Golgi Alpha1,2-Mannosidase IA främjar effektiv endoplasmatisk retikulum-associerad nedbrytning av NKCC2

Abstrakt

Mutationer i den apikalt belägna njuren Na-K-2Cl cotransporter NKCC2 orsakar typ I Bartter-syndrom, en livshotande njursjukdom. Vi har tidigare visat att transport från akuten representerar den begränsande fasen i NKCC2:s resa till cellytan. Ändå är mycket lite känt om komponenterna för ER-kvalitetskontroll som är specifika för NKCC2 och dess sjukdomsframkallande mutanter. Här rapporterar vi identifieringen av Golgi alpha1, 2-mannosidas IA (ManIA) som en ny bindningspartner av den omogna formen av NKCC2. ManIA-interaktion med NKCC2 sker huvudsakligen på cis-Golgi-nätverket. ManIA-samuttryck minskade totalt NKCC2-proteinöverflöd medan ManIA-knockdown gav motsatt effekt. Viktigt, ManIA-samuttryck hade en mer djupgående effekt på NKCC2-vikningsmutanter. Cycloheximid chase assay visade att i celler som överuttrycker ManIA, är NKCC2 stabilitet och mognad kraftigt hämmad. Att ta bort den cytoplasmatiska regionen av ManIA försvagade dess interaktion med NKCC2 och hämmade dess effekt på mognaden av samtransportören. ManIA-inducerade minskningar av NKCC2-uttryck uppvägdes av proteasomhämmaren MG132. Likaså reducerade kifunensinebehandlingen avsevärt ManIA-effekten, vilket starkt tyder på att trimning av mannos är involverad i den förbättrade ERAD av cotransportören. Dessutom avskaffade mania dess katalytiska domän fullständigt dess effekt på NKCC2. Sammanfattningsvis visar våra data närvaron av en ManIA-medierad ERAD-väg i njurceller som främjar retention och nedbrytning av felveckade NKCC2-proteiner. De föreslår en modell där Golgi ManIA bidrar till ERAD av NKCC2, genom att främja kvarhållande, återvinning och ERAD av felveckade proteiner som initialt undkommer proteinkvalitetskontroll inom akutmottagningen.

Nyckelord

njure; NKCC2; proteinkvalitetskontroll; ERAD; Golgi; alfal,2-mannosidas IA; membran; människohandel; Bartters syndrom; hypertoni

Klicka här för att veta Cistanche-fördelarna

Introduktion

Natriumbalansen och dess reglering av njurarna, genom att reglera den extracellulära volymen, är en nyckelfaktor för kontroll av långtidsblodtrycket (BP), vilket illustreras av sällsynta monogena syndrom som påverkar hanteringen av njursalt och avsevärt förändrar blodtrycket [1, 2]. Faktum är att även om flera faktorer bidrar till patogenesen och upprätthållandet av förhöjt blodtryck, tros njurmekanismer spela en primär roll, vilket Guyton initialt antog [1]. Den tjocka stigande delen av slingan av Henle (TAL) i njuren är ansvarig för att återabsorbera 20–30 procent av den filtrerade mängden NaCl [3–5]. På molekylär nivå förmedlas TAL Na-Cl-reabsorption av luminal Na-K-2Cl-samtransportör NKCC2 [5]. Som en konsekvens har NKCC2-transportfunktionen en avsevärd inverkan på den slutliga urinsaltutsöndringen, vilket sedan påverkar långvarig natriumbalans i blodet [3,5]. Följaktligen påverkar ärvda variationer av samtransportören och/eller dess regulatorer BP hos människor [3,6-8]. Faktum är att inaktiveringen av NKCC2 orsakar typ I Bartter-syndrom (BS1), en livshotande njursjukdom med lågt blodtryck tillsammans med elektrolytavvikelser [9], medan den ökade aktiviteten hos samtransportören har kopplats till högt blodtryck [2,10– 13]. Dessutom, i flera djurmodeller av saltkänslig hypertoni [14,15], ökas NKCC2-proteinuttrycket och bidrog till utvecklingen av hypertoni. Förutom sin roll i BP-homeostas är NKCC2-aktivitet också avgörande för regleringen av vattenbalansen [5,16]. Till stöd för denna uppfattning orsakar NKCC2-inaktivering hos patienter med BS1 och BS5 utvecklingen av svår polyuri [7,8,17]. Dessutom tillskrivs den försämrade urinkoncentrationsförmågan hos åldrande njurar, åtminstone delvis, den minskade nivån av NKCC2-protein [18,19]. Det är värt att betona att i alla djurmodeller av högt blodtryck och åldrande verkar NKCC2 huvudsakligen regleras av posttranslationella mekanismer [5,16,19], vilket därför understryker behovet av att studera faktorerna som reglerar biogenes och handel med NKCC2. Trots detta förblev vår kunskap om de molekylära mekanismerna bakom intracellulär handel med vildtyps- och muterade NKCC2-proteiner i däggdjursceller, i synnerhet dess reglering genom protein-protein-interaktion, mycket dålig. Vidare fokuserade den stora majoriteten av tidigare rapporter huvudsakligen på post-Golgi-regleringen av samtransportören, särskilt genom fosforylering [20–22], och därför är mycket lite känt idag om regleringen av transportörerna vid akuten och pre-Golgi. nivå.

