Antioxidativa effekter av fenyletanoider från Cistanche Deserticola

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Quanbo Xiong/ Shigetoshi Kadota," Tadato Tani,6 och Tsuneo Namba"

Aceton-H2O (9:1)-extraktet från stammen av Cistanche deserticola visade en stark fria radikalfångande aktivitet. Nio större fenyletanoidföreningar isolerades från detta extrakt. De identifierades genom NMR som akteosid, isoakteosid, l^acetylakteosid, tubulosid B, echinakosid, tubulosid A, syringalid A 3z-a-rhamnopyranosid, cistanosid A och cistanosid F. Alla dessa föreningar uppvisade starkare fria radikaler-fångande aktiviteter än en -tokoferol på 1,1 -diphenyI-2-picrylhydrazy 1 (DPPH) radikal och xantin/xantinoxidas (XOD) genererad superoxidanjonradikal (Oj). Bland de nio föreningarna uppvisade isoakteosid och tubulosid B, vars kaffeoyldel är i d'-position av glukosen, en hämmande effekt på XOD. Vi studerade vidare effekterna av dessa fenyletanoider på lipidperoxidationen i råttlevermikrosomer inducerad av enzymatiska och icke-enzymatiska metoder. Som förväntat uppvisade var och en av dem signifikant hämning på både askorbinsyra/Fe2 plus och ADP/NADPH/Fe3 plus inducerad lipidperoxidation i råttlevermikrosomer, som var mer potenta än a-tokoferol eller koffeinsyra. Den antioxidativa effekten visade sig förstärkas av en ökning av antalet fenoliska hydroxylgrupper i molekylen.

Nyckelord: Cistanche deserticola; fenyletanoider;antioxidant; DPPH (1,1 -difenyl-2-picrylhydrazyl)-radikal; superoxidanjonradikal; lipidperoxidation

stam av Cistanche deserticola

Stammen av Cistanche spp. (Cistanche Herba, familjen Orobanchaceae) är en tonic i traditionell kinesisk medicin som används för njurbrist som kännetecknas av impotens, köldkänsla i länd och knän, kvinnlig sterilitet och förstoppning på grund av torrhet i tarmen i senil.Ett antal beståndsdelar inklusive fenyletmoider (ibland kallade fenylpropanoider),2) ir-idoider3* och polysackarider4) har isolerats från dessa växter. Sato et al5} rapporterade att vissa fenyletanoider från detta råa läkemedel visade en skyddande effekt mot minskningar av både sexuella och inlärningsbeteenden hos hängande stressbelastade möss. Fenyletanoider är huvudbeståndsdelarna i dessa växter och anses bidra till de olika verkan av detta läkemedel.6)

Fenyletanoider är utbredda i växtriket och vissa har visat sig ha aktiviteten av anti-anoxi,7) anti-neoplasma,8) enzymhämning,9* antiinflammation,10) antinefrit,1 n antimikroorganism, och immunmodulering.12) Studier av den antioxidativa aktiviteten hos vissa fenyletanoider från Pedicularis rapporterades också,13 -15) men ingen rapport hittades som handlade om den antioxidativa aktiviteten hos fenyletanoider från Cistanche-arter.

Det är välkänt att fria radikaler är kritiskt involverade i olika patogener såsom cancer, hjärt-kärlsjukdomar, artrit, inflammation, såväl som i de degenerativa processer som är förknippade med åldrande.16™18) I vår screening för anti-aging medel från naturresurser fann vi att var och en av CHC13 (C), EtOAc (E), aceton (A), aceton-H2O (9:1) (AH) och vatten (H) extrakt från stammen av Cistanche deserticola visade en potent DPPH radikalfångande aktivitet (fig. 1), bland vilken den starkaste uppvisades av aceton-H?.(9:1) extrakt (AH). Aceton-H2O (9:1)-extraktet innehöll ett högt förhållande av fenyletanoider, som förmodligen var aktiva beståndsdelar av de fria radikaler som eliminerar effekterna. Vi isolerade de viktigaste fenyletanoiderna från detta extrakt och studerade de antioxidativa effekterna genom att de avlägsnade DPPH-radikal och xantin/XOD-genererad superoxidanjonradikal, och deras hämning av askorbinsyra/Fe2 plus och ADP/NADPH/Fe3 plus inducerad lipidperoxidation i råttlever mikrosomer.

