BCG-inducerad tränad immunitet förbättrar acellulära pertussisvaccinationssvar i en Explorativ randomiserad klinisk studie

INTRODUKTION

Pertussis är en mycket överförbar akut luftvägssjukdom som orsakas av bakterien Bordetella pertussis och har återuppstått som ett allvarligt folkhälsoproblem trots hög vaccintäckning1. I åratal kontrollerades sjukdomen i industriländer genom vaccination med helcellskikhostavacciner (wPs) som implementerades på 1940-talet-1950. Dessa vacciner var mycket effektiva och inducerade långtidsskydd.

Emellertid ledde hög reaktogenicitet och säkerhetsproblem till att de ersattes under 1990-2000-talet med acellulära kikhostevacciner (aPs). aP-boostervacciner, inklusive kombinationsvacciner som innehåller stelkramp och difteritoxoid (Tdap) antingen med eller utan inaktiverat poliovirus (IPV) (Tdap-IPV), introducerades kort därefter. aP-vacciner används nu i stor utsträckning för att öka immuniteten hos förskolebarn, ungdomar och vuxna. Trots dessa åtgärder och deras förbättrade säkerhetsprofil har flera studier visat att inducerad immunitet förblir suboptimal2 och avtar med tiden3. Dessutom förkortas skyddets varaktighet efter upprepade aP-doser gradvis4–6. Det växande behovet av nya och förbättrade vaccinationsstrategier har lett till utforskning av nya adjuvans som riktar sig mot medfödd immunitet och förbättrar specifik immunitet mot aPs7–9.

Kombinationsvaccin kan stärka immuniteten. Kombinationsvaccin är en kombination av flera olika sjukdomsförebyggande vacciner som ger flera skydd åt patienter samtidigt, vilket minskar stressen och smärtan av att få flera injektioner. Samtidigt kan kombinationsvaccinet också förbättra immuniteten hos de vaccinerade, eftersom det kan stimulera fler immunsvar och producera fler antikroppar och immunceller, vilket effektivt förbättrar förmågan att förebygga många olika sjukdomar. Att förbättra immuniteten är mycket viktigt i vårt dagliga liv. Cistanche kan förbättra immuniteten. Polysackariderna i kött kan reglera immunsvaret hos det mänskliga immunsystemet, förbättra stressförmågan hos immunceller och förbättra effekten av sterilisering av immunceller.

Klicka för att lära dig vad cistanche är

Vaccinet Bacille Calmette-Guérin (BCG) skyddar mot mykobakteriella infektioner som tuberkulos10, samt skydd mot sekundära infektioner med orelaterade patogener i musmodeller1. Hos människor har dessa ospecifika fördelaktiga effekter kopplats till minskad spädbarnsdödlighet11,12 och har validerats i randomiserade kliniska prövningar10,13. BCG inducerar långsiktiga förändringar i medfödda immunceller som förbättrar deras känslighet för stimulering med icke-relaterade patogener. Denna process som kallas tränad immunitet, involverar epigenetisk omprogrammering av monocyter och kvarstår i upp till ett år efter BCG-vaccination14. Den kliniska relevansen av tränad immunitet har påvisats hos människor genom studier som använder BCG som prototyp för induktion av tränad immunitet och vaccination eller experimentell mänsklig infektion som sekundär immunstörning15–17. Det finns ackumulerande bevis för att BCG-vaccination modulerar adaptiva immunsvar mot vacciner. Bland åtta studier som utvärderades i en nyligen genomförd granskning visade fem förbättrade vaccinspecifika humorala svar18.

Ansträngningar att avgränsa de interagerande effekterna av BCG- och pertussisvacciner tyder på att BCG-inducerad tränad immunitet kan ha en positiv effekt på immunsvaret mot pertussis. Hos möss förbättrade tidigare vaccination med BCG Th1 och humorala immunsvar efter aP, men inte wP-vaccination19. Hos människor visade en studie i befolkningsskala att samtidig administrering av BCG och kikhostevaccination minskade dödligheten hos spädbarn20 jämfört med att få vaccinerna sekventiellt. Så vitt vi vet har ingen studie hittills undersökt i en randomiserad kontrollerad studie huruvida tränad immunitet modulerar immunsvar mot kikhostevacciner eller har jämfört tidpunkten för administrering av BCG-vaccination med en andra vaccination eller utmaning.

Här testade vi om BCG-vaccination påverkar det adaptiva immunsvaret på en vaccination, och om tränad immunitet är associerad med dessa svar. Vi visar att BCG-inducerad tränad immunitet förbättrar aP-specifik antikropp, aP-specifika Th1-cellsvar och totala minnes-B-cellsvar 2 veckor efter Tdap-IPV-immunisering. Dessa ökningar var positivt korrelerade med ökade tränade immunitetsbiomarkörer, inklusive IL-1 och IL-6. Våra resultat framhäver en roll för tränad immunitet inducerad av BCG-vaccination för att förstärka immuniteten mot pertussisvacciner.

RESULTAT

Studera design

Seventy-five healthy female volunteers were randomized to one of three cohorts to receive BCG and Tdap-IPV vaccines in different orders21. We chose to enroll only women since gender-specific effects of pertussis vaccines have been reported 22. The median age of the volunteers was 23, with no significant difference in age between cohorts (Kruskal–Wallis test; P = 0.6), as previously reported21. Two subjects were excluded from analysis for having a high anti-pertussis toxin IgG concentration before Tdap-IPV vaccination (>100 IE/ml), vilket tyder på nyligen genomförd infektion med pertussis23,24 (Fig. 1a).

För att identifiera förändringar i TdapIPV-vaccinsvaret som är associerade med tränad immunitet fick den "BCG-tränade" kohorten BCG 3 månader före TdapIPV. Vi inkluderade också två kontrollkohorter för att ta hänsyn till tidpunkten för BCG-vaccinationen. "BCG plus Tdap"-kohorten fick båda vaccinationerna i motsatta extremiteter samtidigt, och "Tdap-IPV"-kohorten fick Tdap-IPV först och BCG 3 månader senare (Fig. 1b). Blod samlades in vid flera tidpunkter före och efter vaccinationerna. Tidsstämplar definieras i förhållande till baslinjen för Tdap-IPV-vaccination (-M3=3 månader före, -M3 plus W2 = 3 månader före plus 2 veckor, D0=baslinje för Tdap-IPV eller samtidiga BCG- och Tdap-IPV-vaccinationer, W2=2 veckor därefter, M3 plus W2=3 månader plus 2 veckor därefter, Y1=1 år därefter). Primära utfall specificerades som ökningar av adaptiva immunsvar 2 veckor eller 1 år efter Tdap-IPV-vaccination.