För att fungera korrekt måste NKCC2 vara korrekt riktad till den apikala cellytan och uttryckt tillräckligt för att tillåta TAL-celler att anpassa sig på lämpligt sätt till fysiologiska eller patologiska utmaningar [3,23]. Liksom alla transmembranproteiner börjar förberedelserna för NKCC2 lämplig trafik till cellmembranet när samtransportproteinet syntetiseras i det endoplasmatiska retikulumet (ER) och fortsätter när proteinet passerar genom Golgi-nätverket [24,25]. Likaså, liknande praktiskt taget alla proteiner avsedda för plasmamembranet, genomgår NKCC2-proteiner som translokeras till det endoplasmatiska retikulumet (ER) kvalitetskontroll, så att endast vikta proteiner flyttas genom den sekretoriska vägen [26,27]. Kontroll av proteinveckning i ER är ofta relaterad till N-glykosylering, en posttranslationell modifiering som initieras av den kovalenta kopplingen av en specifik oligosackarid (Glc3Man9GlcNAc2) till ett begynnande protein [28,29]. När denna oligosackarid väl har överförts följer flera successiva steg av proteinmognad längs den sekretoriska vägen [28,30]. Efter avlägsnande av tre glukosrester och början av mannostrimning i ER, som en del av kvalitetskontrollprocessen, överförs korrekt vikta proteiner till Golgi-apparaten för mognad [26,28]. Hög mannos N-glykaner trimmas sedan ytterligare av specifika mannosidaser såsom Golgi 1,2-mannosidaser i cis-Golgi [31,32]. Tillsatsen av GlcNAc, galaktos, sialinsyra och fukossocker genererar hybrida och komplexa N-glykaner i de mediala och trans-Golgi-avdelningarna [33,34]. Därefter riktas mogna N-glykosylerade proteiner till sin slutdestination. När veckningsprocessen misslyckas trimmas de terminala mannosresterna från kärnglykanstrukturen progressivt och defekta proteiner translokeras över membranet för nedbrytning av cytosolisk proteasom genom mekanismer som kallas ERAD (endoplasmatisk retikulum-associerad nedbrytning [26,35]). De återstående avvikande proteinerna, som kan bilda aggregat eller inte kan detekteras av ERAD-chaperoner, levereras till lysosomer för clearance via vägar som kollektivt kallas ER-sida [36,37]. Ändå kan vissa felveckade proteiner fortfarande fly ER och gå vidare till Golgi, där de utsätts för en Golgi-kvalitetskontroll (GQC) och riktas mot lysosom eller proteasom för nedbrytning [38]. Både vildtyps- och mutantvarianter av transmembranproteiner är benägna att ER kvalitetskontroll och nedbrytning. Kloridkanalproteinet CFTR (cystisk fibros transmembrankonduktansregulator), kännetecknad som det första integralmembranet ERAD-substrat för däggdjur, är det bästa exemplet [39,40]. Under normala förhållanden bryts upp till 70 procent av vildtyps-CFTR ned av ERAD [39,40]. Ännu mer imponerande är att deletionen av fenylalanin 508 (∆F508), mutationen av CFTR som är ansvarig för cystisk fibros, minskar veckningseffektiviteten, vilket resulterar i att nästan 99 procent av mutant CFTR bryts ned innan det kan nå plasmamembranet [39,40]. I likhet med CFTR och flera andra transmembranproteiner som HERG [41], ROMK [42] och NCC [43], har vi tidigare visat att majoriteten av nysyntetiserade NKCC2-proteiner var fångade i ER och avsedda för nedbrytning, en process som huvudsakligen involverar proteasomvägen [44–46]. ERAD börjar med upptäckten av ett felveckat protein av molekylära chaperoner [47]. Typen av chaperoner som är engagerade i denna process beror huvudsakligen på positionen för vikningsskadan av substratet som kan förekomma antingen i ER-lumen, ER-membran eller cytoplasman [27,47]. Följaktligen har tre olika ERAD-vägar föreslagits som ERAD-L (ERAD av substrat med felveckade lesioner i ER-lumen), ERAD-M (membran) och ERAD-C (cytoplasma) [27,47,48]. Till exempel involverar ERAD av begynnande CFTR både cytoplasmatiska och ER luminala chaperoner [49]. På samma sätt engagerar NCC, ett annat transmembranprotein, flera cytoplasmatiska chaperoner för sin ERAD [43,50]. I likhet med den relaterade njurspecifika elektroneutrala NCC, har NKCC2 12 transmembranregioner, två stora cytoplasmatiska domäner och en stor ER-exponerad exofacial loop [5]. Eftersom NKCC2 innehåller domäner i ER och cytoplasman, är en interaktion av samtransportören med ER molekylära chaperoner på vardera sidan eller båda sidor av ER-membranet tänkbar. Dessutom, med tanke på att den C-terminala domänen av NKCC2 är den dominerande cytoplasmatiska regionen [5], är det sannolikt att det är huvudplatsen för protein-protein-interaktion och därför spelar en avgörande roll i biogenes och handel med samtransportören. I överensstämmelse med denna uppfattning identifierade vi tidigare flera bindande partners till NKCC2 C-terminalen [46,51-53]. Bland dessa visade vi att aldolas B och SCAMP2 binder till NKCC2 C-terminalen på post-Golgi-nivån och reglerar den subcellulära omfördelningen av samtransportören [51,52]. På senare tid gav vi bevis för att STCH, Hsp70 och protein-lektinet OS9 interagerar med den omogna formen av NKCC2 huvudsakligen vid ER för att reglera dess ER-associerade nedbrytning [46,53]. I den här rapporten beskriver vi en ny protein-protein-interaktion mellan den C-terminala svansen av NKCC2 och Golgi 1, 2-mannosidas IA (Golgi ManIA, även kallat Man9-}mannosidas), ett allestädes närvarande protein som tillhör familjen klass I -1,2 mannosidaser som inkluderar ER -mannosidas I (MAN1B1) och två andra Golgi 1,{106}}mannosidaser, Golgi -mannosidas IB [MAN1A2] och Golgi -mannosidas IC [MAN1C1] [31,54–56]. Intressant nog tyder allt fler bevis på att -1,2-mannosidaser inte bara är inblandade i proteinveckning och mognad utan också spelar en avgörande roll i felveckat proteinnedbrytning [57–60]. Här visar vi att ManIA interagerar med den omogna formen av NKCC2 huvudsakligen vid cis-Golgi-nätverket och främjar dess nedbrytning av proteasomvägen, vilket avslöjar därför en ytterligare kontrollpunkt vid övervakning och avlägsnande av felveckade NKCC2-proteiner. Följaktligen kan dessa fynd öppna upp nya vägar för att studera ER- och Golgi-kvalitetskontrollen av NKCC2-proteiner för att hjälpa till med utvecklingen av nya strategier för att förebygga och/eller behandla njursjukdomar relaterade till avvikande NKCC2-handel och uttryck.

Cistanche tillägg

Material och metoder

1. Jäst två-hybridanalys

Jäst två-hybrid (Y2H) screening utfördes som beskrivits tidigare i detalj [51], med användning som bete den proximala regionen av NKCC2 C-terminalen (rester 661-1095). Kortfattat parades AH109 som uttrycker betet med Y187-jäststammen transformerad med ett humant njure-cDNA-bibliotek. För urvalet av positiva kloner som kodar för förmodade interagerande proteiner, odlades parade jästceller först på selektionsplattor med låg stringens (−Leu, −Trp, −His) och sedan på högstringenta selektionsplattor (−Leu, −Trp, −His, − Ade). Utvalda kolonier testades också för -galaktosidasaktivitet, och DNA från de positiva klonerna isolerades från jästceller med användning av RPM-jästplasmidisoleringskit (BIO 101 Systems). Efter att ha räddat bytesplasmiderna genom transformation till DH5-bakterier (Invitrogen) och isolering med användning av ett Qiagen-kit, sekvenserades cDNA-plasmider och utvärderades med hjälp av BLAST-programmet.

2. Plasmidkonstruktion och platsriktad mutagenes

Generering av WT Myc-NKCC2, oglykosylerad Myc-NKCC2 ((N442Q/N452Q) och WT EGFP-NKCC2 har tidigare beskrivits [45, 46, 51]. Den kodande sekvensen för ManIA från mus subklonades in i däggdjursexpressionsvektorn pcDNA3.1/V5 (Invitrogen, Paris, Frankrike) för att generera WT ManIA-V5-konstruktion. Plasmiden innefattande ManIA som saknar sin C-terminalsvans (ManIA-∆Cter) genererades genom amplifiering från WT MAnIAV5-expressionskonstruktionen med användning av framåtriktad primer 50 CCGGAGCGATGAAGTTCGTGCTGCTGC 30 50 TTTCTCTTTGCCATCAATTTC 30. Konstruktionen innehållande ManIA fri från dess N-terminala region (ManIA-∆Nter) genererades också från WT MAnIA-V5-plasmiden genom QuikChange platsriktad mutagenesmetod (Stratagene, Les Ulis, Frankrike) med användning av framåtriktad primer 50 3 0 och omvänd primer 50 ATTCCAAGCATGGGTCATCTACTCTTTGATCTTTGCCCTC 30. Alla mutationer och trunkationer bekräftades genom sekvensering.

3. Cellkultur

Opossum njurceller (OKP-celler) hölls i DMEM (Gibco 42430) kompletterat med 10 procent fetalt bovint serum (Eurobio, Les Ulis, Frankrike), penicillin (100 U/mL) och streptomycin (100 U/mL) vid 37 ◦ C i en fuktad atmosfär innehållande 5 procent CO2. Humana embryonala njure (HEK) 293-celler odlades i DMEM-medium kompletterat med 10 procent fetalt bovint serum och 1 procent penicillin/streptomycin. För plasmid-DNA-transfektion odlades celler till 60–70 procent konfluens innan de transfekterades övergående i 5 timmar med Lipofectamine plus kit enligt tillverkarens instruktioner (Invitrogen, Paris, Frankrike). För proteinnedbrytningsexperiment behandlades celler med MG132 (2 µM) eller klorokin (100 µM) 6 timmar före cellys, som tidigare beskrivits [53,61]. Kifunensine (Sigma k1140, Saint-Quentin-Fallavier, Frankrike) användes vid 25 µM 6 timmar före cellys.

4. Proteinberedning, immunblotting och immunutfällning

Efter transfektion tvättades cellerna med kall PBS innan de solubiliserades i en lysbuffert innehållande 12 0 mM Tris/Hepes, pH 7,4; 15 0 mM NaCl, 5 mM EDTA, 3 mM KCl; 1 procent (v/v) Triton X-100 och proteashämmare (Complete Roche 1697498, Meylan, Frankrike). Prover skördades sedan och centrifugerades vid 16,{{10}} rpm i 15 minuter vid 4 ◦C. För immunoutfällning solubiliserades celler med lysbuffert innehållande 0,4 M NaCl; 1,5 mM MgCl2; 10 mM Hepes, pH 7,9; 5 procent (volym/volym) glycerol; 0,5 procent (v/v) Nonidet P-40) och proteashämmare (Complete, Roche Diagnostics). Immunfällning utfördes med användning av anti-V5 (Invitrogen) eller anti-ManIA (Sigma) antikropp, och affinitetsrening med användning av protein G-agarospärlor (Dynabeads, Invitrogen, Paris, Frankrike). Efter inkubation med protein G-agarospärlor under 1 timme vid rumstemperatur tvättades immunkomplexet i PBS (Invitrogen). Proteinproverna kokades sedan i laddningsbuffert, kördes på en gradient av 7,5 procent eller 10 procent, eller 15 procent SDS-polyakrylamidgeler, och undersöktes med primära antikroppar av intresse och pepparrotsperoxidaskonjugerad sekundär antikropp. Proteiner visualiserades genom förbättrad kemiluminescensdetektion (Thermo Fisher Scientific, Les Ulis, Frankrike) enligt tillverkarens instruktioner.

