Entydig NMR strukturell bestämning av (plus)-katekin—laccas dimeriska reaktionsprodukter som potentiella markörer för druv- och vinoxidation

För mer information, kontakta:tina.xiang@wecistanche.com

Abstrakt:( plus )-Catechin—laccaseoxidationdimera standarder hemi-syntetiserades med användning av laccase från Trametes. Versicolor är en vatten-etanollösning vid pH 3,6. Åtta fraktioner motsvarande åtta potentiella dimera oxidationsprodukter detekterades. Fraktionsprofilerna jämfördes med profiler erhållna med två andra oxidoreduktaser:polyfenoloxidasextraherad från druvor och laccas från Botrytis cinerea. Profilerna var mycket lika, även om vissa mindre skillnader antydde möjliga skillnader i reaktiviteten hos dessa enzymer. Fem fraktioner isolerades sedan och analyserades med 1D och 2D NMR-spektroskopi. Tillsatsen av spår av kadmiumnitrat i proverna solubiliserade i aceton ledde till helt upplösta NMR-signaler av fenoliska protoner, vilket möjliggör en entydig strukturell bestämning av sex reaktionsprodukter, en av fraktionerna som innehåller två enantiomerer. Dessa produkter kan vidare användas som oxidationsmarkörer för att undersöka deras närvaro och utveckling i vin under vinframställning och vinlagring.

Nyckelord: oxidationsmarkör;( plus )-katekin; fenoliska NMR-signaler; lackas; kadmiumnitrat; polyfenoloxidas

Klicka för att få mer information

1. Introduktion

Polyfenolerär en familj av kemiska föreningar som är allmänt förekommande i naturen. De finns i betydande mängder i te [1], kakao [2,3], blåbär [4], vindruvor [5l och jästa produkter som vin [6]. Eftersom de är primära oxidationsmål J7,8], utvecklas polyfenolernas kemiska strukturer kontinuerligt. Dessa förändringar påverkar de organoleptiska egenskaperna hos många typer av livsmedel; de är ansvariga för fenomen som matbrynning [9]och modifieringar av vins sensoriska egenskaper [10,11. Inom enologin sker detta oxidationsfenomen i druvor eller viner. När det gäller enzymatisk oxidation är de huvudsakliga enzymerna som ansvarar för brunfärgning oxidoreduktaser, mer exakt,polyfenoloxidasförekommer i druvor och laccas producerade av Botrytis cinerea [12].

Enzymatiskoxidationförekommer främst i druvmust, men ytterligare vinbrynning kan bero på kemiska oxidationsreaktioner |7,13]eller på Botrytis cinerea laccas som kan vara mycket stabil under vinlagring14. Två enzymatiska oxidationsaktiviteter kan förekomma på fenoliska substrat: monofenoloxidasaktivitet kännetecknad av hydroxylering av en existerande hydroxylgrupp intill position och difenoloxidasaktivitet motsvarande oxidationen av orto-dihydroxibensener till orto-bensokinoner.

Enligt Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB) katalyseras dessa enzymatiska aktiviteter av EC1-klassenzymer som motsvarar oxidoreduktaser. Bland dem är de tre huvudklasserna av oxidoreduktaser som katalyserar polyfenoloxidation EC1.14.18.1 (monofenolmonooxygenas), EC1.11.1 (peroxidas/POD) och EC1.10.3 (oxidoreduktaser som verkar på difenoler).

Denna sista klass är uppdelad i olika underklasser, och två av dem verkade särskilt intressanta för denna studie: EC1.10.3.1 (polyfenoloxidas/PPO) och EC1.10.3.2 (lackas) (se tilläggsmaterial Figur S1).

PPO, laccas och peroxidas är de oxidoreduktaser som huvudsakligen ansvarar för brunfärgning under bearbetning av druvor [13]. Browning orsakad av POD är försumbar i frukter men kan öka nedbrytningen av fenoler i kombination med PPO[15]. PPO finns naturligt i druvor och kan katalysera oxidationen av monofenoler till katekoler och av katekoler till bruna pigment [8,13,16]. Laccaser, som förekommer i Botrytis-infekterade druvor, har ett bredare verkansspektrum|17|eftersom de kan katalysera oxidationen av många olika substrat. De viktigaste laccasernas oxidationsmål förblir 1-2 och 1-4 dihydroxibensen.