Totalt bedömde vi 31 immunologiska resultat i tre vaccinationskohorter. Vi använde en pärlbaserad multipleximmunanalys för att mäta antikroppskoncentrationer av IgG mot pertussis-antigener pertussis toxin (PT), filamentöst hemagglutinin (FHA), pertactin (PRN), såväl som difteritoxoid (DIPH) och stelkrampstoxin (TET)25. Totalt antal B-cells- och PRN-specifika B-celler mättes direkt i helblod genom flödescytometri med användning av fluorescensmärkt PRN (kompletterande fig. 1). Th1- och Th17 T-cellssvar mot pertussis-antigener mättes genom att stimulera perifera mononukleära blodceller (PBMC) med antingen PRN, PT eller FHA under 7 dagar och mäta utsöndrad IFN , IL22 och IL -17 med ELISA26.

BCG-vaccination förstärker immuncellscytokinsvar på orelaterade stimuli, ett fenomen som har förklarats av två olika biologiska mekanismer. Den första processen kallas heterolog immunitet och beror på den ospecifika aktiveringen av T-celler27,28. Den andra processen som kallas tränad immunitet, resulterar i ökad proinflammatorisk cytokinproduktion av medfödda immunceller14. Vi definierade sekundära resultat för den BCG-tränade kohorten som förändringar i cytokinproduktionen av PBMC efter stimulering med värmedödade Candida albicans (C_alb), Staphylococcus aureus (S_aur), Bordetella pertussis (Bp) eller lipopolysackarid (LPS). Liksom i tidigare studier16,21 kvantifierade vi Th1/17-cytokinerna IFN , IL-22 eller IL-17 efter 7 dagar som en avläsning för heterolog immunitet, eller monocyt-härledda cytokiner IL-10 , IL-6, IL-1 eller TNF efter 24 timmar som en avläsning för tränad immunitet (Fig. 1b). Cytokinproduktion som svar på sonikerad Mycobacterium tuberculosis (Mtb) mättes för att kvantifiera antimykobakteriell immunitet.

Tidigare BCG-vaccination förbättrar Tdap-IPV-inducerade adaptiva immunsvar

För att kvantifiera effekterna av tränad immunitet på Tdap-IPV-vaccination, för varje primär endpoint, konstruerade vi en linjär blandad effektmodell med provtid, kohortmedlemskap, såväl som interaktionen mellan tid och kohort som kovariater. Vi undersökte två kontraster: (i) skillnader jämfört med baslinje (D0) inom varje kohort (effekter efter vaccination, tilläggstabell 1), och (ii) skillnader mellan kohorter i storleken av dessa förändringar (differentiell effekter, tilläggstabell 2). Alla kohorter uppvisade signifikanta ökningar i antikroppssvar mot de fem antigenerna efter Tdap-IPV-immunisering. Antikroppskoncentrationerna förblev högre än baslinjen upp till ett år efter vaccination (Y1), förutom TET, som hade avtagit i BCG-tränade och BCG plus Tdap-kohorter (tilläggsbild 2a).

Alla kohorter hade signifikant ökat antal cirkulerande PRN plus B-celler 2 veckor efter immunisering, vilka huvudsakligen var minnes-B-celler (MBC) (kompletterande fig. 3a). Vi observerade inga skillnader mellan kohorter (kompletterande tabell 2 och kompletterande figur 3b). Jämfört med Tdap-IPV-kohorten visade den BCG-tränade kohorten förbättrade baslinjenormaliserade log1{{10}}-faldiga förändringar (W2/D0) för IgG-svar för PT, FHA och PRN. Ett liknande mönster observerades när man jämförde dessa svar med BCG plus Tdap-kohorten (Fig. 2a). Vi observerade också förhöjda pertussis-specifika IgG-koncentrationer i den BCG-tränade kohorten 2 veckor efter vaccination (kompletterande fig. 2b), även om skillnaden i de absoluta värdena var mindre uttalad än skillnaden i ökningarna som är i förhållande till baslinjen kl. D0.

Vidare uppvisade försökspersoner i den BCG-tränade kohorten signifikant ökade totala MBC-svar, inklusive IgG-klassomkopplade MBC (Fig. 2b och Kompletterande Fig. 4). Försökspersoner i den BCG-tränade kohorten uppvisade också förhöjd IFN-sekretion som svar på stimulering med alla tre pertussis-antigener. Omvänt observerades signifikanta ökningar för ett enda kikhosteantigen i Tdap-IPV-kohorten (PT) och två kikhosteantigener i BCG plus Tdap-kohorten (PT och FHA, fig. 2c och kompletterande fig. 5). Vi observerade också en trend där ökningar i IFNg-produktion var högre i den BCG-tränade kohorten än i de andra kohorterna, även om detta inte nådde statistisk signifikans (kompletterande tabell 2 och kompletterande figur 5b). Pertussis-specifika IL-22- och IL-17-svar var svaga för alla kohorter (kompletterande tabell 1). Sammantaget pekar dessa fynd på förbättrade pertussis-specifika antikroppssvar, förbättrade totala IgG-omkopplade MBC-svar och bredare pertussis-specifika IFN-svar i den BCG-tränade kohorten jämfört med de andra två kohorterna.

Vi undersökte sambanden mellan ökningarna av primära resultat som förbättrades i den BCG-tränade kohorten. För denna utforskande analys beräknades korrelationer mellan antikroppar, B-celler och cytokiner för varje kohort. Den BCG-tränade kohorten visade många signifikanta och kvantitativt starkare positiva korrelationer mellan dessa svar, medan Tdap-IPV- och BCG plus Tdap-kohorterna visade svagare eller omvända korrelationer, med det starkaste mönstret som motsvarar förändringar i IFN-svar (Fig. 3a). Korrelationskoefficienter mellan svaren hos de BCG-tränade var signifikant högre än de i kontrollkohorterna, vilket sammantaget pekar mot induktionen av ett mer mycket koordinerat pertussis-specifikt adaptivt immunsvar i den BCG-tränade kohorten (Fig. 3b).