5. Immuncytokemi

Tjugofyra–fyrtioåtta timmar efter transfektion tvättades konfluenta celler med PBS plus plus (pH 8, 1 mM MgCl2 och 0,1 mM CaCl2). Celler fixerades sedan med 2 procent paraformaldehyd i PBS under 20 min vid rumstemperatur innan de inkuberades med 50 mM NH4Cl och permeabiliserades med 0,1 procent Triton X-100 under 1 min. För att blockera ingen specifik antikroppsbindning, inkuberades celler med DAKO (antikroppsspädningsmedel med bakgrundsreducerande komponenter) under 30 min. Fixerade celler inkuberades under 1 timme vid rumstemperatur med den primära antikroppen av intresse. De primära antikropparna som används i denna studie är följande: mus anti-V5 (Invitrogen, Paris, Frankrike), mus anti-Myc (Takara, Clontech, Saint-Germain-en-Laye, Frankrike), rått anti-V5 (Abcam, Paris, Frankrike), kanin anti-Calnexin (Abcam), kanin anti-Giantin (Abcam), kanin anti-GM130 (Abcam), kanin anti-ManIA (Abcam), De sekundära antikropparna som används är följande: get anti-kanin Alexa Fluor 555 (Invitrogen), get anti-kanin Alexa Fluor 488 (Invitrogen), get anti-kanin FITC (DakoCytomation, Trappes, Frankrike), get anti-mus Texas röd (Invitrogen), get anti-råt Alexa Fluor 555 (Invitrogen), get anti-rått Alexa Fluor 488 (Invitrogen), Alexa Texas Red konjugerad anti-mus (Jackson ImmunoResearch, Ely, Storbritannien), kyckling anti-mus Alexa Fluor 647 (Invitrogen). Efter inkubationer med primära och sekundära antikroppar av intresse, tvättades cellerna sedan med PBS och monterades med Vectashield.

Herba Cistanche

6. Cykloheximid-Chase-analyser

För att övervaka stabiliteten och mognaden av NKCC2 tillsattes cykloheximid i en koncentration av 1 00 µM till OKP- eller HEK-celler 14-16 timmar efter transfektion med NKCC2-plasmider. Under jaktperioden samlades cellysat in 0, 1, 2 och 4 timmar efter cykloheximidbehandling och analyserades genom immunoblotting.

7. siRNA Knockdown

ManIA siRNA köptes från Dharmacon som ON-TARGET plus SMART pooler (L-012174-00-0005). HEK-celler transfekterades först med kontroll eller specifika ManIA siRNAs med Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) med hjälp av tillverkarens 0 specifikationer som utförts tidigare [46,53]. En dag efter siRNA-transfektion transfekterades celler med NKCC2-plasmider. Efter 24–48 timmar analyserades cellysat för varje protein med de angivna antikropparna.

8. Statistiska analyser

Data uttrycks som medelvärde ± SE. Skillnader mellan medelvärden utvärderades med hjälp av parade eller oparade t-tester eller ANOVA efter behov. p < 0.05 ansågs vara statistiskt signifikant.

Diskussion

Denna studie genomfördes för att få insikt i de molekylära mekanismerna som ligger bakom regleringen av ER-associerad nedbrytning under NKCC2 biogenes. Med hjälp av tvåhybridanalys av jäst och sam-immunutfällningsanalyser identifierade vi GolgiMannosidase IA som en ny NKCC2-bindningspartner. Associationen implicerar endast den omogna och högmannosglykosylerade formen av samtransportören och äger huvudsakligen rum i cis-Golgi-nätverket. Vi har funnit att ManIA knock-down ökar NKCC2-proteinöverflöd medan dess överuttryck har motsatt effekt. ManIA-samuttryck försämrade NKCC2-mognad genom att främja dess retention, återvinning till ER och nedbrytning via proteasomvägen. Viktigt är att NKCC2-vikningsmutanter är mer benägna för den ManIA-medierade ERAD-vägen. Dessa fynd kan hjälpa till att bättre förstå hur avvikelser i NKCC2-proteinhandel leder till Bartters syndrom, vilket är viktigt för att klargöra patofysiologin för BS1 och för att förbättra de tillgängliga behandlingarna.

Det är nu klart fastställt att trimning av mannos med klass I 1,2-mannosidaser är involverad i igenkänningsstadiet för ERAD av glykoproteiner eftersom denna process reduceras kraftigt av deras hämmare 1-deoximannojirimycin och kifunensine [67, 70–73]. Till en början trodde man, baserat på studier utförda huvudsakligen i jäst, att dessa föreningar hämmar ERAD genom att hämma ER 1,2-mannosidas I som i första hand klyver mannosen från den mellersta B-grenen av Man9 för att bilda Man8, en glykansignal föreslog att ERAD inleds [70,74]. Men i däggdjursceller är denna hypotes inte nödvändigtvis god med tanke på att både kifunensine och 1-deoxymannojirimycin också hämmar Golgi 1,2-mannosidaser. Dessutom fanns det ökande bevis i däggdjursceller som visar att ytterligare trimning av tre till fyra 1,2-kopplade mannosrester, för att bilda Man6GlcNAc2 (M6) eller Man5GlcNAc2 (M5), också bidrar till att utlösa nedbrytningen av felveckade glykoproteiner [ 32,75–77]. Det var dock inte klart vilka 1,2-mannosidaser som är ansvariga för denna ytterligare trimning. En kandidat är ER a 1,2-mannosidas I själv eftersom dess överuttryck leder till ökad mannostrimning och accelererad ERAD [78–80]. Andra möjliga kandidater kan vara ER-nedbrytningsförstärkande -mannosidasliknande (EDEM) proteiner eftersom både EDEM1 och EDEM3 rapporterades stimulera mannostrimning och accelerera glykoprotein ERAD när de överuttrycks i celler [81,82]. En annan möjlig kandidat skulle kunna vara Golgi mannosidas IA som trimmar Man9 till Man6 och Man5 [31,54]. Detta enzym och två andra Golgi 1,2-mannosidaser (IB och IC) visades förstärka nedbrytningen och mannostrimningen av ett ERAD-L-substrat, NHK 1-antitrypsin, när det överuttrycks i odlade celler [57]. I den aktuella studien visade vi bevis på en specifik interaktion av ManIA med NKCC2, ett njurtransmembranprotein. Viktigt är att vi visade att ManIA-association in vivo endast engagerar den omogna formen av samtransportören. Viktigast av allt gav vi bevis på att ManIA-bindning är involverad i retentionen och ER-associerad nedbrytning av NKCC2.