I vin kan bensokinon som produceras genom oxidation (PPO eller laccaser) lätt genomgå ytterligare reaktioner beroende på deras redoxegenskaper och elektroniska affiniteter [15]. De kan antingen fungera som elektrofiler och reagera med aminoderivat [18] eller fungera som oxidanter och reagera bland annat med fenolsubstrat. Beroende på deras kemiska konformation (kinon eller semi-kinon), kan bensokinon leda till olika oxidationsreaktionsprodukter. Vid ett neutralt pH kommer (plus)-katekin att oxideras till kinon i A-ringens position C5 eller C7 och leda till bildningen av sex möjliga dimera isomerer, vilket innebär en koppling mellan B-ringens position C2', C5' eller C6' på den övre katekinenheten och A-ringens position C6 eller C8 på den nedre enheten [19,20]. Dehydrodicatechin är en välkänd produkt av denna koppling [21]. Strukturernas märkningspositioner visas i figur 1. Under sura förhållanden kan semi-kinonformer också finnas på B-ringen (position OH3'eller OH4') och leda till fyra möjliga dimera isomerer [20,22] med den övre katekinenheten och A-ringen på den nedre enheten (position C6 eller C8). Enzymatisk oxidation av katekiner undersöktes i tidigare studier [22,23], och de associerade oxidationsprodukterna karakteriserades av HPLC [24], men mer sällan isolerade och aldrig helt karakteriserade av NMR.

Syftet med detta arbete var först att UHPLC-MS jämföra profilerna för dimera(plus)-katekinoxidationsprodukter i närvaro av tre oxidoreduktasextrakt, dvs. PPO extraherad från druvor, laccas från svampen Botrytis cinerea som finns i botrytiserade söta viner [14], och laccase från Trametes Versicolor.

Det andra målet var att hemisyntetisera och karakterisera strukturerna hos vissa dimera oxidationsprodukter genom NMR-spektroskopi erhållen med laccas från Trametes Versicolor.

2. Resultat och diskussion

2.1. Jämförelse av Dimeric Reaction Products-profiler med tre olika oxydoreduktaser och (plus)-katekin

( plus )-Catechin oxiderades först i närvaro av laccas från Trametes Versicolor vid pH 3,6 i modellvinlösningen. Efter separation av den dimera fraktionen från kvarvarande (plus)-katekin och andra polymerfraktioner samlades åtta huvudfraktioner upp och analyserades med UHPLC-UV-MS, noterade från N1 till N8 i ökande retentionstidsordning (tabell 1). Elektrospraymasspektra i positivt läge visade jontopparna [M plus H] plus vid m/z 579 för N1 till N6, hypotetiskt motsvarande en dimer bildad av en enkelbindning mellan två katekinenheter, och [M plus H] plus vid m/577 för N7 och N8, vilket hypotetiskt antyder bildandet av en ytterligare länk.

Dessa åttaoxidationfraktioner observerades potentiellt efter kemisk depolymerisation av en tanninfraktion i tidigare arbeten [25,26] och kan möjligen vara desamma som de som redan beskrivits av Guyot et al. [20], även om de experimentella förhållandena var något annorlunda. I denna tidigare studie användes faktiskt ett orent PPO-extrakt vid pH3 och 6 för att erhålla åtta fraktioner. I föreliggande studie jämfördes tre olika enzymer vid pH 3,6 i modellvinlösningen. LC-MS jämförande analys av de viktigaste oxidationsfraktionerna som erhållits med de tre olika enzymerna (laccase från Trametes Versicolor, lac-case från Botrytis cinerea och polyfenoloxidas extraherat från druvor) presenteras i tabell 2. För var och en av de åtta fraktionerna, retentionstiderna var nästan identiska med de olika enzymerna och liknande m/z bestämdes med MS-analysen. Dessa resultat stöder hypotesen att samma fraktioner erhölls för varje enzym, innehållande produkter med strukturer liknande de som hypotesen av Guyot et al. [20]. Lopez-Serrano och Ros Barcel6 [27] utförde också en jämförande studie av (plus)-katekinoxidationsprodukterna med två olika enzymer: peroxidas och polyfenoloxidas, båda extraherade från jordgubbar. De drog slutsatsen att produkterna som erhölls med de två enzymerna var kvalitativt desamma. En ytterligare förening benämnd N4' med m/z=578 Th och Rt=15.66 min observerades i experiment med laccas från Botrytis cinerea och extraherad PPO men inte med laccas från Trametes Versicolor, vilket tyder på möjliga skillnader i reaktivitet för dessa enzymer.

2.2. Studie och optimering av fysikalisk-kemiska parametrar på 1H-NMR fenoliska och alifatiska OH-signaler

Den strukturella karakteriseringen av procyanidindimerer kan erhållas genom NMR-analys. I synnerhet kan den exakta länkpositionen mellan enheter bestämmas med hjälp av HMBC- och/eller ROESY-korrelationsspektra [28,29] (figurerna S2 och S3). I fallet med en bindning av etertyp (COC) är tilldelningen av hydroxylsignalprotonerna nödvändig. Det kan också vara avgörande i fallet med CC-länkar om några alifatiska eller aromatiska protoner överlappar eller om några nyckelkorrelationer saknas. Men även i ett aprotiskt lösningsmedel uppträder hydroxylprotonerna hos polyfenoler ofta som breda signaler från vilka ingen strukturell information kan erhållas [30]. Denna fråga åtgärdades preliminärt genom tillägg av spår av

Cd(NO3)2 i provlösningarna. Faktum är att 'H breda signaler från OH-grupper beror på det intermolekylära utbytet mellan dessa OH-protoner och andra protoner i lösningsmedlet eller det lösta ämnet. Genom att reducera intermolekylära bindningar kan närvaron av kadmiumnitrat i proverna minska dessa utbyten, vilket förbättrar skärpan hos OH-protonsignaler.

