Baserat på nätverksfarmakologi och djurexperiment för att utforska effekten av fenyletanoidglykosid av Cistanche Tubulosa på effekten av diabetesnefropati

Sammanfattning: Mål Att utforska effekten avCistanchefenyletanolglykosider(CPhGs) pådiabetisk njursjukdom(DKD) baserad på nätverksfarmakologi och djurförsök. Metoder UHPLC-QE-MS-metoden användes för att analyserakemiska komponenter i CPhG. TCMSP och Swiss Target Prediction-databaser användes för att screena kärnkomponenter. OMIM och GeneCards databaser användes för att erhålla DKD-relaterade mål. Efter att ha erhållit gemensamma mål, användes STRING-webbplatsen för att konstruera ett proteininteraktionsnätverk. DAVID-databasen användes för GO, KEGG pathway-analys och Cytoscape-mjukvaran användes för att konstruera "CPhGs core component-target-pathway"-nätverket. Tio råttor valdes slumpmässigt ut som den normala gruppen, och de återstående råttorna matades med foder med högt socker och hög fetthalt och gavs en enda intraperitoneal injektion av STZ för att etablera en DKD-modell. De delades in i modellgrupp, dapagliflozin (1 mg/kg) grupp och CPhGs hög och Medium och låg dos (500, 25{{40}}, 125 mg/kg) grupper, 10 djur i varje grupp, läkemedelsintervention under 6 veckor, allmänna tillstånd observerades, kroppsvikt bestämdes och blodsocker testades varje vecka; 24 timmars urin samlades in efter den sista dosen. Upptäck 24-timme totalt urinprotein (24-UTP); samla in blod från bukaortan och offra det, separera serum och upptäck ureakväve (BUN), urinsyra (UA), totalkolesterol (TC), triglycerider (TG) och högt blodtryck. Nivåer av högdensitetslipoprotein (HDL) och lågdensitetslipoprotein (LDL), HE-färgning och Masson-färgning användes för att observera patologiska förändringar i njurvävnad, ELISA användes för att detektera serum IL-1, IL{{17} } och TNF-nivåer, och Western blot användes för att detektera njurvävnad. JAK2, p-JAK2, STAT3, p STAT3, SOCS3 proteinuttryck. Resultat Totalt 699 komponenter upptäcktes med UHPLC-QE-MS-teknologi. Efter screening erhölls 16 kärnkomponenter av CPhG och 323 relaterade mål. CPhGs och DKD delade 99 mål. Nyckelmålen var STAT3, SRC, EGFR, etc. KEGG-väganalys screenade 151 signalvägar, vilket visade att IL-17-signalvägen, PI3K/Akt-signalvägen, TNF-signalvägen etc. kan spela en nyckelroll i behandling av DKD av CPhGs. CPhG kan öka kroppsvikten hos DKD-råttor (P＜0.01), minska vattenförbrukningen (P＜0.01), reglera glukos- och lipidmetabolism, minska 24-UTP- och BUN-nivåer (P＜0.01) och förbättra njurvävnad . Patologisk skada minskade proteinuttrycket av p-JAK2/JAK2 och p-STAT3/STAT3 i njurvävnad (P＜0,01) och ökade proteinuttrycket av SOCS3 (P＜0,01). Slutsats CPhG intervenerar i DKD genom flera komponenter, flera mål och flera vägar, möjligen genom att hämma JAK2/

STAT3 signalväg.

Nyckelord: Cistanche fenyletanolglykosid; Diabetisk nefropati; UHPLC-QE-MS; nätverksfarmakologi; djurförsök; JAK2 /STAT3 signalväg

HUR LÅNGE TAR DET FÖR CISTANCHE ATT ARBETA FÖR NJURPATIENTER?

Diabetisk njursjukdom (DKD), som en av de viktigaste mikrovaskulära komplikationerna av diabetes, är inte bara den primära faktorn som leder tillkronisk njursjukdommen också den främsta orsaken till end-stage renal disease (ESRD) över hela världen. Orsak [1-2]. Klinisk behandling av DKD innebär främst att kontrollera blodsocker, blodtryck och blodlipider, och för det andra att skydda njurfunktionen, undvika användning av nefrotoxiska läkemedel och förbättra livsstilen [3-4]. Men på grund av den komplexa patogenesen av DKD och avsaknaden av specifika interventionsmål har nuvarande behandlingsalternativ begränsningar och är inte effektiva. Förekomsten av DKD i slutstadiet ökar fortfarande. Därför är det av stor betydelse att hitta effektiva naturläkemedel.