Cistanche kapslar

Vi har tidigare tillhandahållit bevis för att ERAD och export från ER utgör den betydande regulatorn av NKCC2-mognad och cellytexpression [8,44-46]. Faktum är att vi visade att majoriteten av nysyntetiserade NKCC2-proteiner är inriktade på ER-associerad nedbrytning som involverar proteasom- och lysosomvägarna [8,44-46,53]. Dessutom visade vi att STCH och proteinlektinet OS9 är engagerade i dessa processer genom att interagera med den omogna formen av NKCC2 huvudsakligen vid ER [46,53]. I likhet med OS9 och STCH föreslogs involveringen av ManIA i ERAD av samtransportören först i den aktuella studien av co-immunoprecipitationsanalyser som avslöjar att associationen av proteinerna endast involverar den omogna formen av NKCC2. Notera att borttagning av den cytoplasmatiska svansen av ManIA minskade men inte helt hämmade dess interaktion med NKCC2, vilket öppnade därför möjligheten för en interaktion av samtransportören med andra regioner av ManIA-protein. Dessutom, trots interaktionen av ManIA endast med den kärnglykosylerade och omogna formen av NKCC2, visade våra immuncytokemistudier att ManIA inte kolokaliserar med NKCC2 vid akuten. Med detta avseende är det värt att notera att ManIA rapporterades vara antingen i Golgi eller på akuten [31,83–85]. En annan oberoende studie rapporterade att mannosidas IA också kan finnas i kvalitetskontrollvesiklar [58]. Därför, eftersom cellfördelningen av ManIA kan bero på celltypen, genomförde vi vår studie i två olika njurcellinjer, OKP- och HEK-celler. Lokaliseringsstudierna som utfördes i dessa celler visade tydligt att ManIA uttrycks i Golgi-apparaten i båda cellinjerna och avslöjade att platsen för interaktion med samtransportören är cis-Golgi-nätverket. Observera att med tanke på att N-glykanen av glykoproteiner vid ingången till Golgi-apparaten fortfarande är av hög mannostyp, är det tänkbart att NKCC2-interaktion med ManIA verkligen kan inträffa vid cis-Golgi-nätverket. Med hjälp av siRNA och överuttrycksmetoder har vi visat att ManIA interagerar med den omogna NKCC2 för att främja dess ER-associerade nedbrytning. Viktigt är att ManIA-effekten på den mogna formen av NKCC2 förhindrades när den cytoplasmatiska svansen av ManIA raderades. Ännu mer imponerande, ManIA-effekten på både omogna och mogna former av NKCC2 upphävdes helt när enzymet berövades sin katalytiska domän. Dessutom förhindrades NKCC2-reglering av ManIA också i närvaro av proteasomhämmaren MG132, men inte med klorokin, en hämmare av lysosomal funktion, vilket indikerar att ManIA riktar den omogna formen av samtransportören till den proteasomberoende ERAD-vägen. För att ytterligare stödja rollen av ManIA i ERAD av NKCC2, testade vi också effekten av mannos-trimningshämmaren kifunensine. Intressant nog hämmade kifunensinebehandling ManIA-effekten på NKCC2, vilket indikerar att mannostrimning är en viktig process i ManIA-medierad ER-associerad nedbrytning av NKCC2. ManIA-effekten förhindrades dock inte helt av kifunensine, vilket innebär att, åtminstone delvis, ManIA-verkan på samtransportören inte är helt N-glykanberoende. Till stöd för denna uppfattning inhiberade mutationer av NKCC2-glykosyleringsställen inte ManIA-effekten på samtransportören helt, vilket bekräftar att, åtminstone under våra experimentella förhållanden, en del av ManIA-effekten kan vara N-Glycan-oberoende. Till stöd för denna uppfattning har Ron et al. gav bevis för att under ER-stressförhållanden, förstärkt uttryck av EDEM1, ett annat alfa-mannosidasprotein, kringgår mannos-trimningshändelsen och levererar glykoproteinet direkt till sena ERAD-stadier [86]. Faktum är att de tydligt visade att, vid överuttryck av EDEM1, blockerades inte nedbrytningen av glykoproteinet H2a av kifunensine [86]. Detta är av särskilt intresse eftersom vår experimentella miljö, dvs heterologt överuttryck av sekretoriska och membranproteiner (NKCC2) orsakar ER-stress [87–89] vilket åtminstone delvis kan förklara varaktigheten av en effekt av ManIA, oberoende av trimning av mannos. , på samtransportören under dessa förhållanden. Det är värt att notera att den återstående ManIA-effekten på oglykosylerat NKCC2-protein blockerades helt av MG132, vilket ytterligare bekräftar uppfattningen att ManIA främjar ERAD av NKCC2 i en proteasomberoende väg.

Ansamlingen av felveckade och aggregationsbenägna polypeptider är skadligt för cellulär hälsa [90-92]. Ett större antal (mer än 70) av mänskliga sjukdomar beror på defekter i veckningen av sekretoriska och membranproteiner [91,92]. För att förhindra felveckning av proteiner och upprätthålla proteinhomeostas i den sekretoriska vägen, har eukaryotceller flera kvalitetskontrollmekanismer (QC) [26]. De inkluderar ER-kvalitetskontroll (ERQC) via den endoplasmatiska retikulum-associerade nedbrytningsvägen (ERAD) [36,48] och ER-sida [93] Golgi kvalitetskontroll (QCG) [38] och plasmamembran (PM) kvalitetskontroll [94 ]. Därför inspekteras felveckade proteiner, i synnerhet transmembranproteiner med komplexa topologier som NKCC2, strikt av successiva kvalitetskontroller innan de når sina slutdestinationer [26,94]. Dessutom kan QC-vägar samarbeta för att effektivt motverka felveckningen av ett enda protein. Till exempel, även om de flesta felveckade transmembranproteiner bryts ned av ERAD, kan vissa avvikande proteiner, särskilt under ER-stressförhållanden, undkomma ER-övervakning för att packas in i COPII-vesiklar för anterograd trafik till Golgi [95-97]. Bevis som erhållits från flera studier stödjer uppfattningen att Golgi-apparaten fungerar som en QC-kontrollpunkt [26,38] Faktum är att felveckade eller omonterade proteiner som undviker ERAD och ER-page, lämnar ER och blir GQC-substrat som dirigeras till vakuolen/ lysosom för nedbrytning [26,38]. Med detta avseende är det mycket osannolikt att den lysosom/vakuolriktade GQC-vägen är mekanismen bakom ManIA-inducerad nedreglering av NKCC2, med tanke på att lysosomhämmaren klorokin inte förhindrade ManIA-effekten på samtransportören. En annan möjlighet är att vissa felveckade proteiner som kommer in i Golgi kan riktas mot proteasomal nedbrytning efter leverans tillbaka till akuten. Närmare bestämt fångar GQC de undkomna substraten troligen i cis-Golgi och cyklar tillbaka dem till ER för ERAD av proteasomen. Detta är av stort intresse eftersom vi visade att ManIA samlokaliserar med NKCC2 främst i cis-Golgi-nätverket. Dessutom, i motsats till klorokin, avskaffade proteasomhämmaren MG132 ManIA-effekten på NKCC2, vilket starkt tyder på att den proteasomriktade GQC är mycket troligt att vara den huvudsakliga vägen som styr NKCC2-reglering av ManIA. Att notera, en mycket ny studie i jäst föreslog att vissa felveckade proteiner som kommer in i Golgi kan riktas direkt mot proteasomal nedbrytning utan att cyklas tillbaka till akuten, en mekanism som kallas EGAD [98]. Men även om man inte kan utesluta denna ytterligare mekanism, visade vi tydligt att vid ManIA-samuttryck behålls NKCC2 till stor del vid akuten. Därför tyder våra data starkt på att ManIA främjar retention, återvinning och proteasomberoende ERAD av felveckade NKCC2-proteiner som initialt undkommer ER-kvalitetskontrollen.

Cistanche tubulosa

En uttömmande undersökning av mekanismerna bakom ERAD-maskineriet har gett flera nya insikter om hur ERAD bidrar till människors hälsa under både normala och sjuka tillstånd [48,92]. Vikten av ER-kvalitetskontroll i allmänhet, och ERAD-fenomenet i synnerhet, har nämnts i ett stort antal mänskliga patologier, kallade konformationssjukdomar [48,92]. När det gäller NKCC2 har vi tidigare dokumenterat att Bartters syndrom typ 1 är bland sjukdomar kopplade till ERAD-vägen [61]. Faktum är att även om distinkta cellulära vägar kan stå för NKCC2-förlust av funktion vid BS1-sjukdom, visade våra data att ER-associerad proteinnedbrytning är den vanligaste mekanismen som ligger till grund för BS1 [61]. Följaktligen är identifieringen av proteiner som binder specifikt till de omogna formerna av WT NKCC2 och dess vikningsmutanter viktig för att dechiffrera de molekylära mekanismerna som ligger till grund för regleringen av deras ERAD. I den aktuella studien gav vi bevis för att förutom WT NKCC2 interagerar ManIA med den omogna formen av NKCC2-mutanter A508T och Y998X. Dessutom visade vi att ManIA-samuttryck har en mer djupgående effekt på NKCC2-vikningsmutant A508T jämfört med WT NKCC2, vilket starkt tyder på att ManIA kan ha en viktig roll i ERAD av NKCC2-mutanter under BS1. Detta är av särskilt intresse eftersom vi tidigare rapporterat att A508T och Y998X finns kvar på akuten [45,61]. Med tanke på att våra immunlokaliseringsexperiment visade att ManIA, oberoende av uttryckssystemet, uttrycks i cis-Golgi-nätverket, tyder interaktionen av enzymet med dessa två NKCC2-mutanter starkt på att även om de flesta A508T och Y998X till stor del är fångade i akuten, det finns en betydande överföring av dessa två mutanter från akuten till cis-Golgi där de kan fångas upp av ManIA för att levereras tillbaka till akuten. Med detta avseende, Hosokawa et al. visade också att även om de flesta transfekterade NHK-proteiner finns kvar i ER, undvek några av dem ER-kvalitetskontrollen och nådde cis-Golgi där de trimmas av Golgi a 1,2-mannosidaser för att riktas mot ERAD [ 57]. Dessutom har flera nya studier visat att ERManI, som ursprungligen förutspåddes fungera i ER, också var lokaliserad till Golgi-komplexet i däggdjursceller, där det bidrar till en Golgi-baserad kvalitetskontrollpunkt som underlättar återhämtningen av infångade ERAD-substrat tillbaka till akuten [59,60,99]. Notera att ManIA, liksom NKCC2, är ett transmembranprotein, kan också tillfälligt interagera med samtransportören vid akuten, vilket gör att enzymet kan delta i genereringen av signalen som riktar sig mot felveckade NKCC2-proteiner för ERAD, antingen när de passerar genom akuten. eller på väg till Golgi.