2.2.1.Effekt av kadmiumtillsats

Efter frystorkning solubiliserades de fem fraktionerna N2, N3, N4, N6 och N8 i aceton-dg. Sedan förvärvades 1D proton NMR-spektra vid 25 grader före (Figur 2A) och efter tillsats av små mängder kadmium (Figur 2B). I ren aceton-d. uppträdde de fenoliska OH-protonerna i alla fraktioner som breda toppar. Efter tillsatsen av kadmium visade dessa protoner högupplösta signaler i fallet med fraktionerna N6 och N8, medan för fraktionerna N2, N3 och N4 var signalerna bara lite skarpare. Det bör också nämnas att ökning av Cd-innehållet inte hade någon effekt på OH-signalupplösning, eftersom ingen skärpa eller bredd av topplinjebredden observerades när successiva små mängder Cd tillsattes till proven (data visas ej).

Högupplösta fenoliska OH-signaler från produkterna N2, N3 och N4 uppnåddes tack vare ytterligare torkning och resolubilisering (Figur 2C, D).

Skillnaden i beteende vid Cd-tillsats mellan fraktionerna kan förklaras av styrkan hos molekylära interaktioner: starkare i fallet med N2, N3 och N4 jämfört med N6 och N8, ett ytterligare steg är nödvändigt för att bryta dessa bindningar.

Detta ytterligare steg kan vara nyckelsteget när man använder Cd för att erhålla högupplösta fenoliska OH-signaler i alla situationer, oavsett ursprunget för proverna, syntesreaktionen eller de naturliga polyfenolprodukterna.

Ett tidigare arbete som behandlar den entydiga strukturella karaktäriseringen avpolyfenoldimerer som använder högupplösta OH-fenoliska NMR-signaler tack vare kadmiumnitrattillsats publicerades 1996[30]. Såvitt vi vet har ingen annan forskningsartikel som använder denna metod publicerats sedan dess. Andra undersökningar genomfördes därefter för att nå detta mål, antingen genom tillsatser av pikrinsyradosering [31] eller genom att använda en låg upptagningstemperatur [32]. Detta kan förklaras av det ytterligare steget som krävs för att få en avgörande effekt på OH-toppskärpan med Cd-tillsats, som beskrivits ovan. Kadmium verkar dock vara av stort värde, eftersom högupplösta signaler kan erhållas utan att man behöver lägga till exakta mängder, i motsats till pikrinsyra eller NMR-spektraförvärvning vid låga temperaturer.

2.2.2. Temperaturens inverkan

En minskning av temperaturen från 25 grader C till 15 grader hade ingen inverkan på skärpan hos fenoliska OH- eller alifatiska OH-signaler. Ändå tillät förskjutningar nedåt av utbytbara protontoppar oss att separera några överlappande fenoliska och alifatiska OH-signaler, vilket gjorde deras identifiering mer uppenbar (Figur 3). Genom att sänka temperaturen reducerades protonutbyteshastigheten och man kan förvänta sig skarpare alifatiska OH-toppar [31]. Temperaturen på 15 grader är uppenbarligen inte tillräckligt låg för att erhålla välupplösta alifatiska OH-signaler. Men det gjorde det möjligt för oss att tydligt identifiera resonansen för två alifatiska OH-protoner i proverna N3 och N6 och av en i prov N8. Spektrum av prov N2 uppvisade också två alifatiska OH-protonsignaler, som var mer särskiljbara vid 25 grader C än vid 15 grader (Figur 2E). När det gäller provet N4 var signalerna som härrörde från alifatisk OH endast delvis synliga i spektra, oavsett om temperaturen var inställd på 25 grader eller till 15 grader C, på grund av ihållande överlappning (Figur 2E).

2.3. Strukturell karaktärisering av de dimeriska standarderna—NMR-spektrumanalys

NMR-spektra för fraktionerna N2, N3, N4, N6 och N8 visade att oxidationsprodukterna var av hög renhet eftersom signalintensiteterna för andra detekterade föreningar var mindre än 10 procent jämfört med dessa produkters.

I alla spektra kan fyra lH kemiska skiftregioner som är typiska för katekinenheter urskiljas (Figur 2C): signaler från de alifatiska protonerna i pyranringar (C-ringar) finns i området från 2,3 till 5.0 ppm, och de hos de aromatiska signalprotonerna i resorcinolringar (A-ringar) och katekolringar (Bringar) från 5,5 till 6,3 ppm respektive 6,3 till 7,1 ppm. OH-fenolsignalerna för både A- och B-ringar uppträdde från 7,1 till 10 ppm. NMR-spektra för båda fraktionerna visade närvaron av distinkta signaluppsättningar av katekinenheter i ett konstant intensitetsförhållande: två uppsättningar signaler observerades i spektra för fraktionerna N2, N3, N6 och N8 i enlighet med närvaron av dimerer, och fyra uppsättningar i N4-spektra, vilket kan motsvara en tetramer, två dimerer eller en blandning av olika oligomerer, det vill säga en trimer plus en monomer. För att bestämma graden av oligomerisering av produkterna närvarande i fraktion N4, utfördes ett 'H DOSY-experiment med användning av en blandning innehållande alikvoter av både fraktionerna N4 och N2. Diffusionskoefficienterna för alla signaler visade liknande värden (Figur 4), vilket indikerar närvaron av två dimerer av katekin i fraktion N4.