IL-1 och IL-6 cytokinproduktion är associerad med pertussisspecifika adaptiva immunsvar

Den BCG-tränade kohorten visade förbättrade totala IgG-omkopplade MBC och pertussis-specifika IFN-svar. Jämfört med Tdap-IPV- och BCG plus Tdap-kohorterna, visade den BCG-tränade kohorten också högre kikhostaantikroppssvar. Eftersom BCG-vaccination hos människor kan öka cytokinproduktionen av cirkulerande immunceller som svar på heterolog stimulering, veckor till månader efter vaccination27, utvärderade vi om dessa BCG-inducerade cytokinsvar var associerade med förändringar i pertussis-specifika immunsvar efter Tdap-IPV-vaccination. Två veckor och 3 månader efter BCG-vaccination fanns det ett signifikant förstärkt antimykobakteriellt svar som kännetecknades av ökad IL-22- och IFN-produktion jämfört med BCG-vaccinationens baslinje (kompletterande figur 6a, b).

Sammantaget visade den BCG-tränade kohorten inte ökad produktion av heterolog immunitet eller tränade immunitetsassocierade cytokiner, som tidigare observerats (kompletterande figurer 6 och 8)21. Men eftersom induktionen av cytokinproduktion varierade mellan individer, beräknade vi förändringar mellan 2 veckor efter BCG och 3 månader efter BCG jämfört med BCG-baslinje (kompletterande figurer 7 och 9). Pearson-korrelationer beräknades för att bestämma styrkan av sambandet mellan dessa mätningar vid varje tidpunkt. Tre månader efter BCG-vaccination, dvs. vid Tdap-IPV-baslinjen, var cytokinsvar på in vitro-stimulering starkt korrelerade. Heterologa immunitetsassocierade cytokinsvar var negativt korrelerade med tränade immunitetsassocierade cytokinsvar, och bland dessa var korrelationerna mellan IL-6 och IL-1 starkast (Fig. 4), som tidigare beskrivits16. Korrelationsmönster 2 veckor efter BCG-vaccination var liknande för heterologa immunitetsassocierade cytokiner men korrelationerna mellan tränade immunitetsassocierade cytokiner var mycket svagare, förutom IL-10-svar. Sammantaget pekar dessa resultat på koordinerad medfödd immunaktivering 3 månader, men inte 2 veckor efter BCG-immunisering i den BCG-tränade kohorten.

Därefter undersökte vi om variationer i cytokinsvaren hos den BCG-tränade kohorten var associerade med förändringar i TdapIPV-adaptiva immunslutpunkter. Vi undersökte förändringar i cytokinproduktion 2 veckor och 3 månader efter BCG-vaccination. Vi fann att ökningar av heterologa immunitetsassocierade cytokiner tenderade att vara svagt och negativt korrelerade med de primära ändpunkterna både 2 veckor (kompletterande fig. 10) och 3 månader efter BCG-vaccination (fig. 5a). Däremot var ökningar av tränade immunitetsassocierade cytokiner 3 månader efter BCG-vaccination, särskilt IL-1 /IL-6 som svar på LPS-stimulering, signifikant positivt korrelerade med PRN- och FHA-antikroppssvar, IFN-produktion i svar på PT-stimulering och totala IgG-omkopplade MBC-svar (Fig. 5b, c).

I linje med detta observerade vi inte förändringar i den relativa förekomsten av perifert blodcellsantal (kompletterande figur 11a), och inte heller var förändringar i cellulär förekomst 3 månader efter BCG-vaccination positivt korrelerade med pertussis-ändpunkter (kompletterande figur 11b). Ökning av IL-1-produktion som svar på LPS-stimulering (IL1b. LPS) 3 månader efter BCG-vaccination visade ett starkt samband med flera Tdap-IPV-svar och valdes ut för att bestämma hur mycket av variationen av varje svar de kunde förklara . Den totala variansen som förklaras (förutspådd Rsq) för varje utfall beräknades och förändringar i IL-1 kunde förklara upp till 60 procent av svarsvariationen (Fig. 5d). Sammantaget visar dessa resultat att tränade immunitetsassocierade cytokinsvar 3 månader efter BCG-vaccination är korrelerade med ökningar av pertussis-specifika antikroppssvar och IFN-produktion, såväl som totala IgG-omkopplade MBC-svar.

DISKUSSION

Induktion av tränad immunitet hos människor inträffar veckor till månader efter BCG-vaccination14 och kan påverka svaret på efterföljande immunisering hos människor16,17. Här visar vi att tränad immunitet som induceras av BCG-vaccination 3 månader före, men inte samtidigt med, en boosterdos av Tdap-IPV, förstärker pertussis IgG-svar och modulerar pertussis-specifika cellulära svar. Flera studier har undersökt de interagerande effekterna av BCG och andra vacciner, där de flesta av dessa studier rapporterar en positiv effekt av BCG på immunsvaret mot pertussis20,21,29,30. Men så vitt vi vet har ingen studie hittills undersökt tidpunkten för BCG-vaccination på svaret på kikhosta eller studerat vilka egenskaper hos det BCG-inducerade tränade immunitetssvaret som är korrelerade med förbättrad vaccinrespons.

Försökspersoner i alla tre kohorter uppvisade anti-pertussis humoral och PRN plus B-cellssvar 2 veckor efter vaccination med TdapIPV. Även om PRN-antikroppssvar var mycket högre i den BCG-tränade kohorten, observerade vi inte ett liknande mönster i PRN-specifika B-cellssvar. Detta kan förklaras av en snabbare induktion av antikroppar i den BCG-tränade kohorten, som ackumuleras över tiden på grund av deras långa halveringstid.

Men eftersom antikroppskoncentrationer inte mättes före 2 veckor efter vaccination, var det inte möjligt att uppskatta skillnader i kinetiken mellan kohorter. Vid sidan av ökade PRN-antikroppssvar fann vi också att FHA- och PT-antikroppssvar var högre i den BCG-tränade kohorten. Vi kunde tyvärr inte mäta PT- och FHA-specifika B-cellsvar på grund av den höga ospecifika bindningen av FHA och PT till B-celler. Ändå är det lovande att totala IgG MBC-svar ökade i den BCG-tränade kohorten och att dessa ökningar var korrelerade med ökningar av antikroppssvar. Vi fann också att IFN-svar som svar på omstimulering av pertussis-antigen förbättrades i den BCG-tränade kohorten. Även om dessa förändringar var relativt små, observerade vi en trend där W2–D0 förändringar var högre än i de andra kohorterna. Ytterligare studier med fler försökspersoner kan hjälpa till att validera detta mönster, vilket har bekräftats i en musstudie19. På liknande sätt har neonatal BCG-vaccination också visat sig potentiera Th1-svar på stelkrampstoxoid31.

