm. Ett referenstest som uteslöt mjölextraktet inkluderades i experimentet. Därefter beräknades den procentuella -amylasinhiberingen enligt följande:

(A540R - A540S)× 100 procent hämning =A540R

där A540R är absorbansavläsningen för referensen; A540S är absorbansavläsningen av provet.

3.13. Alfa-glukosidasinhiberingsanalys

Alpha-glucosidase inhibitory activity of the flours extracts was conducted by adopting the procedure reported by Kim et al. [39], using Bacillus stearothermophillus α-glucosidase (EC3.2.1.20) and para-nitrophenylglucopyranoside (PNPG) as the substrate. Five (5)units of an aliquot of α-glucosidase were incubated with 20 μg/mL of the extract for 15 min. The hydrolytic reaction was initiated by adding 3 mM PNPG prepared in 20 mM phosphate buffer, pH6.9, which served as a substrate. The hydrolytic reaction was allowed to proceed for 20 min at37°C, after which 2 mL of 0.1 M Na>CO: tillsattes för att avsluta reaktionen. Ett referenstest utan mjölextraktet inkluderades i experimentet. Absorbansen av den gula p-nitrofenolen frisatt från den -glukosidaskatalyserade hydrolysen av PNPG avlästes vid 400 nm och den procentuella o-glukosidasinhiberingen beräknades så här:

(A400R - A400S)× 100 procent hämning =A400R

där A400R är absorbansavläsningen för referensen; A400Sär absorbansavläsningen för provet.

3.14. Dataanalys

Data erhållna i denna studie (från tredubbla bestämningar) uttrycktes som medelvärden ± standardavvikelse (SD). Med hjälp av SPSS statistiska mjukvarupaket (16:e versionen) utfördes en envägsanalys av varians (ANOVA) på data, och medelvärdena jämfördes med Tukeys post hoc-test på p.<0.05. the="" associations="" between="" the="" bioactive="" components,="" the="" antioxidant,="" and="" the="" starch-hydrolyzing="" enzymes="" inhibitory="" activities="" were="" calculated="" using="" the="" pearson="" correlation="" test.="" column="" representations="" of="" the="" mean="" values="" were="" done="" using="" graphpad="" prism="" (5th="">

4. Sammanfattningar

De sex pipeline Striga-resistenta gul-orange majshybriderna innehöll viktiga bioaktiva beståndsdelar (totalt antal fenoler, totala flavonoider, tanniner, fytinsyra och karotenoider). Deras extrakt uppvisade stark antioxidantaktivitet och hämmade stärkelsehydrolyserande enzymer (-amylas och -glukosidas). Bland de Striga-resistenta gul-orange majshybriderna hade AS1828-9 den mest potenta antioxidant- och stärkelsehydrolyserande enzymhämmande aktiviteten. Signifikanta korrelationer observerades mellan det totala fenolinnehållet och ABTS* plus , DPPH-grads rensande förmåga, reducerande kraft, -amylas och -glukosidashämmande aktivitet hos de Striga-resistenta gul-orange majshybriderna. De antioxidant- och stärkelsehydrolyserande enzymernas hämmande aktiviteter tyder på att de Striga-resistenta gul-orange majshybriderna (särskilt AS1828-9) kan vara fördelaktiga för att förebygga och/eller lindra oxidativ stress och postprandial hyperglykemi.