Sammanfattningsvis fann vi att Golgi ManIA interagerar med den omogna formen av NKCC2 vid cis-Golgi för att främja dess ER-retention och påskynda dess ERAD genom proteasomvägen. Så vitt vi vet är detta den första studien som beskriver den betydande rollen för Golgi-kvalitetskontrollmekanismen i NKCC2-biogenes. Dessutom är detta också den första rapporten som ger bevis för att förutom luminala proteiner kan ManIA också vara involverad i ERAD av transmembranproteiner. Våra data tyder starkt på att ManIA manövrar inom en cis-Golgi-lokaliserad kvalitetskontrollpunkt för att fungera som ett backupsystem för ERAD-övervakning i akuten, vilket därför tillhandahåller ett kraftfullt extra nätverk för adekvat borttagning av oönskade felveckade NKCC2-proteiner som skyddar därför, celler från proteotoxicitet orsakad av bildandet av proteinaggregat, särskilt under Bartters syndromsjukdom. ManIA kan onekligen inte arbeta isolerat för att förmedla ERAD för samtransportören. På lämpligt sätt kan man rimligen postulera att ManIA fungerar i samverkan, sekventiellt eller samtidigt, med andra NKCC2-bindande proteiner och ERAD-komponenter, såsom OS9 [46] och STCH [53] för att förmedla ER-kvalitetskontrollen av cotransportern. I detta avseende föreslår vi en modell där, under ER-stressförhållanden: (1) OS9 är involverad i retentionen av felveckade NKCC2-proteiner vid ER och dess ERAD av proteasomen. (2) STCH spelar en avgörande roll i ERAD av NKCC2 genom proteasom- och lysosomvägarna. (3) Golgi ManIA bidrar till ERAD av NKCC2 genom att fånga felveckade NKCC2-proteiner som undgick ER kvalitetskontroll och leverera dem tillbaka till ER. Ytterligare experiment behövs för att avslöja den exakta mekanismen bakom denna modell. Den grundliga karakteriseringen och identifieringen av den specifika molekylära sammansättningen av ER- och Golgi-kvalitetskontrollerna av NKCC2 och dess sjukdomsframkallande mutanter kan erbjuda en grund för att definiera nya terapeutiska strategier som riktar in sig på samtransportörtransport från ER- och Golgi-nätverken till cellytan.

Referenser

1. Guyton, AC Blodtryckskontroll-särskild roll för njurarna och kroppsvätskorna. Science 1991, 252, 1813–1816. [CrossRef] [PubMed]

2. Lifton, RP; Gharavi, AG; Geller, DS Molekylära mekanismer för human hypertoni. Cell 2001, 104, 545–556. [CrossRef]

3. Castrop, H.; Schiessl, IM Physiology and patophysiology of the renal Na-K-2Cl cotransporter (NKCC2). Am. J. Physiol. Ren. Physiol. 2014, 307, F991–F1002. [CrossRef]

4. Greger, R.; Velazquez, H. Den kortikala tjocka stigande lem och tidiga distala hopvikta tubuli i urinkoncentrationsmekanismen. Kidney Int. 1987, 31, 590–596. [CrossRef] [PubMed]

5. Gamba, G. Molecular physiology and patophysiology of electroneutral katjon-klorid cotransporters. Physiol. Rev. 2005, 85, 423–493. [CrossRef] [PubMed]

6. Ares, GR; Caceres, PS; Ortiz, PA Molekylär reglering av NKCC2 i den tjocka stigande extremiteten. Am. J. Physiol. Ren. Physiol. 2011, 301, F1143–F1159. [CrossRef] [PubMed]

7. Komhoff, M.; Laghmani, K. Patofysiologi av antenatalt Bartters syndrom. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2017, 26, 419–425. [CrossRef] [PubMed]

8. Laghmani, K.; Beck, BB; Yang, SS; Seaayfan, E.; Wenzel, A.; Reusch, B.; Vitzthum, H.; Priem, D.; Demaretz, S.; Bergmann, K.; et al. Polyhydramnios, Transient Antenatal Bartter's Syndrome och MAGED2-mutationer. N. Engl. J. Med. 2016, 374, 1853–1863. [CrossRef]

9. Simon, DB; Lifton, RP Den molekylära grunden för ärftlig hypokalemisk alkalos: Bartters och Gitelmans syndrom. Am. J. Physiol. 1996, 271, F961–F966. [CrossRef]

10. Aviv, A.; Hollenberg, NK; Weder, A. Urinkaliumutsöndring och natriumkänslighet hos svarta. Hypertoni 2004, 43, 707–713. [CrossRef]

11. Hoorn, EJ; Walsh, SB; McCormick, JA; Furstenberg, A.; Yang, CL; Roeschel, T.; Paliege, A.; Howie, AJ; Conley, J.; Bachmann, S.; et al. Kalcineurinhämmaren takrolimus aktiverar den renala natriumklorid-samtransportören för att orsaka hypertoni. Nat. Med. 2011, 17, 1304–1309. [CrossRef] [PubMed]

12. Borschewski, A.; Himmerkus, N.; Boldt, C.; Blankenstein, KI; McCormick, JA; Lazelle, R.; Willnow, TE; Jankowski, V.; Plain, A.; Bleich, M.; et al. Kalcineurin och sorteringsrelaterad receptor med upprepningar av A-typ interagerar för att reglera njurens Na( plus )-K( plus )-2Cl(-) cotransporter. J. Am. Soc. Nephrol. 2016, 27, 107–119. [CrossRef]

13. Trudu, M.; Janas, S.; Lanzani, C.; Debaix, H.; Schaeffer, C.; Ikehata, M.; Citterio, L.; Demaretz, S.; Trevisani, F.; Ristagno, G.; et al. Vanliga icke-kodande UMOD-genvarianter inducerar saltkänslig hypertoni och njurskador genom att öka uttrycket av uromodulin. Nat. Med. 2013, 19, 1655–1660. [CrossRef]

14. Alvarez-Guerra, M.; Garay, RP Renal Na-K-Cl-samtransportör NKCC2 i Dahl-saltkänsliga råttor. J. Hypertens. 2002, 20, 721–727. [CrossRef]

15. Capasso, G.; Rizzo, M.; Evangelista, C.; Ferrari, P.; Geelen, G.; Lang, F.; Bianchi, G. Förändrat uttryck av njurens apikala plasmamembran Na plus transportörer i den tidiga fasen av genetisk hypertoni. Am. J. Physiol. Ren. Physiol. 2005, 288, F1173–F1182. [CrossRef]

16. Fenton, RA; Knepper, MA Musmodeller och urinkoncentrationsmekanismen under det nya millenniet. Physiol. Rev. 2007, 87, 1083–1112. [CrossRef] [PubMed]

17. Komhoff, M.; Laghmani, K. MAGED2: En ny form av antenatalt Bartters syndrom. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2018, 27, 323–328. [CrossRef]