Cistanche Deserticola Y. C． mamma ellerCistanche C.De torkade köttiga stjälkarna avCistanche tubulosa (Schenk) Wightmed fjällande löv [5] registrerades först i "Shen Nong's Materia Medica" och listades som toppklass. De är kända som "ökenginseng" [6]. De är söta, salta och varma. , återgår till njurens och tjocktarmens meridianer och har effekterna av att ge näring till njurens yang, fylla på essens och blod, fukta tarmarna och laxermedel. Forskning visar att fenyletanoidglykosider (CPhG) är en av dess huvudsakliga aktiva ingredienser och är ansvariga för dess utveckling.

Den materiella grunden för att utöva farmakologiska effekter; Cistanche-extrakt har antidiabetiska [7-8], anti-levercancer [9], njurskydd [10-11], neuroprotektiva [12-13] och andra farmakologiska effekter, men för närvarande är CPhGs är inte effektiva vid behandling av DKD. Dess effekter och mekanismer är oklara.

Den här studien använde nätverksfarmakologi och molekylära dockningsmetoder [14], tog CPhGs som forskningsobjekt, förutspådde och analyserade dess huvudsakliga aktiva ingredienser och potentiella mål för behandling av DKD, och etablerade sedan en kombination av streptozocin (STZ)-inducerad hög. DKD-råttmodell matad med lipidfoder användes som föremål för in vivo-forskning, för att ge referens för den kliniska expansionen och tillämpningen av relaterade behandlingar och ytterligare forskning om verkningsmekanismen.

1 material

1.1 Djur

70-veckogamla SD-hanråttor med SPF-nivå, kroppsvikt (240±20) g, köptes från Animal Experiment Center vid Xinjiang Medical University [Experimental Animal Use License No. SYXK (ny) {{4} }], at Djuren föds upp adaptivt under 1 vecka vid en temperatur av (22 ±2) grader, en relativ fuktighet på 50 % till 70 % och en 12 h/12 ​​h omväxlande ljus- och mörkcykel. Experimentet godkändes av Animal Ethics Committee vid Medical Experimental Animal Center vid Xinjiang Medical University (etiknummer IACUC-20220127-19).

1.2 Reagenser och läkemedel

CPhGs (batch number 201610, purity >80 %) tillhandahölls av Xinjiang Hotan Dichen Co., Ltd. Dapagliflozin (batchnummer NB2248) köptes från AstraZeneca, Storbritannien. Foder med hög sockerhalt och hög fetthalt (kat. nr. Boaigang-B1135DM) och STZ (sats nr. 2021110307) köptes från Beijing Boai Port Biotechnology Co., Ltd.; urin mikroalbumin (batch nr. 20220611), ureakväve (batch nr. 20220626), urinsyra (batch nr. 20220613), totalt kolesterol (batchnummer 20220615), triglycerider (batchnummer 20220626), (högt antal 2022061) protein (2022201) ), och lågdensitetslipoprotein (batchnummer 20220615) köptes från Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute; interleukin-6 (IL-6, partinummer JL20896), interleukin-1 (IL-1, partinummer JL20884) och tumörnekrosfaktor- (TNF-, partinummer 13202 ) köptes från Shanghai Jianglai Biotechnology Co., Ltd.; JAK2 kanin polyklonal antikropp (lot nummer 22v9316), p-JAK2 kanin polyklonal antikropp (lot nummer 78g9360), STAT3 kanin polyklonal antikropp (lot nummer 15x8824), p-STAT3 kanin polyklonal antikropp (lot nummer 7 8n), SOm137al 8n nummer 31d4841) köptes alla från Jiangsu Qianke Biotechnology Research Center Co., Ltd.; HRP-märkt get-anti-kanin-IgG polyklonal antikropp (satsnummer 20000758) köptes från Wuhan Mitaka Biotechnology Co., Ltd.; -aktin kanin monoklonal antikropp (batchnummer AC230205001), RIPA-lysbuffert (batchnummer 20220416), BCA Proteinkoncentrationsbestämningskit (batchnummer 20230401) köptes från Beijing Solebao Technology Co., Ltd.

1. 3 Instrument

Vanquish ultrahögpresterande vätskekromatografi, Q Exactive Focus högupplöst masspektrometer, Heraeus Fresco17 centrifug, FC automatisk mikroplattläsare (Thermo Fisher Scientific, USA); JXFSTPRP-24-kvarn (Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd.); Mingche D24 UV rent vattenmätare (Tyskland Merck Millipore Company); ACQUITY UPLC BEH C18-kolonn (1,7 μm, 2,1 mm×100 mm) (American Waters Company); Accu Chek Performa blodsockermätare (Swiss Roche Company); CM1850UV kryostat, DM300 upprätt fluorescensmikroskop (Leica Company, Tyskland); GL-88B vortexmätare (Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.); elektronisk analytisk balans (Bio-Rad Company, USA).