Tack vare de fullständigt upplösta OH-fenolsignalerna som ger tillförlitliga kvantitativa resultat, kan typen av koppling mellan katekinenheterna härledas direkt från toppytaintegration. Sålunda, för båda fraktionerna, N3 och N6, indikerade bristen på en OH-fenol (som tillhör antingen resorcinol eller en katekolring) och avsaknaden av en aromatisk resorcinolproton en interflavanisk koppling (IFL) av etertyp, vilket innebär en opposition i ett A eller B-ring och en C6- eller C8-position i en A-ring. I fallet med prov N2 saknades två aromatiska protoner, en av en B-ring och en av en A-ring, vilket innebär en CA-CB IFL. 1D 'H-spektrumet för fraktion N4 visade att två protoner av B-ringen saknades, såväl som två protoner av A-ringen. Bindningarna mellan dimerenheterna i fraktion N4 är alltså båda av CC-typerna. Spektra för fraktion N8 var helt olika från de fyra andra. Vissa signaler var typiska för katekinenheter, i vilka tre OH-fenoler, en aromatisk A-ring och en B-ringproton saknades, såväl som en alifatisk OH. Å andra sidan är vissa andra NMR-signaler atypiska för en katekinenhet: metylen med avblindade 13C kemiska skift (~40 ppm) och en ketongrupp (~192 ppm).

Protonspinnsystemen för C-, A- och B-ringar bestämdes med användning av både 'H 1D och 1H 2D TOCSY-spektra (ej visat). Två ABMX C-rings spinnsystem (typiskt för katekin) observerades i spektra av fraktionerna N2, N3, N6 och N8, och fyra för fraktion N4. I spektra av fraktionerna N2, N3, N6 och N8 tilldelades två metakopplade dubbletter (J~2Hz) och en singel i den aromatiska A-ringregionen till A-ringprotonerna i den icke-kopplade katekinenheten. och till A-ringens restproton av den av C6-eller C8-länkade katekinenheten. I spektra av N4, på grund av närvaron av två dimerer, detekterades fyra metakopplade dubletter och två singletter och tilldelades enligt beskrivningen ovan. B-ringprotonsystemen var också lätta att bestämma från dessa spektra och gjorde det möjligt för oss att identifiera två ABM-protonspinsystem för dimererna av fraktionerna N3 och N6, medan ett ABM- och ett AB-protonspinsystem detekterades för dimer N2, och ett ABM- och ett AM protonspinsystem för dimer N4. Dimeren N8 uppvisade endast ett ABM B-rings spinnsystem som är typiskt för en katekinmonomer.

2.3.1.Bestämning av A-ringpositionen för IFL för dimererna av fraktionerna N2, N3, N4 och N6

Etableringen av bryggan belägen på A-ringen av dimerer (dvs. C6A- eller C8A-position) kräver tilldelning av den kvarvarande HA-protonen i den CA-kopplade katekinenheten. Tack vare de högupplösta fenoliska OH-signalerna var en enkel utgångspunkt identifieringen av de två OH-fenolprotonerna i de A-ringbundna enheterna, dvs. A-ringen som

had one isolated lHspin. This may be achieved using lH-13C long-range correlations, as illustrated in Figure5. The OH5A has readily been identified thanks to a correlation with the C4aC. This quaternary carbon is indeed characterized by both its chemical shift at~100 ppm and a long-range correlation observed with the H4Cprotons. OH5A also correlated with two other carbons∶ the most deshielded （δ>145 ppm） was obviously C5A, while the other (6>125 ppm) was C6A, which also showed a correlation with the other OHA phenol proton,i.e., OH7A. This latter correlated with two other carbons: a deshielded quaternary carbon（δ>145ppm） and a more shielded carbon（δ>125 ppm） som lätt hänfördes till C7A respektive C8A. När väl C6A och C8A är tilldelade kan den kvarvarande HA-protonen direkt tillskrivas HSQC-spektra. Det visade sig således att denna kvarvarande HA-proton var H6A för alla fraktioner N2, N3, N4, N6. IFL mellan katekinenheter antydde således en C8A-position för alla dimerer.