Cistanche deserticola

MATERIAL OCH METODER

Reagens Polyamid C-200 (75一150/zm) och silikagel (Wakogel C-200, 75—150^m) pulver för kolonnkromatografi, DPPH (1,1 -difenyl{{ 8}}pikrylhydrazyl), xantin, XOD (xantinoxidas), NBT (nitroblått tetrazolium), ADP, g-NADPH, koffeinsyra och a-tokoferol köptes från Wako Pure Chemicals, Osaka, Japan. Malonaldehyd-bis(dimetylacetal) kom från Tokyo Kasei, Tokyo, Japan. BSA (bovint serumalbumin) och allopurinol var från sigma, St. Louis, USA Andra kemikalier var av analytisk kvalitet.

Instrumentens UV-absorbans mättes på enShimadzu UV-2200-inspelningsspektrofotometer, NMR-spektra bars på ett JEOL GX-400 eller ett JEOL JNM-LA 400WB FT NMR-system.

Växtmaterial Ett kommersiellt råläkemedel (tillverkat i Nei Monggol, köpt i Bozhou Crude Drug Market, Anhui-provinsen, Kina, 1995; kupongprovet, TMPW nr 15479 deponerat i Museum of Materia Medica, Analytical Research Center for Ethnomedicine, Research Institutet för Wakan-Yaku, Toyama Medical and Pharmaceutical University) identifierades som stammar av Cistanche deserticola YC Ma genom att jämföra dess morfologiska och anatomiska karaktärer med ett autentiskt prov från professor Dawen Shi, Department of Pharmacognosy, Shanghai Medical University, Kina.

Extraktion och isolering Det pulveriserade råa läkemedlet (5,87 kg) extraherades i följd med CHC13 (12, 9 1x2) och EtOAc (9 1 x 3) vid rumstemperatur och återloppskokades med aceton (9 1 x 3), aceton-玦0 (9:1,91x3) och H2O (7.5 1x4) för att ge extrakten av CHC13 (C) (28,7 g), EtOAc (E) ( 13,4 g), aceton (A) (95 g), aceton-H2O (9:1) (AH) (175 g) respektive H2O (H) (2,51 kg). En del av lOOg av aceton-H2O (9:1)-extraktet utsattes för en polyamid C-200 (4{{50}}0 g) kolonn och eluerades med H2O ({{41) }}) och sedan MeOH (5 1). MeOH-eluenten (20 g) satsades på en silikagelkolonn (600 g) och eluerades med CHCl3-MeOH-H2O (8:3:0,3) (5 1) för att ge 10 fraktioner. Varje fraktion utsattes för Sephadex LH-20-kolonn och eluerades med olika förhållanden av MeOH-H2O (0×50 procent); nio huvudsakliga fenyletanoider 1 (607 mg), 2 (286 mg), 3 (43 mg), 4 (187 mg), 5 (1,1 g), 6 (100 mg), 7 (208 mg), 8 (168 mg) 9 (75 mg) erhölls.

Djur Std av hankön: Wistar-råttor (8 veckor gamla, 230 x 250 g) användes. Djuren köptes från Shizuoka Laboratory Animal Center och utfodrades med en laboratoriepelletsmat (Clea Japan) och gavs vatten ad libitum.

Framställning av mikrosomal suspension av råttlever Mikrosomal fraktion från råttlever framställdes med metoden enligt Kiso et al.19) men utan förbehandling av fenobarbital. Efter att djuren hade fastat i 24 timmar perfunderades levern med en iskall 0,9 procent NaCl-lösning in situ, skars sedan i tunna bitar och homogeniserades i kall 1,15 procent KC1-lösning (1.{{9} } ml/g våt levervikt). Homogenatet späddes fyra gånger med 1,15 procent KC1-lösning och centrifugerades vid 8000 g under 20 minuter vid 4 grader. Supernatantfraktionen samlades sedan upp och ultracentrifugerades vid 105 000 g under 60 min. Den erhållna pelleten återsuspenderades i samma volym av 1,15 % KCl-lösning. Proteininnehåll bestämdes med metoden enligt Lowry et med användning av albumin som standard.

Provberedning De testade proverna löstes i vatten eller etanol och späddes med vatten till olika koncentrationer. De slutliga koncentrationerna av etanol var under 1 procent i alla analyssystem utom DPPH-radikalavlägsnande analys. Etanol vid en slutlig koncentration under 1 procent visade ingen effekt på dessa analyssystem.