Ökningar av pertussis-antikroppar, totala IgG MBC-svar och pertussis IFNg-svar var starkt korrelerade med varandra i den BCG-tränade kohorten, vilket tyder på den samordnade aktiveringen av effektor- och minnesfunktioner. Dessutom var ökningar av pertussis-antikroppar, totala IgG-omkopplade MBC-svar och IFN som svar på PT-återstimulering i den BCG-tränade kohorten associerade med medfödda svar, särskilt IL-1 och IL-6. Dessa resultat är i linje med en tidigare studie på människa från vår grupp där vi studerade effekten av BCG på influensavaccination17. Vikten av IL-1 /IL-6-vägen som en biomarkör för tränad immunitet har också belysts i en modell av experimentell virusinfektion efter vaccination mot gula febern16. Sammantaget observerade vi inte korrelationer mellan särskilda mikrobiella stimuli och de primära resultaten, vilket tyder på att övergripande förändringar i cytokinsvarsvägar och inte något särskilt stimuleringstillstånd är kopplade till förbättrad lyhördhet för kikhostevaccination. Även om vi förväntar oss att det dominerande IL-6- och IL-1-svaret på mikrobiell stimulering kommer från monocyter och dendritiska celler16, kan B-celler också bidra till cytokinproduktion32 och vi kan inte utesluta deras potentiella bidrag.
En nyckelfråga har varit hur länge BCG-inducerad tränad immunitet kvarstår efter vaccination. In vitro har signaturer av BCG-inducerad tränad immunitet hos människor identifierats så tidigt som 2 veckor och upp till 1-år efter vaccination14. Kliniska studier på människor som har syftat till att översätta dessa fynd till in vivo-respons har begränsat observationsfönstret till upp till 5 veckor efter BCG-vaccination15–17. Vi observerade en svagare induktion av de tränade immunitetsassocierade cytokinerna IL-6 och IL-1 än i tidigare studier16, vilket tidigare rapporterats21. Batch-till-batch-variationer i produktionen av BCG-vaccinet kan påverka induktionen av tränad immunitet och kan förklara effekten som vi observerade i denna studie 33.

Dessutom har variationer mellan BCG-stammar också observerats som påverkar deras immunogenicitet och kliniska effekt34–36. Trots detta visar vi ändå att heterologa IL-1- och IL-6-svar 3 månader efter BCG-vaccination, dvs. vid tidpunkten för Tdap-IPV-vaccination, men inte 2 veckor efter BCG-vaccination är associerad med förstärkt pertussis humoral och cellulär immunitet. Dessa fynd tyder på att tränad immunitet fortsätter att utvecklas de senaste 2 veckorna efter BCG-vaccination, och betonar att baslinjens funktionella "responsivitet" hos cirkulerande medfödda immunceller kan vara avgörande för utvecklingen av ett mer potent vaccinsvar.

Denna studie visar att tidigare BCG-vaccination kan förbättra känsligheten för aP-vaccinantigener. Överraskande nog observerade vi inte denna effekt för TET och DIPH. Detta kan förklaras av det faktum att alla vuxna hade fått en tidigare boostervaccination med Td-IPV men inte med AP vid 9 års ålder, som rekommenderats i det nationella immuniseringsprogrammet. I linje med detta fann vi att baslinjeantikroppskoncentrationerna av aP-antigener var starkt korrelerade mellan försökspersonerna i vår studie, men var inte korrelerade med DIPH och TET, vilket tyder på att humoral immunitet mot dessa komponenter inte är synkroniserad med aP-antigenerna (Supplementary). Fig. 12). Baslinjenivåerna av DIPH och TET-antikroppar var starkt interkorrelerade, vilket överensstämmer med deras samtidiga administrering i vacciner. Således kan variationer i redan existerande immunitet mot olika vaccinkomponenter spela en roll i förmågan hos BCG-vaccination och tränad immunitet att påverka svaret på en Tdap-IPV.

Although our study was not designed to investigate vaccine efficacy, a major question is whether the enhanced antibody response that we observed in the BCG-trained cohort may translate into better clinical protection. There is much debate about the correlates of protection against pertussis37. Nonetheless, PT antibodies have previously been used to correlate with clinical protection against disease (>25 IU/ml)29. Genom att använda denna tröskel uppnåddes nästan fullständigt seroprotektion 2 veckor efter TdapIPV i de BCG-tränade och BCG plus Tdap-kohorterna, medan en bråkdel av försökspersonerna i Tdap-IPV-kohorten inte var seroskyddade (tilläggsbild 13).

Förutom antikroppar har T-cellsimmunitet och i synnerhet Th1- och Th17-svar också framhållits som viktiga för skydd mot pertussis i djurmodeller2,38. Vi fann att den BCG-tränade kohorten visade förstärkt IFN som svar på omstimulering av pertussis-antigen, vilket är en avläsning för Th1-immunitet och kan därför föreslå förbättrat kliniskt skydd mot pertussis. Slutligen har nuvarande immunologiska effektmått som syftar till att kvantifiera pertussis-specifik adaptiv immunitet, såsom T-cell, B-cell eller humorala svar, ännu inte validerats som immunologiska skyddskorrelat. Det finns flera möjligheter att täppa till denna kunskapslucka, till exempel genom att genomföra epidemiologiska studier eller genom att använda den nyligen etablerade kontrollerade humana infektionsmodellen för B. pertussis39.