18. Sands, JM Urinkoncentration och utspädning i den åldrande njuren. Semin. Nephrol. 2009, 29, 579–586. [CrossRef]

19. Tian, ​​Y.; Riazi, S.; Khan, O.; Klein, JD; Sugimura, Y.; Verbalis, JG; Ecelbarger, CA Renal ENaC-subenhet, Na-K-2Cl- och Na-Cl-samtransportörer i överflöd i åldrade, vattenbegränsade F344 x Brown Norway-råttor. Kidney Int. 2006, 69, 304–312. [CrossRef] [PubMed]

20. Schiessl, IM; Castrop, H. Reglering av NKCC2-skarvning och fosforylering. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2015, 24, 457–462. [CrossRef] [PubMed]

21. Davies, M.; Fraser, SA; Galic, S.; Choy, SW; Katerelos, M.; Gleich, K.; Kemp, BE; Montering, PF; Power, DA Nya mekanismer för Na plus retention vid fetma: Fosforylering av NKCC2 och reglering av SPAK/OSR1 av AMPK. Am. J. Physiol. Ren. Physiol. 2014, 307, F96–F106. [CrossRef]

22. Gamba, G. Reglering av NKCC2-aktivitet av SPAK trunkerade isoformer. Am. J. Physiol. Ren. Physiol. 2014, 306, F49–F50. [CrossRef] [PubMed]

23. Edwards, A.; Castrop, H.; Laghmani, K.; Vallon, V.; Layton, AT Effekter av NKCC2-isoformreglering på NaCl-transport i tjocka stigande lem och gula fläcken: En modelleringsstudie. Am. J. Physiol. Ren. Physiol. 2014, 307, F137–F146. [CrossRef]

24. Vitale, A.; Denecke, J. Den endoplasmatiska retikulumporten för den sekretoriska vägen. Växt. Cell 1999, 11, 615-628. [PubMed]

25. Caplan, MJ Membranpolaritet i epitelceller: Proteinsortering och etablering av polariserade domäner. Am. J. Physiol. 1997, 272, F425–F429. [CrossRef]

26. Sun, Z.; Brodsky, JL Proteinkvalitetskontroll i sekretionsvägen. J. Cell Biol 2019, 218, 3171-3187. [CrossRef] [PubMed]

27. Ruggiano, A.; Foresti, O.; Carvalho, P. Kvalitetskontroll: ER-associerad nedbrytning: Proteinkvalitetskontroll och vidare. J. Cell Biol. 2014, 204, 869–879. [CrossRef] [PubMed]

28. Ruddock, LW; Molinari, M. N-glykan bearbetning i ER kvalitetskontroll. J. Cell Sci. 2006, 119, 4373–4380. [CrossRef]

29. Molinari, M. N-glykanstruktur dikterar förlängning av proteinveckning eller början av bortskaffande. Nat. Chem. Biol. 2007, 3, 313–320. [CrossRef]

30. Hebert, DN; Garman, SC; Molinari, M. Glykankoden för det endoplasmatiska retikulum: Asparaginkopplade kolhydrater som proteinmognad och kvalitetskontrolltaggar. Trender Cell Biol. 2005, 15, 364–370. [CrossRef]

31. Igdoura, SA; Herscovics, A.; Lal, A.; Moremen, KW; Morales, CR; Hermo, L. Alfa-mannosidaser involverade i N-glykanbearbetning visar cellspecificitet och distinkt subkompartmentalisering inom Golgi-apparaten av celler i testiklarna och bitestiklarna. Eur. J. Cell Biol. 1999, 78, 441-452. [CrossRef]

32. Lederkremer, GZ; Glickman, MH Ett fönster av möjligheter: Timing av proteinnedbrytning genom trimning av sockerarter och ubiquitiner. Trender Biochem. Sci. 2005, 30, 297–303. [CrossRef] [PubMed]

33. Stanley, P.; Taniguchi, N.; Aebi, M. N-Glycans. I Essentials of Glycobiology, 3rd.; Varki, A., Cummings, RD, Esko, JD, Stanley, P., Hart, GW, Aebi, M., Darvill, AG, et al., Eds.; Cold Spring Harbor: New York, NY, USA, 2015; s. 99–111.

34. Barlowe, CK; Miller, EA Sekretoriskt proteinbiogenes och trafik i den tidiga sekretoriska vägen. Genetik 2013, 193, 383–410. [CrossRef]

35. Wu, X.; Rapoport, TA Mekanistiska insikter i ER-associerad proteinnedbrytning. Curr. Opin. Cell Biol. 2018, 53, 22–28. [CrossRef]

36. Sun, Z.; Brodsky, JL Nedbrytningsvägen för ett modellfelveckat protein bestäms av aggregationsbenägenhet. Mol. Biol Cell. 2018, 29, 1422–1434. [CrossRef]

37. Fresno, I.; Molinari, M. Proteasomal och lysosomal clearance av felaktiga sekretoriska proteiner: ER-associerad nedbrytning (ERAD) och ER-till-lysosom-associerad nedbrytning (ERLAD) vägar. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2019, 54, 153–163. [CrossRef] [PubMed]

38. Briant, K.; Johnson, N.; Swanton, E. Kvalitetskontrollsystem för transmembrandomäner fungerar vid det endoplasmatiska retikulum och Golgi-apparaten. PLoS ONE 2017, 12, e0173924. [CrossRef] [PubMed]

39. Jensen, TJ; Loo, MA; Pind, S.; Williams, DB; Goldberg, AL; Riordan, JR Flera proteolytiska system, inklusive proteasomen, bidrar till CFTR-bearbetning. Cell 1995, 83, 129-135. [CrossRef]

40. Ward, CL; Omura, S.; Kopito, RR Nedbrytning av CFTR genom ubiquitin-proteasomvägen. Cell 1995, 83, 121-127. [CrossRef]

41. Gong, Q.; Keeney, DR; Molinari, M.; Zhou, Z. Nedbrytning av trafficking-defekta långa QT-syndrom typ II mutantkanaler genom ubiquitin-proteasomvägen. J. Biol. Chem. 2005, 280, 19419–19425. [CrossRef]

42. O'Donnell, BM; Mackie, TD; Subramanya, AR; Brodsky, JL Endoplasmatisk retikulum-associerad nedbrytning av den renala kaliumkanalen, ROMK, leder till typ II Bartter-syndrom. J. Biol. Chem. 2017, 292, 12813–12827. [CrossRef] [PubMed]

43. Needham, PG; Mikoluk, K.; Dhakarwal, P.; Khadem, S.; Snyder, AC; Subramanya, AR; Brodsky, JL Den tiazidkänsliga NaCl-samtransportören är inriktad på chaperonberoende endoplasmatisk retikulum-associerad nedbrytning. J. Biol. Chem. 2011, 286, 43611–43621. [CrossRef] [PubMed]

44. Zaarour, N.; Demaretz, S.; Defontaine, N.; Zhu, Y.; Laghmani, K. Flera evolutionärt konserverade di-leucinliknande motiv i karboxylterminalen styr anterograd trafficking av NKCC2. J. Biol. Chem. 2012, 287, 42642–42653. [CrossRef]

45. Zaarour, N.; Demaretz, S.; Defontaine, N.; Mordasini, D.; Laghmani, K. Ett mycket konserverat motiv vid COOH-terminalen dikterar endoplasmatiska retikulumutgång och cellytexpression av NKCC2. J. Biol. Chem. 2009, 284, 21752–21764. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Seaayfan, E.; Defontaine, N.; Demaretz, S.; Zaarour, N.; Laghmani, K. OS9 Protein interagerar med Na-K-2Cl Co-transporter (NKCC2) och riktar in sig på dess omogna form för den endoplasmatiska retikulum-associerade nedbrytningsvägen. J. Biol. Chem. 2016, 291, 4487–4502. [CrossRef]

47. Brodsky, JL De skyddande och destruktiva rollerna som spelas av molekylära chaperoner under ERAD (endoplasmatisk-retikulum-associerad nedbrytning). Biochem. J. 2007, 404, 353–363. [CrossRef]

48. Guerriero, CJ; Brodsky, JL Den känsliga balansen mellan utsöndrad proteinveckning och endoplasmatisk retikulum-associerad nedbrytning i mänsklig fysiologi. Physiol. Rev. 2012, 92, 537–576. [CrossRef]