DPPH Radical Scavenging Effect Den rensande effekten motsvarade intensiteten av släckning av DPPH-radikal, såsom beskrivs av Hatano et al. 30 min vid rumstemperatur, sedan mättes den optiska densiteten vid 520 nm. För blindprov användes EtOH istället för DPPH-lösning och för kontroll användes H2O istället för provlösning. IC50-värdena beräknades från regressionslinjer där abskissan representerade koncentrationen av testad förening och ordinatan den genomsnittliga procentuella reduktionen av DPPH-radikal från fyra separata tester.

Effekter på superoxidanjonradikalgenerering Produktionen av superoxidanjoner i xantin/XOD-systemet bestämdes med hjälp av en halv storlek av metoden enligt Imanari et al.22) En blandning bestående av 900/zl av 0,05 m Na2CO3 (pH 10,2), 50 /il vardera av 3 mM xantin, 3 mM EDTA, 1,5 mg/ml BSA, 0,75 mM NBT och testat prov tillsattes 50 av 0,1 mg/ml XOD för att starta reaktion. Efter inkubation under 30 minuter stoppades reaktionen med 50 /il av 6 mM CuCl2 och absorbansen mättes vid 560 nm. Kontrolllösningen bereddes på samma sätt, men 50 /il H2O användes istället för provlösningen. I blanklösning användes 50 /il H2O istället för XOD-lösning. IC50-värden beräknades från regressionslinjer där abskissan representerade log-koncentrationen av den testade föreningen och ordinatan den genomsnittliga procentuella hämningen av NBT-reduktion på fyra i beroende tester.

Hämmande effekter på aktiviteten av XOD Hämmande effekter på aktiviteten av XOD uppskattades med metoden enligt Hatano et al.* med vissa modifieringar. En blandning bestående av 600/11 av en buffert (0,1 m fosfatlösning, pH 7,5), 50 以 XOD-lösning (0,068 U/ml i buffert) och 50 卩 1 av provlösningen förinkuberades i 10 minuter vid 25 grader. Sedan sattes 300 pl xantinlösning (0,1 mM i buffert) till blandningen och den resulterande lösningen inkuberades i 30 minuter vid 25 grader. Enzymreaktionen avslutades genom tillsats av 1 n HCl (100/zl), och absorbansen hos reaktionsblandningen mättes vid 295 nm. Koncentrationen av urinsyra som bildades i blandningen beräknades från absorbansen, efter subtrahering av absorbansen för blanklösningen som framställdes såsom beskrivits ovan, förutom att XOD-lösningen ersattes med 50 /zl av bufferten. De hämmande effekterna på XOD uttrycktes av den procentuella hämningen (procent) av bildningen av urinsyra jämfört med den i kontrollen, i vilken vatten användes istället för provlösning. Den välkända XOD-hämmaren, allopurinol, användes som en positiv kontroll.

Hämmande effekter på lipidperoxidation i råttlevermikrosomer Lipidperoxidation i råttlevermikrosomer icke-enzymatiskt inducerad av askorbinsyra/Fe2 plus och enzym inducerad av ADP/NADPH/Fe3 plus mättes med metoden enligt Kiso et al.l9) med vissa modifieringar .

a) Askorbinsyra/Fe2 plus inducerad lipidperoxidation i råttlevermikrosomer: Reaktionsblandningen bestod av 390/11 av 100mM KC1/45 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 pl mikrosomal fraktion i 1,15 procent KC1 (20 mg protein/ml) och 50 以 av en provlösning. Efter tillsats av 10/11 av 10 mM askorbinsyra/0,5 mM FeSO4 och sedan inkubering vid 37 grader i 20 minuter kyldes reaktionsblandningen i is för att stoppa reaktionen. Lipidperoxidationen mättes med tiobarbitursyrametoden24) och uttrycktes som MDA-produktion (malondialdehyd). Den där

b) ADP/NADPH/Fe3 plus inducerad lipidperoxidation i råttlevermikrosomer: Reaktionsblandningen innehöll 29 0 µm 100 mM KC1/45him Tris-HCl (pH 8,0), 50/il mikrosomal suspension i 1,15 procent KC1 (20 mg protein/ml) och 50 以 prov i vatten. Femtio av nyberedda 20 mM ADP, 50//l av 1 mM NADPH och 10 av 2 mM FeCl3 tillsattes och inkuberades sedan vid 37 grader i 30 minuter. Lipidperoxidation mättes och IC50 beräknades med metoden ovan.