En begränsning av vår explorativa studie är att studiepopulationen bestod av vuxna som primades i spädbarnsåldern med helcells-DTP-vaccinet, vilket är känt för att påverka det adaptiva svaret på kikhosta årtionden efter priming och påverkar induktionen av T-cellsimmunitet i svar på en boostervaccination40. Därför kommer det att vara viktigt att avgöra om våra resultat översätts till barn födda i en tid präglad av rutinmässig pediatrisk aP-vaccination. Dessutom, eftersom vi endast inkluderade kvinnor, kommer det att vara viktigt att avgöra om skillnader finns med män. I denna explorativa studie mätte vi anti-pertussis immunogenicitetsändpunkter inklusive antikroppssvar, totala och PRN plus B-cellssvar och antigenspecifika T-cellssvar. P-värden korrigerades inte för flera tester på grund av den målinriktade naturen hos de utvärderade immunsvaren. Viktigt är att denna studie utfördes på frivilliga av västeuropeisk (nederländsk) härkomst, och framtida studier bör undersöka om liknande effekter kan hittas i populationer med olika genetisk bakgrund. En annan begränsning är att endast en delmängd av cytokiner mättes. Även om detta var lämpligt för de specifika hypoteser vi försökte testa, kan en mer omfattande, opartisk profilering av cytokiner och andra svar ge nya insikter.

Sammanfattningsvis, i denna studie rapporterar vi att BCG-vaccination administrerad 3 månader före Tdap-IPV-vaccination avsevärt förbättrar anti-kikhosta-immuniteten och att biomarkörer för tränad immunitet är de mest tillförlitliga korrelaten för dessa förbättrade vaccinationssvar. Ytterligare valideringsstudier kommer att vara nödvändiga för att utvärdera dessa fynd över olika studiepopulationer, och ytterligare immunologiska och genetiska studier behövs för att mekanistiskt validera rollen för IL-1- och IL-6-vägarna. Sammantaget kommer avgränsningen av baslinjens medfödda immunfunktion, som kan moduleras av BCG, vara avgörande för att förstå hur man vägleder vaccininducerade adaptiva immunsvar mot överlägsen immunogenicitet och skydd mot sjukdomar.

METODER

Klinisk prövning

Denna randomiserade öppna studie med ett enda center utfördes vid Radboud University Medical Center (Nijmegen, Nederländerna) från 2015 mars till 2 juli01621. Studieprotokollet registreras vid kliniska prövningar. gov (NCT02771782) och godkändes av Arnhem-Nijmegens medicinska etiska kommitté. Volontärer rekryterades med hjälp av anslagstavlor och vid Radboud University i Nijmegen och fick måttlig ersättning. Frivilliga som inte tidigare vaccinerats med BCG eller nyligen med kikhostevaccin inkluderades. Uteslutningskriterier var (i) tidigare BCG-vaccination eller nyligen vaccinerad med vacciner som innehåller kikhosta, (ii) allergi mot neomycin, polymyxin eller allergisk reaktion mot tidigare vaccination med difteri, stelkramp, kikhosta eller poliovaccin, (iii) användning av systemiska vacciner. andra läkemedel än p-piller, och (iv) graviditet eller historia av sjukdomar till följd av immunbrist. Kohortens storlek bestämdes baserat på tidigare studier utförda av vår grupp där vi undersökte effekterna av BCG-vaccination på medfödda immunsvar16. Randomisering över studiearmarna utfördes med en mjukvarubaserad algoritm. Alla försökspersoner hade en historia av priming med helcellskikhosta under det första levnadsåret. Sjuttiofem kvinnliga volontärer inkluderades. Efter att skriftligt informerat samtycke erhållits samlades blod i etylendiamintetraättiksyra (EDTA) eller litiumheparin (LiHep) rör och vaccinationer administrerades. Fullständiga blodvärden erhölls med en Sysmex XN-450 hematologianalysator. Försökspersonerna fick BCG Danish 1331 (Staten Serum Institut, Köpenhamn, Danmark; 0,1 ml intradermalt) och Tdap-IPV (Boostrix Polio, GlaxoSmithKline; 0,5 ml intramuskulärt). Sera lagrades vid -20 grader fram till analys, och helblod bearbetades för ytterligare analys enligt beskrivningen nedan. Riktlinjerna för Consolidated Standards of Reporting Trials (CONSORT) användes för att förbereda detta manuskript (tilläggsbild 14).

Serologisk analys

Sera analyserades med avseende på PT-, FHA-, PRN-, TET- och DIPH-specifika IgG-antikroppskoncentrationer med användning av en fluorescerande pärla-baserad multipleximmunanalys25. Antigener kopplades kovalent till distinkta färgkodade aktiverade karboxylerade MicroPlex Microspheres (pärlor) (Luminex, Austin, Texas, USA). Följande antigener användes för koppling: högt renad PT (Netherlands Vaccine Institute), FHA (Kaketsuken, Kumamoto, Japan), P.69 PRN uttryckt och renat från en E. coli-konstruktion41, difteritoxoid (Netherlands Vaccine Institute) och stelkramp toxin (T3194, Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA). Efter ett tvättsteg i PBS aktiverades 12,5 × 106 karboxylerade pärlor/ml i PBS innehållande 2,5 mg 1-etyl3-({{20}} dimetylaminopropyl)-karbodiimidhydroklorid (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) och 2,5 mg N-hydroxisulfosuccinimid (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA). Antigenerna för koppling späddes i PBS till en koncentration av 10 ug PT, FHA eller PRN, 100 ug DT eller 25 ug TET per 12,5 × 106 aktiverade pärlor och inkuberades i 2 timmar vid rumstemperatur i mörker under konstant rotation. Efter tre tvättsteg förvarades de antigenkopplade pärlorna i mörker i PBS innehållande 0,03 % (vikt/volym) natriumazid och 1 % (vikt/volym) bovint serumalbumin vid 4 grader fram till användning. Serum utspädda 1/200 och 1/4000 i PBS innehållande 0,1 procent (vol/vol) Tween 20 och 3 procent (vikt/volym) BSA inkuberades med antigenkopplade pärlor i en 96-brunnsfilterplatta i 45 minuter vid rumstemperatur vid 750 pm i mörker. Referenssera i en utspädningsserie, kvalitetskontrollsera och ämnen inkluderades på varje platta.

Den interna referensstandarden för pertussis kalibrerades mot WHO 1st IS Part 06/140 och serieutspäddes 4-faldigt över 6 brunnar (1/200 till 1/204800). Den interna referensstandarden för DIPH och TET kalibrerades mot WHO NIBSC DI-3 och TE-3 och serieutspäddes 4-faldigt över 8 brunnar (1/50 till 1/819200). Efter inkubation tvättades brunnarna 3 gånger med PBS, inkuberades med R-fykoerytrin-märkt get-anti-human IgG-antikropp (Jackson Immunoresearch Laboratories, West-Grove, PA, USA) under 30 minuter och tvättades. Pärlor inkluderades i PBS och medianfluorescensintensitet (MFI) förvärvades på en Bio-Plex LX200. MFI konverterades till IU/ml genom interpolation från en 5-parameterlogistisk standardkurva med hjälp av programvaran Bioplex Manager 6.2 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Kalifornien, USA) och exporterades till Microsoft Excel.