2.3.2. Fastställande av B-ringens position för IFL

Dimerer av fraktionerna N2 och N4. Spektra för fraktion N2 visade två olika typer av B-ring protonspinsystem: en AMX motsvarande B-ringen i den icke-länkade enheten, och en AM med en kopplingskonstant på cirka 8 Hz, karakteristisk för H6'B och H5' B av en C2'B-kopplad enhet. Kopplingen mellan enheterna av N2-dimeren är således C2'B-C8A. NMR-spektra för fraktion N4 visade också olika B-spinnsystem: två AMX, motsvarande den icke-länkade B-ringen, och två AXspin-system, båda uppvisar kopplingskonstanter på cirka 2 Hz, som är karakteristiska för H2'B och H6' B-protoner av C5'B-kopplade enheter. Närvaron av långdistans-H/13C-korrelationer mellan H6'Band C8A, som observerades i HMBC-spektra för de två dimererna, är i enlighet med en C5/'B-C8A-koppling (Figur 5).

Dimerer av fraktionerna N3 och N6. Spektran för fraktionerna N3 och N6 visade närvaron av två AMX B-ringprotonsystem och avsaknaden av en OH-fenolsignal. Eftersom alla OHA-fenoliska protoner i dimerenheterna identifierades (som beskrivits ovan), kan den saknade OH-fenolsignalen vara antingen den för OH3'B eller den för OH4'B.

OH-positionen (3'B eller 4'B) kan lätt bestämmas genom ROE-korrelationer med H2'Bor H5'B, respektive, eller genom att använda långdistans-HMBC-korrelationer som illustreras i figur 5.

Tillskrivningen av resterande OH i B-ringarna utfördes lätt med användning av antingen långdistans-HMBC- eller ROESY-korrelationer, som illustreras i figur 5. I fallet med dimer N3 observerades en ROE-korrelation mellan H5'B och kvarvarande OH 'B av katekinenheten länkad genom dess B-ring. Denna OH identifierades sålunda som OH4'B. I fallet med fraktion N6 tilldelades resterande OH'B till OH3'B, eftersom en ROE-korrelation observerades mellan denna OH och H2'B. HMBC-korrelationerna på lång räckvidd är i enlighet med dessa attributioner. Kopplingspositionerna för dessa två dimerer bestämdes sedan enligt följande: CO3'B-C8A och CO4'B-C8A för N3 och N6. respektive.

Fraktion N8. Spektrumanalys av dimeren N8 visade att en enhet av denna dimer är katekinet med två länkpositioner, en A-ringen, en vid C8A och den andra vid C-O7A-positionen, eftersom protonerna H8A och OH7A är saknas. Den andra enheten av denna dimer uppvisade singulära spektrala egenskaper, vilket indikerar förlusten av B-ringens aromaticitet och närvaron av flera länkpositioner på både B- och C-ringar.

'H NMR-signalerna som härrörde från B-ringen var två dubletter vid 2,49 och 2,71 ppm, uppvisande en geminal koppling av ~15 Hz (12,03 ppm) typisk för en metylengrupp och en singlett vid 6,38 ppm härrörande från en etenisk proton. Eftersom dessa metylen- och etylenprotoner inte var kopplade, är de sannolikt i positionerna 2'B och 5'B. HIMBC-spektrumet visade alla korrelationer, vilket möjliggjorde noggranna tillskrivningar av dessa B-ringkol, som illustreras i figur 5. H2C för denna enhet gav tre korrelationer med B-ringkol: en är metylenkolet vid ~45 ppm, som alltså tillskrevs till C2'B, och de återstående två, med kol som resonerar vid ~90 ppm och ~162 ppm, vilket kan tilldelas C1'B och C6'B.H5'B gav endast starka 3J-korrelationer med två kvartära kol i denna B-ring : den ena är det kol som tidigare tilldelats C3'B(~95 ppm), och det andra, som gav resonans vid ~90 ppm, kunde således tillskrivas C1'B. Kolet vid ~162 ppm härleddes sedan till C6'B.

Närvaron av en alifatisk OH (~5,8 ppm) vid C3'B-positionen (~95 ppm) bestämdes genom dess ROE-korrelation med båda H2'B-protonerna. Dessutom gav OH3/B HMBC-korrelation med ett kvartärt kol vid ~192,5 ppm, karakteristiskt för en ketongrupp i C4'B-positionen.

Avskärmningen av denna C1'B på cirka 40 ppm är i enlighet med en förlust av B-ringens aromaticitet. Vidare överensstämmer avsaknaden av OH vid C7A-positionen för den andra enheten med en eterbindning C1'BO-C7A.

NMR-data visade att C-ringen i denna enhet inte har något OH3C. Närvaron av en C3C-O-C3'B-bindning är i överensstämmelse med skärmningen av C3C på cirka 1,5 ppm såväl som den kemiska förskjutningen av C3'B som är typisk för hemiketalkol (95 ppm).

Sammantaget tillåter NMR-spektraldata oss att dra slutsatsen att denna dimer motsvarar dehydrokatekin A som beskrivits tidigare av Winges et al.[33] och sedan av Guyot et al.[20].

Strukturerna för de sex dimera föreningarna bestämda genom dessa NMR-analyser visas i figur 6, där N2, N3, N6 och N8 är rena produkter och N4 är en blandning av två isomerer.