cistanche fördelar: skydda levern

RESULTAT

Strukturbestämning Genom direkt jämförelse av deras ^H-NMR- och 13C-NMR-data med litteraturen,2* identifierades de nio fenyletanoiderna som 2,-acetylakteosid (1), cistanosid A (2), tubulosid A (3), echinakosid ( 4), akteosid (5), syringalid A 3'-a-rhamnopyranosid (6), tubulosid B (7), isoakteosid (8) respektive cistanosid F (9) (fig. 2). Men för akteosid, en representativ förening av fenyletanoider, tilldelningar av 13C-NMR-signalerna för C-3 och C-4 i aglykondelen, C-3, C-4 , C-5 och C-6 i koffeindelen i tidigare rapporter25) var förvirrande. Med metoden för 2D-NMR såsom HMBC och HMQC tilldelade vi entydigt 13C-NMR-data för akteosid som aglykondel Cl: 131,49, C-2: 117,14, C-3: 146,07, C{ {41}}: 144,62, C-5: 116,34, C-6: 121,29, Ca: 72,33, C# 36,54; koffeoyldel Cl: 127,63, C-2: 115,26, C-3: 146,79, C-4: 149,78, C-5: 116,55, C-6: 123,24 Ca: 168,33, Cg: 114,68, Cy: 148,04; glukosdel C-l': 104,16, C-2': 75,97, C-3': 81,66, C4: 70,39, C-5': 76,16, C-6' 62,35; och rhamnosdel: Cl: 102,99, C-2: 72,22, C-3: 72,05, C-4: 73,79, C-5: 70,58, C-6 : 18,46.

Struktur-aktivitetsförhållandena studerades för dessa nio fenyletanoider genom deras DPPH-radikal och xantin/XOD-genererade superoxidanjonradikal-fångande aktiviteter, askorbinsyra/Fe2 plus och ADP/NADPH/Fe3 plus inducerad lipidperoxidation i råttlevermikrosomer. Koffeinsyra och a-tokoferol som är välkända fria radikaler och antioxidanter användes som positiva kontrollsubstanser.

DPPH Radical Scavenging Activity All of the nine phenylethanoids showed stronger DPPH radical scav-enging activity than either a-tocopherol or caffeic acid, except that cistanoside A (2), syringalide A 3'-a-rhamno- pyranoside (6) and cistanoside F (9) showed weaker activity than caffeic acid (Fig. 3). The activity order was tubuloside B ⑺(IC50 = 2.99 ^m) > echinacoside ⑷ (IC50 = 3.29 fiM)M 2z-acetylacteoside ⑴(IC50 = 3.30 /im) M tubuloside A (3) (IC50 = 3.34/im) acteoside (5) (IC50 = 3.36 〃m)> isoacteoside (8) (IC50 = 3.49 ^m) >caffeic acid (IC50 = 4.79 /2M)> cistanoside A (2) (IC5O = 4.87 /im)>syringalid A S'-a-rhamnopyranosid (6) (IC5O=5.52 /zm) > cistanosid F (9) (IC50=6.29 /im) > a-tokoferol (IC{{10 }}.2//m). Tubulosid B ⑺,echinakosid (4), 2/-acetylacetosid (1), tubulosid A (3), akteosid (5) och isoakteosid (8) (IC5O=2.99一3.49 /im), var och en av dem har fyra fenoliska hydroxylgrupper i molekylen visade på liknande sätt starkare aktivitet än cistanosid A (2) vars 3-OH av aglykondelen var metylerad. Syringalid A 3z-a-rhamnopyranosid (6) som endast har en OH-grupp i aglykondelen visade relativt svag aktivitet. Cistanoside F (9), som endast har två hydroxylgrupper belägna vid koffeoyldelen men inte har någon fenyletanolaglykon, uppvisade den svagaste aktiviteten.