PBMC-isolering, stimulering och cytokindetektion

PBMCs isolerades genom Ficoll-densitetsgradientcentrifugering och återsuspenderades vid 5 × 106 /ml i RPMI-odlingsmedium (Roswell Park Memorial Institute-medium; Invitrogen, CA, USA) kompletterat med gentamycin, Glutamax (GIBCO) och pyruvat. Totalt alikvoterades 100 ul per brunn i rundbottnade 96-brunnsplattor (Corning) och stimulerades med en av RPMI (negativ kontroll), Escherichia coli lipopolysackarid (LPS; 10 ng/ml, Sigma-Aldrich), sonikerad Mycobacterium tuberculosis H37Rv (5 ug/ml), värmedödade Staphylococcus aureus (1 × 106 /ml, kliniskt isolat), värmedödade Candida albicans (1 × 106 /ml, UC820-stam) och värmedödade Bordetella pertussis ( 1 ug/ml, B1917-stam), PT (2 ug/ml), PRN (4 ug/ml, ReagentProteins, PFE-031) och FHA (2 ug/ml). PT och FHA tillhandahölls vänligt av AM Buisman vid National Institute for Public Health and Environment (RIVM, Bilthoven, Nederländerna). Celler inkuberades vid 37 grader och 5 procent CO2 i 24 timmar för detektering av IL-1, IL-6, IL-10 och TNF eller 7 dagar för IFN, IL{{31} } och IL-17. Supernatanter lagrades vid -20 grader. Cytokiner mättes i PBMC-kultursupernatanter med användning av enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) kit från FoU-system (IL-1, TNF, IL17, IL-22) eller Sanquin (IL-6, IL -10, IFN ) enligt tillverkarens instruktioner.

B-cellsflödescytometri

B-cellsfärgning utfördes direkt på helblod med en antikroppsfärgningspanel (kompletterande tabell 3) inklusive fluorescensmärkt PRN för detektion av antigenspecifika B-celler. För att märka PRN-specifika B-celler konjugerades PRN (ReagentProteins, PFE-031) till fluorescein (FITC Antibody labeling kit, Pierce) enligt tillverkarens protokoll (PRN-FITC). Totalt späddes 1–2 ml nytaget helblod uppsamlat i LiHep-rör i FACS-buffert (PBS plus 0.{{10}}9 procent NaN3 plus 0,2 procent bovint serumalbumin, Calbiochem) och celler pelleterades och tvättades sedan två gånger med FACS-buffert. Celler återsuspenderades i FACS-buffert och färgades sedan med B-cells fenotypande antikroppscocktail i 15 minuter, fixerades (FACSlysing, BD Biosciences) och analyserades efter ytterligare en tvätt med FACS-buffert inom 1 timme efter färgning. Flödescytometri av PRN-antigenspecifika B-celler i helblod utfördes på en LSRII (BD Biosciences) flödescytometer med standardiserade instrumentinställningar42. Flödescytometridata analyserades med Infinicyte (version 2.0, Cytognos). Per prov förvärvades 2 × 106 celler i lymfocytporten (kompletterande Fig. la). Lymfocyter gatades efter avlägsnande av dubbletter och skräp. B-celler identifierades som CD45 plus CD19 plus och PRN-FITC-specifika B-celler identifierades. B-cellsundergrupper identifierades med hjälp av en anpassad grindstrategi43. Vi försökte detektera PT-specifika B-celler genom flödescytometri, men vi misslyckades på grund av den höga bakgrunden orsakad av ospecifik färgning.

Statistik

Cytokin- och antikroppsvärden log10-omvandlades för att ta hänsyn till deras snedfördelning. Analys av primära eller sekundära resultatsvar analyserades i en regressionsmodell med blandade effekter med användning av "lme4" 44 R-paketet. För varje resultat är formeln för modellen (i R-notation):

Jämförelser beräknades med "medel" 45 R-paketet och vi undersökte två kontraster. Först undersökte vi om primära effektmått var signifikant olika jämfört med Tdap-IPV-vaccinationsbaslinjen inom varje kohort (effekter efter vaccination definierades som W2–D0 inom varje kohort, kompletterande tabell 1). Därefter undersökte vi skillnader mellan kohorter i storleken på dessa förändringar (differentiella effekter, tilläggstabell 2, definierad som (W2c1 – D{{10}}c1) – ​​(W2c2 – D0 c2) där c1 och c2 hänvisar till olika kohorter för en given jämförelse). Förändringar i heterologa eller tränade immunitetscytokiner i den BCG-tränade kohorten analyserades på liknande sätt. P-värdena rapporteras med Kenward-Rogers frihetsgradsmetoden. Statistiska parametrar redovisas direkt i figurerna och figurförklaringarna. På grund av den explorativa studiedesignen och de utvärderade riktade immunsvaren, utfördes ingen korrigering av flera tester. Parvisa korrelationer utfördes med log10-faldiga förändringsvärden över baslinjen. Uppskattningen av variansen som förklaras av cytokinmätningar på primära utfallsvariabler utfördes med R-paketet "caret" 46. För att ta hänsyn till potentiell överanpassning, 10 gånger upprepade, utfördes 4-faldig korsvalidering. Vi analyserade seroskyddande antikroppstitrar mot PT, TET eller DIPH med ett Fisher exakt test. Samband mellan seroskyddsstatus och kohort bestämdes genom att undersöka rester av ett chi-kvadrattest. Tröskelvärden för seroskydd mot PT var 25 IE/ml18 och 0,1 IE/ml för DIPH och TET37).

Rapporteringssammanfattning

Ytterligare information om forskningsdesign finns i Nature Research Reporting Summary länkad till denna artikel.

DATA TILLGÄNGLIGHET

Data som stöder resultaten av denna studie är tillgängliga från motsvarande författare på rimlig begäran.

KOD TILLGÄNGLIGHET

R-koden som stöder resultaten av denna studie är tillgänglig från motsvarande författare på rimlig begäran.

REFERENSER

1. Tan, T. et al. Pertussis över hela världen: senaste epidemiologiska trender från 2000 till 2013. Pediatr. Infektera. Dis. J. 34, e222–e232 (2015).