3. Material och metoder

3.1.Kemikalier

(plus)-katekinhydrat Större än eller lika med 98 procent; laccase från Trametes Versicolor(0.94 U·mg-1); dibasiskt natriumfosfatdihydrat Större än eller lika med 98 procent; citronsyra (ACS-reagens, kadmiumnitrat-tetrahydrat 99,997 procent; myrsyra och Amberlite XAD7HP erhölls från Sigma-Aldrich) (Saint-Louis, MO, USA). Aceton-dg köptes från Euriso-top (Saarbrüicken, Tyskland) och trifluorättiksyra syra (TFA) från Roth Labo (Karlsruhe, Tyskland). Vatten LC-MS, acetonitril LC-MS(ACN) och metanol LC-MS (MeOH) var alla från VWR (Radnor, PA, USA).

3.2. Beredning av modellvinlösningen

Modellvinlösningen var en etanol/vattenlösning (12/88;o/o) med 0.033 M vinsyra, justerad till pH 3.6 med NaOH 1 M [34].

3.3. Rå druv-PPO-extrakt

PPO-extraktet framställdes såsom beskrivits tidigare av Singleton et al.[35]. Frysta druvor blandades först i en acetatbuffert (1,5 M, pH 5; 10 gL-I askorbinsyra). Blandningen filtrerades sedan och centrifugerades (3000 g; 10 min). Återstoden tvättades slutligen med aceton (80 %) och lufttorkades.

3.4. Laccase från Botrytis Cinerea

Laccase från Botrytis cinerea erhölls enligt beskrivning av Quijada-Morin et al.[36]. Den producerades från VA612-stammen (samlad i 2005 i en vingård i Hautvillers, Champagne, Frankrike, från Pinot Noir-kultivaren). Kortfattat lämnades kulturer på fast maltjästmedium i en vecka vid 24 grader under blått ljus. Sporerna skrapades sedan och inokulerades i en 500 mL Erlenmeyer-kolv innehållande 125 mL odlingsmedium (4{{30}} gL-1glukos, 7 gL{{10}}glycerol, 0,5 g·L-1L-histidin,0,1 g:L-1 CuSO,1,8gL-1 NaNO3,0,5g:L -1 KCl,0,5gL-1 CaCl2·H2O,0,05g:L-1 FeSO4.7H2O,1,0g L-1KH2PO4 och 0,7 gL-1 MgSO 4-7H2O). Efter 3 dagars inkubation och 2 dagars tillväxt i samma tidigare medium tillsattes gallsyra (2 gL-1) till förkulturerna. Efter 5 dagar filtrerades det flytande mediet och supernatanten utsattes för tangentiell filtrering i ett Quixstand-filtreringssystem (GE Healthcare UK, Little Chalfont, England) utrustat med en 30 kDa-molekylvikt avskuren membran. Koncentratet utsattes slutligen för en diafiltrering mot destillerat vatten, och endast de fraktioner som uppvisade oxidantaktivitet mot ABTS behölls (-80 grad ).

3.5.Oxidationsförfarande

En laccaslösning (1 gL-1) i fosfat-citratbuffert bereddes tidigare och sattes till en 6g.L-1( plus )-katekinlösning (modellvin) för att erhålla en slutlig laccaskoncentration på { {6}}.3 gL-1. Den erhållna lösningen omrördes sedan långsamt (180 rpm) vid rumstemperatur under 2 timmar. Koncentrationerna optimerades tidigare och experimentet utfördes i tre exemplar.

3.6. Reaktionsstopp på harts Amberlite XAD7HP

En amber lite kolonn konditionerades med etanol (absolut) och sköljdes med två kolonnvolymer av milli-O-vatten. Det tidigare laccas/(plus)-katekinreaktionsmediet droppades på kolonnen och eluerades först med två kolonnvolymer av milli-Qwater [37]. Kolonnen eluerades sedan med etanol tills den uppsamlade fraktionen var ofärgad. Endast etanolfraktioner hölls, indunstades och lyofiliserades. Pulvret förvarades vid -80 grad tills det användes.

3.7. Reningsprocedur för den dimera fraktionen med hjälp av flashkromatografi

Det lyofiliserade pulvret renades först med användning av ett flashkromatografisystem puriflash430 utrustad med en UV-detektor inställd på 280 nm och en Puriflash-diol 50 um f0025-kolonn. Den binära mobila fasen bestod av acetonitril (lösningsmedel A) och metanol (lösningsmedel B), båda surgjorda med 0,1 procent TFA. En serie injektioner utfördes vid en konstant flödeshastighet av 20 ml·min-1, med användning av följande gradient: 100 procent A under 4,4 minuter; 0-10 procent B på 10 minuter; 10 procent B i 5 minuter; 10-90 procent B på 5 min; 90 procent B i 3 min;90-10 procent B på 2 min; 10 procent B i 10 min. Injektionsvolymen var 1 ml (300 mg lyofiliserat pulver löst i 1 ml lösningsmedel A). Tre distinkta fraktioner uppsamlades varje gång. Den första motsvarade resterande (plus)-katekin, och den tredje var en blandning av högmolekylära polyfenoler. Den andra eluerade fraktionen, innehållande en blandning av dimera oxidationsprodukter, indunstades och lyofiliserades före det andra reningssteget.