Effects on Superoxide Anion Radical Generation All the tested compounds exhibited a stronger inhibitory activity than a-tocopherol but weaker than caffeic acid on the generation of superoxide anion radical (Fig. 4). The activity order was caffeic acid (IC5()= 1.82jUM)>2'- acetylacteoside (1) (IC50 = 2.25 /im) tubuloside B ⑺ (IC50 = 2.34jUM) >echinacoside (4) (IC50 = 2.74juM)^ isoacteoside (8) (IC50 = 2.88 /zm) acteoside (5) (IC50 = 2.89 f/M) >cistanoside F (9) (IC5o = 3.13 rm) tubuloside A (3) (IC50 = 3.17 jUM)syringalide A 3'-a-rhamnopyrano- side (6) (IC50 = 3.20^m)>cistanosid A (2) (IC5O=3.69 jUm) > a-tokoferol (IC50 > 10 µm).

Hämmande effekter på XOD-aktivitet Endast isoakteosid (8) och tubulosid B (7), vars koffeoyldel är i 6z-position av glukosen, hade hämmande effekter på aktiviteten av XOD och andra fenyletanoider, som har koffeoyldel vid ^- glukospositionen, visade inga effekter vid de testade koncentrationerna (25×200 m) (tabell 1). isolerade nio större fenyletanoidföreningar från detta extrakt och bestämde deras strukturer genom NMR. system som tubulosid B (7)M2'-acetylakteosid (1) iso-acteosid (8) echinakosid (4) tubulosid A (3) M acteo sida (5) > syringalid A 3'-a-rhamnopyranosid (6) > cistanosid A (2) > cistanosid F (9); i ADP/NADPH/Fe3 plus-system som tubulosid B (7)2,-acetylakteosid (^^iso akteosid (8) akteosid (5) > tubulosid A (3) > echinaco sida (4) > syringalid A 3z-a-rhamnopyranosid (6) > cistanosid A (2) > cistanosid F (9). Båda dessa ordningsföljder liknade den i ovanstående fria radikal-fångningstest, speciellt i DPPH-radikalfångningstestet. Fortfarande, antalet fenoliska hydroxylgrupper i molekylen spelat den viktigaste rollen i hämningen av lipidperoxidation i råttlevermikrosomer.

effekterna av cistanche

DISKUSSION

Vi testade de fria radikal-fångande aktiviteterna hos de olika lösningsmedelsextrakten av stammen från Cistanche deserticola på DPPH-radikal och fann att aceton-H2O (9:1)-extraktet uppvisade den starkaste aktiviteten. För att hitta de aktiva beståndsdelarna i den fria radikalfångande aktiviteten, isolerade vi nio större fenyletanoidföreningar från detta extrakt och bestämde deras strukturer med NMR.

De antioxidativa effekterna av dessa fenyletanoider utvärderades genom deras fria radikalfångande aktivitet och antilipidperoxidationsaktivitet. Den allmänt kända a-tokoferolen användes som en positiv kontrollsubstans. Som denlipofilicitet av a-tokoferol kan påverka dess aktiviteter i föreliggande analyssystem förutom i DPPH-radikalavlägsnande analys, vi tog koffeinsyra som en annan positiv kontrollsubstans.

Först genomförde vi tester på fria radikaler. Alla de 9 testade fenyletanoider uppvisade otvivelaktigt starkare DPPH-radikal- och superoxidanjonradikalfångande aktiviteter än a-tokoferol, men vissa var starkare och andra var svagare än koffeinsyra. Den radikalfångande aktiviteten ökade med en ökning av antalet fenoliska hydroxylgrupper. Den ofullständiga parallelliteten mellan DPPH-radikal- och superoxidanjonfångande aktiviteter antogs bero på de olika karaktärerna mellan radikalspecies och några andra faktorer som är involverade i dessa två reaktionssystem, 21,26) för DPPH-radikalen är en kemiskt inducerad radikal som reagerar med radikalfångare på ett enkelt kemiskt sätt, medan superoxidanjonradikalen genereras av xantin/XOD, en enzymreaktion.