2 metoder

2. 1 UHPLC-QE-MS analys

2.1.1 Beredning av testlösning

Väg 100 mg CPhGs, tillsätt 500 μL 80 % metanol, vortexa i 30 s, ultraljudsbehandling i ett isvattenbad i 1 timme, låt stå vid -40 grad i 1 timme, centrifugera vid 4 grader , 12 000 r/min i 15 minuter, aspirera supernatanten, 0. Filtrera genom ett 22μm mikroporöst membran och förvara i ett -80 graders kylskåp.

2.1.2 Kromatografiska förhållanden

ACQUITY UPLC BEH C18 kolumn (1,7 μm, 2,1 mm × 100 mm); mobilfas acetonitril (A) -1% myrsyra (B), gradienteluering (0 ~ 11 min, 15% ~ 75% A; 11 till 12 min, 75% till 98% A; 12 till 14 min, 98 % A; 14 till 14,1 min, 98 % till 15 % A; Volymflöde 0 . 5 ml/min; kolonntemperatur 35 grader; injektionsvolym 5 μL.

2.1.3 Masspektrometriförhållanden

fullskanning ddMS2 fullskanningsläge; mantelgasvolymflödeshastighet 45 arb; hjälpgasvolymflöde 15 arb; kapillärtemperatur 400 grader ; kollisionsenergi i NCE-läge 15% ~ 30% ~ 45% cykel; sprayspänning ± 4,0 kV.

2.2 Nätverksfarmakologiforskning

2. 2. 1 CPhGs

Komponentmålscreening: Sortera de kemiska komponenterna som analyserats med UHPLC-QE-MS efter relativt innehåll, och ta bort de vars kemiska strukturer ännu inte har fastställts. Ange InChIKey-serienumret för de screenade ingredienserna i TCMSP-databasen för att få fram de farmakokinetiska parametrarna för varje ingrediens. Baserat på villkoren för oral biotillgänglighet (OB) > 30% och läkemedelslikhet (DL) > 0,18, kommer kandidater som uppfyller kraven att screenas. Ange SMILES-numret för varje komponent i Swiss Target Prediction-databasen för att förutsäga målet och erhålla CPhGs kemiska komponentmål.

2. 2. 2 DKD

Målscreening för sjukdomar Använd "diabetisk nefropati" som sökterm för att söka efter sjukdomsmål i OMIM-, GeneCards- och NCBI-databaser.

2. 2. 3 Komponent-mål-sjukdom nätverkskonstruktion

Korsmålen för CPhGs komponenter och sjukdomar erhölls genom R-mappning, och Cytoscape 3.7.2-programvaran användes för att konstruera ett komponent-målnätverkssystem, där analyspluginen upptäckte kärnmål.

2. 2. 4 Konstruktion av protein-protein interaktionsnätverk (PPI)

Importera intersektionsmålproteinerna för komponenter och sjukdomar till STRING-databasen, konstruera ett protein-protein-interaktionsnätverk (PPI), ta bort proteiner utan anslutna noder i nätverket och ställ in konfidensnivån för den lägsta proteininteraktionspoängen till {{1} }.700. Konstruera ett PPI-nätverk, ladda ner dess TSV-formatresultat, importera dem till Cytoscape 3.7.2-programvaran och använd analysplugin för att ytterligare screena kärnmål.

2. 2. 5 GO, KEGG-analys

Använd avsnittet Functional Annotation i DAVID-databasen för att utföra anrikningsanalys på skärningspunkterna för komponentsjukdomar. Ställ först in analysparametrarna, skriv in skärningspunkten i rutan Genlista, välj officiell-gen-symbol som målidentifierare, välj Genlista som datatyp (List Type) och välj "Homo Sapiens (Art)" som målkälla (Art). Race)", starta analysen efter att ha bekräftat analysparametrarna, erhåll GO- och KEGG-analysresultaten och använd sedan ImageGP-ritningsplattformen online för att rita bubbeldiagrammet för KEGG- och GO-analysresultaten. Cytoscape 3.7.2-mjukvaran konstruerar komponenten -target-pathway nätverksbild.