49. Ahner, A.; Gong, X.; Frizzell, RA Nedbrytning av cystisk fibros transmembrankonduktansregulator: Cross-talk mellan ubiquitylerings- och SUMOyleringsvägarna. FEBS J. 2013, 280, 4430–4438. [CrossRef]

50. Donnelly, BF; Needham, PG; Snyder, AC; Roy, A.; Khadem, S.; Brodsky, JL; Subramanya, AR Hsp70 och Hsp90 multichaperonkomplex reglerar sekventiellt tiazidkänsliga samtransportörendoplasmatiska retikulum-associerade nedbrytning och biogenes. J. Biol. Chem. 2013, 288, 13124–13135. [CrossRef]

51. Benziane, B.; Demaretz, S.; Defontaine, N.; Zaarour, N.; Cheval, L.; Bourgeois, S.; Klein, C.; Froissart, M.; Blanchard, A.; Paillard, M.; et al. NKCC2 ytuttryck i däggdjursceller: nedreglering genom ny interaktion med aldolas BJ Biol. Chem. 2007, 282, 33817–33830. [CrossRef]

52. Zaarour, N.; Defontaine, N.; Demaretz, S.; Azroyan, A.; Cheval, L.; Laghmani, K. Sekretoriskt bärarmembranprotein 2 reglerar exocytiskt införande av NKCC2 i cellmembranet. J. Biol. Chem. 2011, 286, 9489–9502. [CrossRef]

53. Bakhos-Douaihy, D.; Seaayfan, E.; Demaretz, S.; Komhoff, M.; Laghmani, K. Differentiella effekter av STCH och stressinducerbar Hsp70 på stabiliteten och mognaden av NKCC2. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 2207. [CrossRef]

54. Herscovics, A.; Schneikert, J.; Athanassiadis, A.; Moremen, KW Isolering av ett mus-Golgi-mannosidas-cDNA, en medlem av en genfamilj konserverad från jäst till däggdjur. J. Biol. Chem. 1994, 269, 9864–9871. [CrossRef]

55. Tempel, W.; Karaveg, K.; Liu, ZJ; Rose, J.; Wang, BC; Moremen, KW Strukturen av mus Golgi alfa-mannosidas IA avslöjar den molekylära grunden för substratspecificitet bland klass 1 (familj 47 glykosylhydrolaser) alfa1,2-mannosidaser. J. Biol. Chem. 2004, 279, 29774–29786. [CrossRef]

56. Tulsiani, DR; Touster, O. Reningen och karakteriseringen av mannosidas IA från råttlever Golgi-membran. J. Biol. Chem. 1988, 263, 5408-5417. [CrossRef]

57. Hosokawa, N.; Du, Z.; Tremblay, LO; Nagata, K.; Herscovics, A. Stimulering av ERAD av felvikt noll Hong Kong alfa1- antitrypsin av Golgi alpha1,2-mannosidaser. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007, 362, 626–632. [CrossRef] [PubMed]

58. Ogen-Shtern, N.; Avezov, E.; Shenkman, M.; Benyair, R.; Lederkremer, GZ Mannosidase IA är i kvalitetskontrollvesiklar och deltar i glykoproteininriktning mot ERAD. J. Mol. Biol. 2016, 428, 3194–3205. [CrossRef]

59. Iannotti, MJ; Figard, L.; Sokac, AM; Sifers, RN Ett Golgi-lokaliserat mannosidas (MAN1B1) spelar en icke-enzymatisk gatekeeper-roll i proteinbiosyntetisk kvalitetskontroll. J. Biol. Chem. 2014, 289, 11844–11858. [CrossRef] [PubMed]

60. Pan, S.; Cheng, X.; Sifers, RN Golgi-situerad endoplasmatisk reticulum alfa-1, 2-mannosidas bidrar till återvinningen av ERAD-substrat genom direkt interaktion med gamma-COP. Mol. Biol. Cell 2013, 24, 1111–1121. [CrossRef] [PubMed]

61. Shaukat, I.; Bakhos-Douaihy, D.; Zhu, Y.; Seaayfan, E.; Demaretz, S.; Frachon, N.; Weber, S.; Komhoff, M.; Vargas-Poussou, R.; Laghmani, K. Nya insikter om rollen av endoplasmatisk retikulum-associerad nedbrytning i Bartter Syndrome Typ 1. Hum. Mutat. 2021, 42, 947–968. [CrossRef]

62. Fujita, E.; Kouroku, Y.; Isoai, A.; Kumagai, H.; Misutani, A.; Matsuda, C.; Hayashi, YK; Momoi, T. Två system för endoplasmatisk retikulum-associerad nedbrytning (ERAD) för den nya varianten av mutant dysferlin: Ubiquitin/proteasom ERAD(I) och autophagy/lysosom ERAD(II). Brum. Mol. Genet. 2007, 16, 618–629. [CrossRef]

63. Bernasconi, R.; Molinari, M. ERAD och ERAD tuning: Bortskaffande av last och ERAD regulatorer från däggdjurs ER. Curr. Opin. Cell. Biol. 2011, 23, 176–183. [CrossRef]

64. Arvan, P.; Zhao, X.; Ramos-Castaneda, J.; Chang, A. Sekretorisk väg kvalitetskontroll som verkar i Golgi, plasmalemma och endosomala system. Trafik 2002, 3, 771–780. [CrossRef]

65. Stolz, A.; Wolf, DH Endoplasmatisk retikulum-associerad proteinnedbrytning: En chaperone assisterad resa till helvetet. Biochim. Biophys. Acta 2010, 1803, 694–705. [CrossRef] [PubMed]

66. Wang, F.; Song, W.; Brancati, G.; Segatori, L. Hämning av endoplasmatisk retikulum-associerad nedbrytning räddar infödd veckning i förlust av funktion protein felveckningssjukdomar. J. Biol. Chem. 2011, 286, 43454–43464. [CrossRef] [PubMed]

67. Tokunaga, F.; Broström, C.; Koide, T.; Arvan, P. Endoplasmatiskt retikulum (ER)-associerad nedbrytning av felveckade N-länkade glykoproteiner undertrycks vid hämning av ER-mannosidas IJ Biol. Chem. 2000, 275, 40757–40764. [CrossRef] [PubMed]

68. Groisman, B.; Shenkman, M.; Ron, E.; Lederkremer, GZ Mannostrimning krävs för leverans av ett glykoprotein från EDEM1 till XTP3-B och sena endoplasmatiska retikulum-associerade nedbrytningssteg. J. Biol. Chem. 2011, 286, 1292–1300. [CrossRef] [PubMed]

69. Vargas-Poussou, R.; Feldmann, D.; Vollmer, M.; Konrad, M.; Kelly, L.; van den Heuvel, LP; Tebourbi, L.; Brandis, M.; Karolyi, L.; Hebert, SC; et al. Nya molekylära varianter av Na-K-2Cl cotransporter-genen är ansvariga för antenatalt Bartter-syndrom. Am. J. Hum. Genet. 1998, 62, 1332-1340. [CrossRef] [PubMed]

70. Helenius, A.; Aebi, M. Roller av N-länkade glykaner i det endoplasmatiska retikulum. Annu. Rev. Biochem. 2004, 73, 1019–1049. [CrossRef]

71. Spiro, RG Roll av N-länkade polymannosoligosackarider i målinriktning på glykoproteiner för endoplasmatisk retikulum-associerad nedbrytning. Cell Mol. Life Sci. 2004, 61, 1025–1041. [CrossRef]

72. Marcus, NY; Perlmutter, DH Glukosidas- och mannosidashämmare medierar ökad utsöndring av mutant alfa1-antitrypsin ZJ Biol. Chem. 2000, 275, 1987–1992. [CrossRef]

73. Liu, Y.; Choudhury, P.; Cabral, CM; Sifers, RN Intracellulär bortskaffande av ofullständigt veckat humant alfa1-antitrypsin involverar frisättning från calnexin och posttranslationell trimning av asparaginkopplade oligosackarider. J. Biol. Chem. 1997, 272, 7946–7951. [CrossRef] [PubMed]

74. Cabral, CM; Liu, Y.; Sifers, RN Dissekering av glykoproteinkvalitetskontroll i sekretionsvägen. Trender Biochem. Sci. 2001, 26, 619–624. [CrossRef]