Om fenyletanoider hämmar den xantin/XOD-genererade superoxidanjonradikalen, kan hämningen ses som ett resultat av deras superoxidanjonradikalfångande aktivitet eller (och) deras hämning av enzymet XOD,23, så vi utförde ett test av deras hämmande effekter av xantinoxidas. Det är intressant att selektivt visade endast isoakteosid (8) och tubulosid B (7), vars kaffeoyldel är i 6/-position av glukosen, hämning. De uppvisade en effekt vid koncentrationen av 25—200 jtiM på 3,4xlO^3U/ml (10jug/ml) XOD, även om aktiviteten var svagare än allopurinol; andra föreningar, vars kaffeoyldel är i positionen för glukosen, visade ingen hämmande effekt. Detta resultat gav den första rapporten om den hämmande effekten av fenyletanoider på XOD-enzym. Chan et al21) rapporterade att koffeinsyra och några av dess analoger hade hämmande effekter på XOD-aktivitet, men vi fann ingen sådan effekt av koffeinsyra under nuvarande reaktionsförhållanden. I detta test var XOD-koncentrationen liknande den i testet av effekt på superoxidanjonradikalgenerering (4,3 /zg/ml), men koncentrationen av föreningar var mycket högre än i den senare. Därför beror hämning av Oj-genereringen av dessa fenyletanoider på deras radikalfångande aktivitet, men inte på deras inhiberande aktivitet av XOD-enzymet.

Att fria radikaler kedjereaktion slutligen leder till lipidperoxidation är välkänt.28,29) Vi studerade därför dessa fenyletanoidföreningar för deras effekter på lipidperoxidationen i råttlevermikrosomer inducerad av det enzymatiska systemet ADP/NADPH/Fe3 plus och den som induceras av det icke-enzymatiska systemet askorbinsyra/Fe2 plus . Alla dessa föreningar visade starkare antilipidperoxidationseffekter än koffeinsyra och a-tokoferol i båda systemen. Det är allmänt accepterat att båda systemen katalyseras av järnjoner, antingen Fe2 plus eller Fe3 plus, involverade med lipidperoxylradikaler,30,31) och att hydroxylradikal OH spelar den viktigaste rollen vid lipidperoxidation,32 _34) även om initieringen av OH har ifrågasatts i vissa rapporter.35祁6) Å andra sidan är superoxidanjonradikal OJ, som är den primära produkten av e_ attack på O2 i radikalkedjan, en ganska dålig reaktiv radikal och resulterar inte i lipidperoxidation i sig. Även om dessa fenyletanoider visade svagare rensande aktivitet på superoxidanjonradikal än koffeinsyra, visade de mycket starkare antilipidperoxidationsverkan än den senare. Därför tror vi att de, liksom vissa andra aromatiska, kedjebrytande polyfenoler, kan hämma ovanstående lipidperoxidation i råttlevermikrosomer genom att kelatera Fe2 plus eller Fe3 plus joner, och även genom att rensa superoxidradikal Oj för att bryta ned radikal kedjereaktion .37,38) Dessutom kan de också fånga upp mer giftiga radikaler såsom hydroxylradikal och lipidperoxylradikaler för att direkt avbryta lipidperoxidation med högre styrka än koffeinsyra.38,39)

Li et al. studerat några fenyletanoidglykosider inklusive acteosid (verbascoside) (5), isoacteosid (iso- verbascoside) (1) och echinacoside (4) från Pedicularis för deras hämning av autooxidationen av linolsyra i miceller, ett icke-biologiskt system,13) för deras skydd mot oxidativ hemolys in vitro,14''1 och även för deras rensande effekter på NBT/PMS/NADH genererad superoxid och hämning av lipidperoxidation inducerad av askorbinsyra/Fe2 plus i muslevermikrosomer.15) En liknande aktivitet -struktursamband observerades i rapporterna från Li et al. och våra resultat. Det vill säga att fenyletanoiders aktiviteter för att hämma lipidperoxidation beror huvudsakligen på antalet fenoliska hydroxylgrupper och den steriska positionen.15) På basis av deras stereokemi, de fenoliska hydroxylgrupperna i koffeoyldelen på akteosid (5), tubulosid A ( 3) och echinakosid (4), som har koffeoylen i 4z-positionen av glukosen, skulle lättare bilda en vätebindning med hydroxylgrupperna i rhamnosyl än de på isoakteosid (8) och tubulosid B (7), som har koffeoylen i 6'-positionen av glukosen. Således reserverade de senare fler fria fenoliska hydroxylgrupper än de förra och visade därför starkare antilipidperoxidationsaktivitet. Vi märkte också att 2z-acetylering av dessa fenyletanoider, om än något, förstärkte deras antioxidativa effekter. Till exempel visade akteosid (5) och isoakteosid (8), när 2'-acetylerades till 2/-acetylakteosid (1) respektive tubulosid B (7), starkare aktiviteter i alla fyra analyssystemen. På grund av stereokemins överlägsenhet och 2'-acetylering uppvisade tubulosid B (7) den starkaste antioxidativa aktiviteten bland de testade proverna. Kanske på grund av substitutionen av en tredje sockerdel i 6'-positionen passade denna korrelation inte bra i fallet med tubulosid A (3) eller echinakosid (4); i ADP/NADPH/Fe3 plus-systemet uppvisade emellertid tubulosid A ⑶ fortfarande starkare antilipidperoxidationsaktivitet än echinakosid (4).