2. 2. 6 Molekylär dockning

Ladda först ner 3D-strukturdiagrammet för den aktiva ingrediensen i SDF-format från PubChem-databasen, ladda sedan ner 3D-strukturdiagrammet för skärningsobjektet i PDB-format från US Global Protein Database (PDB), och ladda slutligen upp det till CB-Dock webbplats för molekylär dockning. Avskärma de dominerande dockningskonformationerna och visualisera dem med Pymol.

2.3 Djurförsök

2.3.1 Modellering, gruppering och läkemedelsadministration

10 råttor valdes slumpmässigt ut som den normala gruppen och matades med vanligt foder, och de återstående råttorna matades med foder med hög sockerhalt och hög fetthalt. Efter 6 veckor gavs de en intraperitoneal engångsinjektion av 30 mg/kg STZ (0,1 mmol/L STZ löst i pH 4,5 natriumcitratbuffert), och 72 timmar senare togs blod från svansvenen för att upptäcka fasteblodsocker (FBG). Om FBG är större än eller lika med 16,7 mmol/L, etablerades diabetesmodellen framgångsrikt [15]; fortsätt De matades med foder med hög sockerhalt och hög fetthalt i 2 veckor. DKD-modellering fastställdes vara framgångsrik baserat på uringlukospositivitet och 24-timmars totalt urinprotein (24-UTP) större än eller lika med 20 mg. Bland dem dog 3 under modelleringsprocessen och 7 misslyckades. , totalt 50 var framgångsrika. Råttorna som framgångsrikt modellerades delades slumpmässigt in i grupperna modellgruppen, dapagliflozingruppen (1 mg/kg) och CPhGs hög-, medel- och lågdos (500, 250, 125 mg/kg). Varje administreringsgrupp administrerades intragastriskt. Råttorna i normalgruppen och modellgruppen gavs motsvarande läkemedel, och råttorna i normalgruppen och modellgruppen fick samma mängd normal koksaltlösning genom sondmatning, en gång om dagen under totalt 6 veckor. Under administreringsperioden fortsatte råttor i varje grupp förutom den normala gruppen att få foder med hög fetthalt.

2.3.2 Biokemisk indikatordetektion

Efter 6 veckors CPhG-intervention samlades 24-timmars urin från råttorna och 24-timmars totalt urinprotein (24-UTP) mättes; blod samlades in från den fastande svansvenen för att detektera FBG-nivåer; blod uppsamlades från abdominalaortan, 4 grader, 1500 r/min. Centrifugera i 10 minuter för att separera serumet och detektera serumureakväve.

BUN), urinsyra (UA), totalkolesterol (TC), triglycerid (TG), högdensitetslipoprotein (HDL), lågdensitetslipoprotein (lågdensitetslipoprotein LDL).

2.3.3 Observation av patologisk morfologi hos njurvävnad

Råttorna bedövades med natriumpentobarbital och avlivades. Njurarna skalades av, vägdes, fixerades med 4 % paraformaldehyd, dehydrerades, genomskinliga, doppades i vax, inbäddades och sektionerades för hematoxylin-eosin (HE)-färgning.

Efter Masson-färgning observerades vävnadsmorfologin under ett mikroskop och programvaran Image-Pro Plus 6.0 användes för att analysera den integrerade optiska densiteten och kvantifiera den relativa kollagenfiberarean.

2. 3. 4 ELISA

Metoden användes för att detektera nivåerna av seruminflammatoriska faktorer hos råttor. Nivåerna av IL-6, IL-1 och TNF- detekterades enligt instruktionerna i kitet.

2. 3. 5 Western blot-metod för att detektera relaterat proteinuttryck

Råttnjurvävnad togs, RIPA-lysat tillsattes för att extrahera det totala proteinet och koncentrationen bestämdes med BCA-metoden.

Efter natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores, överför till PVDF-membran och efter blockering, JAK2 (1: 2000), p-JAK2 (1: 1000), STAT3 (1: 2000), p -STAT3 (1:2000), SOCS3 (1:2000), -aktin (1:2000) antikroppar, inkubera vid 4 grader över natten, tillsätt HRP-märkt IgG sekundär antikropp (1:5000) och inkubera vid rumstemperatur i 1 timme, utvecklad med elektroluminescenssats, exponerad med proteingel-imager, med hjälp av programvaran Image J

Kvantitativ analys av bitar. Genom att använda -actin som intern referens är förhållandet mellan målbandets gråvärde och det interna referensbandet det relativa proteinuttrycket.

2.4 Statistisk analys

Data bearbetades av SPSS 25.0 mjukvara och data uttrycktes som (x±s). Envägsvariansanalys användes för jämförelse mellan grupper. P<0.05 indicates that the difference is statistically significant.