3.8. Reningsprocedur för oxidationsprodukter från den dimera fraktionen med användning av ett halvpreparationskromatografisystem

Fraktionen innehållande dimera oxidationsprodukter renades med hjälp av ett semipreparativt Bio-Rad NGC 10 medeltryckskromatografisystem utrustat med en omvänd fas Varian Dynamax C18 Microsorb-kolonn (250 × 21,2 mm; 3 um). Den binära mobila fasen bestod av milli-O-vatten (lösningsmedel A) och 80 procent acetonitril, 20 procent Milli-Q-vatten (lösningsmedel B), båda surgjorda med 0,05 procent TFA. En serie injektioner (300 μL) av det lyofiliserade pulvret (20 mg löst i 200 µl lösningsmedel A och 100 µl ACN) utfördes under följande elueringsbetingelser: 100 procent A under 4 min; 0-35 procent B på 46 min;35-100 procent B på 2 min; 100 procent B i 5 min. Åtta distinkta fraktioner samlades upp varje gång, motsvarande rena UPLC-signaler vid 280 nm. Varje fraktion indunstades och lyofiliserades före NMR-analys.

3.9. Provberedning för NMR-analys

Cirka 1 mg av varje lyofiliserat pulver viktat i Eppendorf-rör löstes i 500 μL aceton-dg. Sedan sattes ~10 ul av en koncentrerad lösning av kadmiumnitrat i aceton-d till proverna, och de resulterande lösningarna överfördes till 5 mm NMR-rör för NMR-analys. Ett ytterligare steg utfördes för några prover: efter solubilisering av de lyofiliserade pulvren i aceton-dg i närvaro av spår av kadmium, indunstades proverna till torrhet och återsolubiliserades sedan i aceton-d utan ytterligare tillsats av Cd.

3.10. Instrumentspecifikationer

UPLC-MS-analys. Reaktionerna övervakades med användning av två UPLC-MS-system. Den första användes för att exakt identifiera produkters retentionstider med hjälp av en metod med lång gradient. dvs. Waters omvänd fas ultra-högpresterande vätskekromatografi kopplad till masspektrometri (UHPLC-MS). Vätskekromatografisystemet var en Acquity UPLC (Waters, Milford, MA, USA) utrustad med en fotodioduppsättningsdetektor. Vi använde en Acquity UPLC HSS T3 kolumn (1,8 um, 2,1 × 150 mm). Kolonntemperaturen var 25 grader. Den binära mobila fasen bestod av 0,1 procent myrsyra i vatten (lösningsmedel A) och acetonitril (lösningsmedel B). Separationen utfördes med en konstant flödeshastighet av 0.25mL·min-1, med användning av följande gradient: 8-11 procent B på 2 min; 11 procent B i 8 min; 11-25 procent B på 15 min;25-55 procent Bin 5 min;55-99 procent Bin 1 min;99 procent B i 4 min;99-8 procent Bin1 min;8 procent B i 4 min. Injektionsvolymen var 5 μL. Masspektrometern var en Waters Acquity QDa elektrosprayjonisering (ESI) enkel kvadrupol (Waters, Milford, MA, USA). Kapillärspänningen sattes till 0,8 kV. Masspektra förvärvades över ett massintervall av 200-900 Tunn den positiva jonmoden.

Det andra UHPLC-MS-systemet, som användes för snabb verifiering under reningsstegen, var detsamma som beskrivits tidigare, med en Acquity UHPLC HSS T3-kolonn (1,8 μm, 2,1×100 mm） uppvärmd vid 38 grader. Separationen utfördes med en konstant flödeshastighet av 0,55 ml·min-1, med användning av följande snabba gradient:0.1-40 procent B på 5 minuter; 40-99 procent B på 2 minuter; 99 procent B under 1 min; 99-0.1 procent B på 1 min. Injektionsvolymen var 2 μL. Masspektrometern var en Bruker Amazon X elektrosprayjonisering (ESI) jonfälla (Bruker Daltonics, Bremen, Tyskland). Kapillärspänningen sattes till -5,5 kV. Masspektra förvärvades över ett massintervall av 50-2000 Tunn den positiva jonmoden.

Alla UPLC-MS-analyser utfördes i tre exemplar.

NMR-instrumentering. Alla NMR-spektra registrerades på en Agilent DD{{0}} MHz-spektrometer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), som arbetar vid 500,05 och 125,74 MHz för proton- och kol-13kärnor, med användning av en 5 mm indirekt detektionssond utrustad med en gradientspole.1D'H och 13C,2Dhomonuclear1H TOCSY och ROESY, och heteronukleära lH/13C HSQC och HMBCexperiment utfördes med klassiska pulssekvenser och analyserades med både VNMRJ4.2 och 14Re2Nova. .1 (Mestrelab Research, Spanien) programvara. DOSY-mätningar förvärvades och bearbetades som tidigare beskrivits 38]. Förvärvsparametrarna för DgcsteSL-pulssekvensen var följande: diffusionsfördröjningstiden och gradientpulsbredden sattes till 50 ms respektive 2 ms, gradientstyrkan (g) ökades i 16 steg med lika g2-avstånd från 0,3 till 2 ms. 32G·cm-I. Efter faskorrigering konstruerades 2D DOSY-spektra från topphöjdsmätningen med hjälp av VNMRJ4.2-programvara.