Dessutom visade ordningen för DPPH-radikalfångande aktivitet bättre parallellitet med den för antilipidperoxidation än ordningen för superoxidanjonradikalfångande aktivitet. Detta bevisade återigen att DPPH-radikalupptagningsanalys är en bekväm och pålitlig metod för antioxidantanalys,26) även om DPPH-radikal är en kemiskt inducerad radikal medan superoxidanjonradikal kan vara en biologiskt endogen radikal.

Sammanfattningsvis uppvisade alla de nio fenyletanoiderna signifikanta fria radikaler-fångande aktiviteter och antilipidperoxidationseffekter i föreliggande studie. Den antioxidativa effekten förstärktes av en ökning av antalet fenoliska hydroxylgrupper i molekylen. Som man kan föreställa sig kan de antioxidativa effekterna av dessa fenyletanoider som bevisats här spela en viktig roll i verkan av läkemedlet Cistanchis Herba och kan delvis förklara mekanismerna för aktiviteterna hos vissa fenyletanoider mot neoplasma,8* inflammation10) och nefrit, 1 n där fria radikaler är allvarligt inblandade.

Cistsanche Echinacoside: Antioxidation

REFERENSER

1) Namba T., "The Encyclopedia of Wakan-Yaku (Traditional Sino-Japanese Medicines) with Color Pictures, 5, Vol. II, Hoikusha, Tokyo, 1994, s. 16—17.

2) a) Kobayashi H., Karasawa H., Miyase T., Fukushima S., Chem. Pham. Bull, 32, 3009—3014 (1984); b) Idem, ibid., 32, 3880—3885 (1984); c) Idem, ibid., 33, 1452—1457 (1985); d) Karasawa H., Kobayashi H., Takizawa N., Miyase T., Fukushima S., Yakugaku Zasshi, 106, 562-566 (1986); e) Idem, ibid., 106, 721-724 (1986); /) Kobayashi H., Oguchi H., Takizawa N., Miyase T., Ueno A., Usmanghani K., Ahmad M., Chem. Pharm. Bull., 35, 3309-3314 (1987); g) Yoshizawa F., Deyama T., Takizawa N., Usmanghani K., Ahmad M., ibid., 38, 1927—1930 (1990).

3) a) Kobayashi H, Komatsu J., Yakugaku Zasshi, 103, 508-511 (1983); b): Kobayashi H., Karasawa H., Miyase T., Fukushima S., Chem. Pharm. Bull., 32, 1729-1734 (1984); c) Idem, ibid., 33, 3645—3650 (1985).

4) Naran R., Ebringerova A., Hromadkova Z., Patoprsty V., Phytochemistry, 40, 709-715 (1995).

5) Sato T., Kozima S., Kobayashi K., Kobayashi H., Yakugaku Zasshi. 105, 1131-1144 (1985).

6) Jin XL, Zhang QR, China J. Chinese Materia Medica, 19, 695—697 (1994).

7) Yamahara J., Kitani T., Kobayashi H., Kawahara Y., Yakugaku Zasshi, 110, 932—935 (1990).

8) a) Pettit G.R., Numata A., Takemura T., Ode RH, Narula A, S., Schmidt JM, Cragg GM, Pase CP, J. Nat. Prod., 53, 456-58 (1990); b) Saracoglu I., Inoue M., Calis I., Ogihara Y., Biol. Pharm, Bull., 18, 1396-1400 (1995).

9) Andary C., '4Caffeic Acid Glycoside Esters and Pharmacology/red. av Scalbert A., Polyphenolic Phenomena, INRA Editions, Paris, 1993, s. 237—245.

10) Murai M., Tamayama Y., Nishibe S., Planta Med.. 61, 479-80 (1995).

11) Hayashi K., Nagamatsu T., Ito M., Hattori T., Suzuki Y., Jpn. J. Pharmacol., 66, 47:52 (1994).