2. Warfel, JM, Zimmerman, LI & Merkel, TJ Acellulära pertussisvacciner skyddar mot sjukdomar men lyckas inte förhindra infektion och överföring i en icke-mänsklig primatmodell. Proc. Natl Acad. Sci. USA 111, 787–792 (2014).

3. Huang, LM et al. Svar på primär- och boosterdos av acellulära, komponent- och helcellskikhostavacciner initierade vid 2 månaders ålder. Vaccine 14, 916-922 (1996).

4. Klein, NP, Bartlett, J., Rowhani-Rahbar, A., Fireman, B. & Baxter, R. Avtagande skydd efter femte dosen av acellulärt pertussisvaccin hos barn. New Engl. J. Med. 367, 1012–1019 (2012).

5. Misegades, LK et al. Association of childhood pertussis med mottagande av 5 doser pertussisvaccin efter tid sedan senaste vaccindos, Kalifornien, 2010. JAMA 308, 2126–2132 (2012).

6. Hendrikx, LH, Berbers, GA, Veenhoven, RH, Sanders, EA & Buisman, AM IgG-svar efter boostervaccination med olika kikhostavacciner hos holländska barn 4 år: effekt av vaccinantigeninnehåll. Vaccin 27, 6530–6536 (2009).

7. Misiak, A. et al. Tillägget av en TLR7-agonist till ett acellulärt pertussisvaccin förstärker Th1- och Th17-svar och skyddande immunitet i en musmodell. Vaccin 35, 5256–5263 (2017).

8. Dunne, A. et al. En ny TLR2-agonist från Bordetella pertussis är ett potent adjuvans som främjar skyddande immunitet med ett acellulärt pertussisvaccin. Mucosal Immunol. 8, 607–617 (2015).

9. Sugai, T. et al. En CpG-innehållande oligodeoxinukleotid som ett effektivt adjuvans som motverkar Th1/Th2-immunsvaret i vaccinet mot difteri-stelkramp och pertussis. Vaccin 23, 5450–5456 (2005).

10. Colditz, GA et al. Effekten av BCG-vaccin för att förebygga tuberkulos. Metaanalys av publicerad litteratur. JAMA 271, 698-702 (1994).

11. Kristensen, I., Aaby, P. & Jensen, H. Rutinvaccinationer och barnöverlevnad: en uppföljningsstudie i Guinea-Bissau, Västafrika. BMJ 321, 1435–1438 (2000).

12. Hirve, S. et al. Icke-specifika och könsskillnade effekter av vaccinationer på barns överlevnad på landsbygden i västra Indien. Vaccin 30, 7300–7308 (2012).

13. Aaby, P. et al. Randomiserad studie av BCG-vaccination vid födseln till barn med låg födelsevikt: fördelaktiga ospecifika effekter under neonatalperioden? J. Infect. Dis. 204, 245–252 (2011).

14. Netea, MG et al. Tränad immunitet: ett program för medfött immunminne i hälsa och sjukdom. Science 352, aaf1098 (2016).

15. Walk, J. et al. Resultat av kontrollerad human malariainfektion efter BCG-vaccination. Nat. Commun. 10, 874 (2019).

16. Arts, RJW et al. BCG-vaccination skyddar mot experimentell virusinfektion hos människor genom induktion av cytokiner associerade med kornig immunitet. Cell Host Microbe 23, 89–100 e105 (2018).

17. Leentjens, J. et al. BCG-vaccination ökar immunogeniciteten av efterföljande influensavaccination hos friska frivilliga: en randomiserad, placebokontrollerad pilotstudie. J. Infect. Dis. 212, 1930–1938 (2015).

18. Zimmermann, P. & Curtis, N. Inverkan av BCG på vaccinsvar - en systematisk översikt. Expert Rev Vaccines 17, 547–554 (2018).

19. Broset, E. et al. BCG-vaccination förbättrar DTaP-immunsvar hos möss och är associerad med lägre pertussis-incidens i ekologiska epidemiologiska studier. EBioMedicine 65, 103254 (2021).

20. Aaby, P., Andersen, A., Ravn, H. & Zaman, K. Samtidig administrering av BCG- och difteri-stelkramp-kikhosta (DTP)-vaccinationer kan minska spädbarnsdödligheten mer än WHO-schemat för BCG först och sedan DTP. En omanalys av demografiska övervakningsdata från landsbygden i Bangladesh. EBioMedicine 22, 173–180 (2017).

21. Blok, BA et al. Interagerande, ospecifika, immunologiska effekter av bacillus calmette-guerin och stelkramp-difteri-pertussis-inaktiverade poliovaccinationer: en explorativ, randomiserad studie. Clin. Infektera. Dis. 70, 455–463 (2020).

22. Aaby, P., Ravn, H., Fisker, AB, Rodrigues, A. & Benn, CS Är difteri-stelkramp-pertussis (DTP) associerat med ökad kvinnlig dödlighet? En metaanalys som testar hypoteserna om könsskillnader ospecifika effekter av DTP-vaccin. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 110, 570–581 (2016).

23. van der Lee, S. et al. Förbättrad förvärvshastighet av Bordetella pertussis hos ungdomar under epidemin 2012 i Nederländerna och bevis för långvarig antikroppspersistens efter infektion. Euro Surveill. https://doi.org/10.2807/1560-7917. ES.2017.22.47.17-00011 (2017).

24. Berbers, G. et al. Cirkulation av pertussis och dåligt skydd mot difteri bland medelålders vuxna i 18 europeiska länder. Nat. Commun. 12, 2871 (2021). 25. van Gageldonk, PG, van Schaijk, FG, van der Klis, FR & Berbers, GA Utveckling och validering av en multipleximmunanalys för samtidig bestämning av serumantikroppar mot Bordetella pertussis, difteri och stelkramp. J. Immunol. Methods 335, 79–89 (2008).

26. Schure, RM et al. T-cellssvar före och efter den femte på varandra följande acellulära pertussisvaccinationen hos 4-åriga holländska barn. Clin. Vaccin Immunol. 19, 1879–1886 (2012).

27. Mathurin, KS, Martens, GW, Kornfeld, H. & Welsh, RM CD4 T-cellsförmedlad heterolog immunitet mellan mykobakterier och poxvirus. J. Virol. 83, 3528–3539 (2009).