Alla spektra refererades till lösningsmedelsaceton-dg-signalerna ('H-restsignal vid 2,05 ppm och 13C-signal vid 29,92 ppm).

4. Sammanfattningar

Verkan av tre olika oxidoreduktaser (polyfenoloxidas extraherat från druvor, lackas från Botrytis cinerea och lackas från Trametes Versicolor) på (plus )-katekin undersöktes, och LC-UV-MS resulterande profiler var mycket lika, även om några mindre skillnader antydde möjliga olikheter i reaktiviteten hos dessa enzymer.

Strukturerna för sex katekin-laccas-oxidationsprodukter (med laccas från Trametes Versicolor) erhölls på basis av specifika NMR-signaturer (fyra rena produkter, dvs. N2, N3, N6 och N8, och N4, motsvarande en blandning av två isomerer). Den fullständiga tilldelningen av fenoliska OH-signaler var möjlig tack vare tillsatsen av kadmiumnitrat med en provberedningsprocedur som möjliggjorde den entydiga tilldelningen av kopplingarna mellan katekinenheterna för några av föreningarna av intresse. Denna procedur kommer avsevärt att förenkla NMR-analys av polyfenolblandningar, antingen syntetiserade eller extraherade från naturliga produkter.

Standarderna som erhållits i detta arbete kan komma att användas i framtiden som oxidationsmarkörer för att undersöka deras närvaro och utveckling under druvmognad och vinlagring. Förutom katekin kan andra polyfenolföreningar, inklusive flavonoider och icke-flavonoider, också användas som substrat för laccas för att erhålla ytterligare nya standarder.

Förkortningar

NMR: kärnmagnetisk resonans,

CD: kadmium,

TOCSY: total korrelationsspektroskopi,

ROESY: Nukleär Overhauser-effektspektroskopi med roterande ram,

HSQC:heteronukleärt enkelkvantkorrelationsexperiment,

HMBC:heteronukleär flerbandsanslutning,

DOSY: diffusionsordnad spektroskopi.

Referenser

1. Khan, N.; Mukhtar, H. Tepolyfenoler för hälsofrämjande. Life Sci. 2007, 81, 519–533. [CrossRef]

2. Fayeulle, N.; Vallverdu-Queralt, A.; Meudec, E.; Hue, C.; Boulanger, R.; Cheynier, V.; Sommerer, N. Characterization of New Flavan-3-Ol-derivat i fermenterade kakaobönor. Food Chem. 2018, 259, 207–212. [CrossRef] [PubMed]

3. Rimbach, G.; Melchin, M.; Moehring, J.; Wagner, AE Polyfenoler från kakao och vaskulär hälsa — en kritisk granskning. Int. J. Mol. Sci. 2009, 10, 4290–4309. [CrossRef]

4. Avram, AM; Morin, P.; Brownmiller, C.; Howard, LR; Sengupta, A.; Wickramasinghe, SR Koncentrationer av polyfenoler från blåbärsresterextrakt med nanofiltrering. Livsmedel Bioprod. Bearbeta. 2017, 106, 91–101. [CrossRef]

5. Antoniolli, A.; Fontana, AR; Piccoli, P.; Bottini, R. Karakterisering av polyfenoler och utvärdering av antioxidantkapacitet i druvpressrester i Cv. Malbec. Food Chem. 2015, 178, 172–178. [CrossRef]

6. Saucier, C. Hur utvecklas vinpolyfenoler under vinlagring? Cerevisia 2010, 35, 11–15. [CrossRef]

7. Oliveira, CM; Ferreira, ACS; De Freitas, V.; Silva, AMS Oxidationsmekanismer som förekommer i viner. Food Res. Int. 2011, 44, 1115–1126. [CrossRef]

8. Singleton, VL Syre med fenoler och relaterade reaktioner i muster, viner och modellsystem: observationer och praktiska konsekvenser. Am. J. Enol. Vitic. 1987, 38, 69-77.

9. Mathew, AG; Parpia, HAB Food Browning som en polyfenolreaktion. In Advances in Food Research; Chichester, CO, Mrak, EM, Stewart, GF, Eds.; Academic Press: Cambridge, MA, USA, 1971; Volym 19, s. 75–145. [CrossRef]

10. Gambuti, A.; Rinaldi, A.; Ugliano, M.; Moio, L. Utveckling av fenoliska föreningar och sammandragning under åldrande av rött vin: Effekt av syreexponering före och efter tappning. J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 1618–1627. [CrossRef] [PubMed]