75. Ermonval, M.; Kitzmuller, C.; Mir, AM; Cacan, R.; Ivessa, NE N-glykanstrukturen av en kortlivad variant av riboforin I uttryckt i den MadIA214 glykosyleringsdefekta cellinjen avslöjar rollen av ett mannosidas som inte är ER mannosidas I i processen för glykoproteinnedbrytning. Glycobiology 2001, 11, 565–576. [CrossRef] [PubMed]

76. Foulquier, F.; Duvet, S.; Klein, A.; Mir, AM; Chirat, F.; Cacan, R. Endoplasmatisk retikulum-associerad nedbrytning av glykoproteiner som bär Man5GlcNAc2- och Man9GlcNAc2-arter i MI8-5 CHO-cellinjen. Eur. J. Biochem. 2004, 271, 398–404. [CrossRef]

77. Avezov, E.; Frenkel, Z.; Ehrlich, M.; Herscovics, A.; Lederkremer, GZ Endoplasmic reticulum (ER) mannosidas I är kompartmentaliserat och krävs för N-glykantrimning till Man5-6GlcNAc2 i glykoprotein ER-associerad nedbrytning. Mol. Biol. Cell 2008, 19, 216–225. [CrossRef]

78. Hosokawa, N.; Tremblay, LO; Du, Z.; Herscovics, A.; Wada, I.; Nagata, K. Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) nedbrytning av felveckat Null Hong Kong alfa1-antitrypsin av humant ER mannosidas IJ Biol. Chem. 2003, 278, 26287–26294. [CrossRef]

79. Sifers, RN Cellbiologi. Proteinnedbrytning låst upp. Science 2003, 299, 1330–1331. [CrossRef]

80. Wu, Y.; Swulius, MT; Moremen, KW; Sifers, RN Belysning av den molekylära logiken genom vilken felvikt alfa-1-antitrypsin företrädesvis väljs för nedbrytning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003, 100, 8229–8234. [CrossRef] [PubMed]

81. Hirao, K.; Natsuka, Y.; Tamura, T.; Wada, I.; Morito, D.; Natsuka, S.; Romero, P.; Sleno, B.; Tremblay, LO; Herscovics, A.; et al. EDEM3, en löslig EDEM-homolog, förbättrar glykoproteinendoplasmatiskt retikulum-associerad nedbrytning och mannostrimning. J. Biol. Chem. 2006, 281, 9650–9658. [CrossRef]

82. Olivari, S.; Cali, T.; Salo, KE; Paganetti, P.; Ruddock, LW; Molinari, M. EDEM1 reglerar ER-associerad nedbrytning genom att accelerera de-mannosylering av veckningsdefekta polypeptider och genom att hämma deras kovalenta aggregering. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006, 349, 1278–1284. [CrossRef] [PubMed]

83. Bieberich, E.; Bause, E. Man9-mannosidas från den mänskliga njuren uttrycks i COS-celler som ett Golgi-resident typ II transmembrant N-glykoprotein. Eur. J. Biochem. 1995, 233, 644–649. [CrossRef] [PubMed]

84. Velasco, A.; Hendricks, L.; Moremen, KW; Tulsiani, DR; Touster, O.; Farquhar, MG Celltypsberoende variationer i den subcellulära fördelningen av alfa-mannosidas I och II. J. Cell Biol. 1993, 122, 39-51. [CrossRef] [PubMed]

85. Bieberich, E.; Treml, K.; Volker, C.; Rolfs, A.; Kalz-Fuller, B.; Bause, E. Man9-mannosidas från grislever är ett typ II-membranprotein som finns i det endoplasmatiska retikulumet. cDNA-kloning och uttryck av enzymet i COS 1-celler. Eur. J. Biochem. 1997, 246, 681-689. [CrossRef]

86. Ron, E.; Shenkman, M.; Groisman, B.; Izenshtein, Y.; Leitman, J.; Lederkremer, GZ Bypass av glykanberoende glykoproteinleverans till ERAD genom uppreglerad EDEM1. Mol. Biol. Cell 2011, 22, 3945–3954. [CrossRef]

87. Casagrande, R.; Stern, P.; Diehn, M.; Shamu, C.; Osario, M.; Zuniga, M.; Brown, PO; Ploegh, H. Nedbrytning av proteiner från ER hos S. cerevisiae kräver en intakt oveckad proteinresponsväg. Mol. Cell 2000, 5, 729–735. [CrossRef]

88. Schroder, M.; Kaufman, RJ ER stress och det ovikta proteinsvaret. Mutat. Res. 2005, 569, 29–63. [CrossRef]

89. Liang, CJ; Chang, YC; Chang, HC; Wang, CK; Hung, YC; Lin, YE; Chan, CC; Chen, CH; Chang, HY; Sang, TK Derlin-1 reglerar mutant VCP-kopplad patogenes och endoplasmatisk retikulum stressinducerad apoptos. PLoS Genet. 2014, 10, e1004675. [CrossRef] [PubMed]

90. Houck, SA; Singh, S.; Cyr, DM Cellulära svar på felveckade proteiner och proteinaggregat. Metoder Mol. Biol. 2012, 832, 455–461. [CrossRef] [PubMed]

91. Chaudhuri, TK; Paul, S. Protein-felveckningssjukdomar och chaperone-baserade terapeutiska metoder. FEBS J. 2006, 273, 1331–1349. [CrossRef]

92. Yadav, K.; Yadav, A.; Vashistha, P.; Pandey, VP; Dwivedi, UN Protein Misfolding Diseases and Therapeutic Approaches. Curr. Protein. Pept. Sci. 2019, 20, 1226–1245. [CrossRef]

93. Fresno, I.; Molinari, M. Endoplasmatisk retikulumomsättning: ER-sida och andra smaker i selektiv och icke-selektiv ER-rensning. F1000Res 2018, 7, 454. [CrossRef]

94. Okiyoneda, T.; Apaja, PM; Lukacs, GL Proteinkvalitetskontroll vid plasmamembranet. Curr. Opin. Cell Biol. 2011, 23, 483–491. [CrossRef]

95. Caldwell, SR; Hill, KJ; Cooper, AA Nedbrytning av kvalitetskontrollsubstrat för endoplasmatiskt retikulum (ER) kräver transport mellan ER och Golgi. J. Biol. Chem. 2001, 276, 23296–23303. [CrossRef] [PubMed]

96. Taxis, C.; Vogel, F.; Wolf, DH ER-Golgi-trafik är en förutsättning för effektiv ER-nedbrytning. Mol. Biol. Cell 2002, 13, 1806–1818. [CrossRef] [PubMed]

97. Vashist, S.; Ng, DT Felveckade proteiner sorteras med en sekventiell kontrollpunktsmekanism för ER-kvalitetskontroll. J. Cell Biol. 2004, 165, 41–52. [CrossRef] [PubMed]

98. Schmidt, O.; Weyer, Y.; Baumann, V.; Widerin, MA; Eising, S.; Angelova, M.; Schleiffer, A.; Kremser, L.; Lindner, H.; Peter, M.; et al. Endosom och Golgi-associerad nedbrytning (EGAD) av membranproteiner reglerar sfingolipidmetabolism. EMBO J. 2019, 38, e101433. [CrossRef]

99. Pan, S.; Wang, S.; Utama, B.; Huang, L.; Blok, N.; Estes, MK; Moremen, KW; Sifers, RN Golgi lokalisering av ERManI definierar den rumsliga separationen av kvalitetskontrollsystemet för däggdjursglykoprotein. Mol. Biol. Cell 2011, 22, 2810–2822. [CrossRef]

Sylvie Demaretz 1,2, Elie Seaayfan 1,2,† , Dalal Bakhos-Douaihy 1,2, Nadia Frachon 1,2, Martin Kömhoff 3 och Kamel Laghmani 1,2,

1 Centre de Recherche des Cordeliers, Sorbonne Université, Inserm, Université de Paris, F-75006 Paris, Frankrike; sylvie.demaretz@sorbonne-universite.fr (SD); elie.seaayfan@uni-marburg.de (ES); dalal.bakhos_aldouaihy@sorbonne-universite.fr (DB-D.); nadia.frachon@sorbonne-universite.fr (NF)

2 CNRS, ERL8228, F-75006 Paris, Frankrike

3 Division of Pediatric Nephrology and Transplantation, University Children's Hospital, Philipps-University, 35043 Marburg, Tyskland; Martin.Koemhoff@uk-gm.de