28. Lertmemongkolchai, G., Cai, G., Hunter, CA & Bancroft, GJ Bystander-aktivering av CD8 plus T-celler bidrar till den snabba produktionen av IFN-gamma som svar på bakteriella patogener. J. Immunol. 166, 1097–1105 (2001).

29. Zimmermann, P. et al. Inverkan av neonatal Bacille Calmette-Guerin (BCG) immunisering på heterologa vaccinsvar hos spädbarn. Vaccin 37, 3735–3744 (2019).

30. Ritz, N., Mui, M., Balloch, A. & Curtis, N. Icke-specifik effekt av Bacille CalmetteGuerin-vaccin på immunsvaret på rutinmässiga immuniseringar. Vaccin 31, 3098–3103 (2013).

31. Libraty, DH et al. Neonatal BCG-vaccination är associerad med förstärkt T-hjälpare 1-immunsvar mot heterologa spädbarnsvacciner. Tester Vaccinol. 3, 1–5 (2014). 32. du Plessis, WJ et al. Det funktionella svaret av B-celler på antigen stimulering: en preliminär rapport om latent tuberkulos. PLoS ONE 11, e0152710 (2016).

33. Biering-Sorensen, S. et al. Variation av tillväxt i produktionen av BCG-vaccinet och sambandet med immunsvaret. En observationsstudie inom en randomiserad studie. Vaccin 33, 2056–2065 (2015).

34. Ru, H. et al. Effekten av Genome Region of Difference 4 (RD4) på ​​mykobakteriell virulens och BCG-effekt. Främre. Cell. Infektera. Microbiol. 7, 239 (2017). 35. Cho, T. et al. En översyn av BCG-vaccinet och andra metoder för att utrota tuberkulos. Brum. Vaccin. Immunother. 17, 2454–2470 (2021).

36. Brosch, R. et al. Genom plasticitet av BCG och inverkan på vaccinets effektivitet. Proc. Natl Acad. Sci. USA 104, 5596–5601 (2007).

37. Plotkin, SA Korrelat av skydd inducerat av vaccination. Clin. Vaccin. Immunol. 17, 1055–1065 (2010).

38. Ross, PJ et al. Det relativa bidraget från Th1- och Th17-celler i adaptiv immunitet mot Bordetella pertussis: mot den rationella designen av ett förbättrat acellulärt pertussisvaccin. PLoS Pathog. 9, e1003264 (2013).

39. de Graaf, H. et al. Undersökning av Bordetella pertussis-kolonisering och immunitet: protokoll för en slutenvårdskontrollerad human infektionsmodell. BMJ Open 7, e018594 (2017).

40. da Silva Antunes, R. et al. Th1/Th17-polariseringen kvarstår efter helcellskikhostavaccination trots upprepade acellulära boosters. J. Clin. Undersök. 128, 3853–3865 (2018).

41. Hijnen, M., van Gageldonk, PG, Berbers, GA, van Woerkom, T. & Mooi, FR Bordetella pertussis virulensfaktor P.69 pertactin behåller sina immunologiska egenskaper efter överproduktion i Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 41, 106–112 (2005).

42. Kalina, T. et al. EuroFlow-standardisering av instrumentinställningar för flödescytometer och immunfenotypningsprotokoll. Leukemi 26, 1986–2010 (2012).

43. Blanco, E. et al. Åldersassocierad fördelning av normala B-cells- och plasmacellsundergrupper i perifert blod. J. Allergy Clin. Immunol. 141, 2208–2219. e2216 (2018).

44. Bates, D., Machler, M., Bolker, BM & Walker, SC Passar linjära blandade effekter-modeller med lme4. J. Stat. Softw. 67, 1–48 (2015).

45. Lenth, R. Emmeans: uppskattade marginalmedel, aka minsta kvadrater, medel (2018).

46. ​​Kuhn, M. Bygga prediktiva modeller i R med hjälp av caret-paketet. J. Stat. Softw. 28, 1–26 (2008).

TACK

Vi vill tacka Anne-Marie Buisman (RIVM) för att ha levererat de PT- och FHA-antigener som användes för PBMC-återstimuleringsexperiment. Vi tackar alla frivilliga som deltog i försöket. Detta arbete stöddes av det nationella institutet för folkhälsa och miljö (RIVM), Nederländerna (SPR-projekt S112200). MGN fick stöd av ett ERC Advanced Grant (#833247) och ett Spinoza-anslag från den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning.

FÖRFATTARBIDRAG

Konceptualisering: BAB, MGN, RvC och DAD; metodik: ES, MJE, GAMB, PGMvG, BAB och LCJdB; undersökning: ES, MJE, GAMB, PGMvG, BAB, LCJdB och JG; formell analys: JG; skriftligt originalutkast: JG och DAD; skrivgranskning och redigering: alla.

KONKURRERANDE INTRESSEN

MGN har ett patent inom nanobiologi för att hämma tränad immunitet licensierad till TTxD, och ett patent inom nanobiologi för att stimulera tränad immunitet licensierad till TTxD. Alla andra författare rapporterar inga potentiella konflikter. Alla författare har skickat in ICMJE-formuläret för avslöjande av potentiella intressekonflikter.

YTTERLIGARE INFORMATION

Kompletterande information Onlineversionen innehåller kompletterande material tillgängligt på https://doi.org/10.1038/s41541-022-00438-4.

Korrespondens och förfrågningar om material ska ställas till Dimitri A. Diavatopoulos.

Omtryck och tillståndsinformation finns på http://www.nature.com/reprints

Utgivarens anteckning Springer Nature förblir neutral när det gäller jurisdiktionsanspråk i publicerade kartor och institutionella anknytningar.

Fri tillgång

Den här artikeln är licensierad under en Creative Commons Attribution 4.0 internationell licens, som tillåter användning, delning, anpassning, distribution och reproduktion i vilket medium eller format som helst, så länge du ger lämplig kredit till den ursprungliga författaren/författarna ) och källan, tillhandahåll en länk till Creative Commons-licensen och ange om ändringar har gjorts. Bilderna eller annat material från tredje part i denna artikel ingår i artikelns Creative Commons-licens om inte annat anges i en kreditgräns till materialet. Om material inte ingår i artikelns Creative Commons-licens och din avsedda användning inte är tillåten enligt lagstadgade regler eller överskrider den tillåtna användningen, måste du få tillstånd direkt från upphovsrättsinnehavaren.

For more information:1950477648nn@gmail.com