12) a) Molnar J., Gunics G., Mucsi I., Koltai M., Petri L, Shoyama Y., Matsumoto M., Nishioka L, Acta Microbiol. Hung.. 36, 425-32 (1989); b) Sasaki H., Nishimura T., Morota T., Chin M., Mitsuhashi H" Komatsu Y., Maruyama H., Tu GR, He W., Xiong YL, Planta Med., 55, 4582462 (1989).

13) Li J., Wang PF, Zheng RL, Liu ZM, Jia 乙 J., Planta Med., 59, 315-317 (1993).

14) Zheng RL, Wang PF, Li J., Liu Z.M., Jia ZJ, Chem. Phys. Lipider. 65, 151-154 (1993).

15) Li J., Zheng RL, Liu 乙 M., Jia 乙 J., Acta Pharmacol. Sinica, 13, 427T30 (1992).

16) Barber DA, Harris SR, American Pharmacy. 34, 26:35 (1993).

17) Elstner EF, Klin Wochenschr, 69, 949—956 (1991).

18) Martin GR, Danner DB, Holbrook NJ, Ann. Rev. Med., 44, 419-29 (1993).

19) Kiso Y., Tohkino H., Hattori M., Sakamoto T., Namba T., Planta Med.. 50, 298—302 (1984).

20) Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ, J. Biol. Chem.. 193, 265-275 (1951).

21) Hatano T., Edamatsu R., Hiramatsu M., Mori A., Fujita Y., Yasuhara T" Okuda T., Chem. Pharm. Bull., 37, 2016-2021 (1989).

22) Imanari T., Hirota M., Miyazaki M., Igaku No Ayumi, 101, 496—497 (1977).

23) Hatano T., Yasuhara T., Yoshihara R., Agata L, Noro T., Okuda T., Chem. Pharm. Bull., 38, 1224-1229 (1990).

24) Ohkawa H., Ohishi N., Yagi K., Anal. Biochem., 95, 351-358 (1979).

25) a) Lahloub M, F., Zaghloul AM, El-Khayat SA, Afifi MS, Sticher O., Planta Med.. 57, 481-85 (1991); b) Nishimura H., Sasaki H., Inagaki N., Chin M. (Zhen 乙 X.), Mitsuhashi H., Phytochemistry. 30, 965-969 (1991); c) Budzianowski J., Skrzypczak L., ibid,, 38, 997—1001 (1995),

26) Marsden SB, Nature (London), 181, 1199—1200 (1958).

27) Chan WS, Wen PC, Chiang HC, Anticancer Res., 15, 703-708, (1995).

28) Janero DR, Burghardt B., Biochem, Pharmacol.. 37, 3335-3342 (1988).

29) Buettner GR, Arch. Biochem. Biophys., 300, 535-543 (1993).

30) Herbert V., Shaw S., Jayatilleke E., Stopler-Kasdan T., Stem Cells, 12, 289-303 (1994).

31) Aust SD, Miller DM, Samokyszyn VM, Methods Enzymol., 186, 457-463 (1990).

32) Kubota S., Ikegami Y., Kurokawa T., Sasaki R., Sugioka K., Nakano M., Biochem. Biophys. Res, Commun., 108, 1025-1031 (1982).

33) Yagi K., Ishida N., Komura S., Ohishi N., Kusai M., Kohno M., Biochem. Biophys. Res. Commun., 183, 945-951 (1992).

34) Hockenbery DM, Oltvai ZN, Yin XM, Milliman CL, Korsmeyer SJ, Cell. 75, 241-251 (1993).

35) Bucher JR, Tien M., Aust AD, Biochem. Biophys. Res, Commun., Ill, 777—784 (1983).

36) Yoshida T., Otake H., Aramaki Y., Hara T., Tsuchiya S., Hamada A., Utsumi H., Biol. Pharm. Bull.. 19, 779-782 (1996).

37) Afanas5 EVIB, Dorozhko A.L, Brodskii AV, Kostyuk VA, Potapovitch L A., Biochem. Pharmacol., 38, 1763-1769 (1989).

38) Robak J., Gryglewski RJ, Biochem. Pharmacol.. 37, 837-841 (1988).

39) Chimi H., Morel I., Lescoat G., Pasdeloup N・, Cillard P., Cillard J., Toxicology in Vitro, 9, 695一702 (1995)