Gynnsamma effekter av Echinacoside på diabetisk kardiomyopati hos diabetiska Db/Db-möss

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Xiang Zhang och Yarong Hao

Introduktion

Diabetisk kardiomyopati (DCM) är en allvarlig komplikation av diabetes, med hög sjuklighet och hög risk för kardiovaskulär sjukdom och mortalitet hos diabetespatienter.1 Incidensen av DCM hos patienter med diabetes i anamnesen Mer än eller lika med 5 år är över 44,4 procent , som ökar till 56 procent efter 8 år.2,3 DCM är en sorts primär kardiomyopati, som visar sig som hjärtstrukturella och funktionella abnormiteter orsakade av myokardfibros cellapoptos och mikrovaskulära lesioner hos diabetespatienter utan ischemisk eller hypertensiv hjärtsjukdom och kan inducera hjärtarytmi med hjärtchock och plötslig död vid hjärtsvikt.4 På grund av den komplexa patogenesen av DCM och dess diagnos i avancerade stadier finns inga effektiva behandlingar.5 Hyperglykemi är den initierande faktorn under DCM-patogenes. Långvarig hyperglykemi resulterar i störd glukos- och lipidmetabolism i kardiomyocyterna hos diabetespatienter, vilket leder till skador på vaskulära endotelceller och andra vävnader, vilket främjar patologiska förändringar inklusive hypertrofi, nekros, apoptos och myokard interstitiell fibros.6,7 Glukos och lipid metabolismstörningar är nyckeln till de patologiska mekanismerna för DCM. Den effektiva kontrollen av energimetabolismen i kardiomyocyter representerar därför en viktig terapeutisk strategi för DCM.

cistanche tubulosa behandlaDiabetisk kardiomyopati

Myokardial lipidackumulering i DCM förvärrar utvecklingen av hjärtsvikt. PPAR- är en nyckelregulator för olika relaterade gener i fettsyraoxidationssystemet i cellperoxidaser, mitokondrier och mikrosomer, och spelar en nyckelroll under lipidmetabolism och reglering av inflammation och immunitet.8 PPAR- förbättrar lipidmetabolismen genom mitokondriella och peroxidas fettsyra beta-oxidation, medierad genom karnitin palmitoyl transferas-I (CPT-I).9 Oxidationen av långa och grenade fettsyror10 minskar syntesen och sammansättningen av lipoproteiner och VLDL.11 Den indirekta regleringen av gallsyrasyntes främjar kolesterolutsöndring12 och hämmar uttrycket av inflammatoriskt associerade gener. PPAR-uttryck i levern är signifikant lägre hos patienter med icke-alkoholisk fettleversjukdom eller i djurmodeller av långvarig högfettkonsumtion.13,14 Everett et al visade att nivåerna av leverassocierade fria fettsyror ökade signifikant. i PPAR- knockout-musmodeller på grund av försvagad lipidmetabolism, vilket främjar leversteatos.15 Dessa fynd tyder på att PPAR- spelar en viktig roll i patogenesen av lipidmetabolism.

Echinoside (ECH) är en naturlig förening isolerad från stjälkarna avcistanche tubulosa.Den aktiva kemikalien i ECH är en fenyletanoid, som uppvisar antioxidant-, anti-trötthets-, antitumör- och antiinflammatoriska effekter och kan förbättra minnet, nerv- och leverskyddet och förbättra immunregleringen.16,17 I studien om db/db diabetiska möss, fann man att ECH kunde förbättra insulinresistensen, öka HDL-nivån och minska TG-, TC- och LDL-nivåerna, vilket tyder på att ECH effektivt kunde förbättra diabetisk lipidmetabolism.18 Dessutom bevisade Shimoda et al att echinacoside kan påverka lipidmetabolismen genom att reglera mRNA relaterat till hepatobiliär steroltransport

och metabolism.19 Tidigare studier har visat att ECH reglerar uttrycket av TGF- och dess nedströmsgener för att förbättra njurfibros i db/db-möss.20 I denna studie, för att ytterligare förstå de skyddande effekterna av ECH på myokardcellsskada i DCM och för att utforska dess potentiella molekylära mekanismer använde vi db/db-möss som en DCM-sjukdomsmodell och undersökte de reglerande mekanismerna för ECH på proteiner som kontrollerar glukos- och lipidmetabolismstörningar, oxidativ stress och apoptos i kardiomyocyter. Vårt mål var att tillhandahålla en teoretisk grund för effektiv behandling av DCM.

cistanche tubulosa

Material och metoder

Kemikalier och reagenser

ECH-pulver (94 % renhet detekterad med HPLC, sats nr. 190906) (Supplement Figur 1) erhölls från Shanghai Medical Science Company, Ltd. (Shanghai, Kina). ECH löstes i vatten till 2 mg/ml och förvarades vid 4 grader i mörker. ECH administrerades i en dos på 100–500 mg/kg·d och sänktes avsevärt

blodsocker och förbättrade blodlipidnivåer.18 ECH visade dosberoende hypoglykemiska och antihyperlipidemiska effekter.

Försöksdjur och behandling

Djurförsök utfördes i enlighet med National Institutes of Healths riktlinjer (NIH Pub. nr 85-23, reviderad 1996). Protokoll godkändes av den experimentella djuretiska kommittén och djurfodercentret vid Renmin Hospital vid Wuhan University (Wuhan, Kina, nr 20190517). Vuxna C57BLKS/J db/db-möss och db/m-möss (SPF-klass) köptes från Nanjing University–Nanjing Biomedical Research Institute (Nanjing, Folkrepubliken Kina, nummer: SCXK (Sue) 2018-0001). Djur hölls i bur i djurcentret på Renmin-sjukhuset (Wuhan, Kina) vid rumstemperatur (20 grader), en relativ luftfuktighet på 50 procent -60 procent och utsattes för ett 12-h ljus/ mörk cykel. Adaptiv matning utfördes under 1 timme och inga hypoglykemiska läkemedel administrerades.

Efter karantän tilldelades db/db-möss slumpmässigt till diabetesmodellgruppen (db/db-grupp, n{{0}}), ECH-behandlingsgrupp (db/db plus ECH-grupp, n=11 ) eller db/m kontrollgrupp (db/m, n=9). Vid 8 veckor administrerades möss i db/db- och db/m-grupperna oralt 0,05 ml/10 g kroppsviktslösning under 10 veckor, medan möss i db/db plus ECH-gruppen administrerades 300 mg/(kg/d) oralt.

ECH enligt kroppsvikt i 10 veckor. Kroppsvikterna för de tre grupperna av möss övervakades varje vecka och matning, drickande och aktivitet utvärderades. När mössen hade fastat i 8 timmar togs blodprov (~50 ul) från svansänden varannan vecka med en blodsockermätare och testpapper (Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ, USA) för att bestämma blodsockernivåerna . Efter 10 veckors intervention sövdes mössen genom intraperitoneal injektion med 2 procent pentobarbitalnatrium (Shanghai Harvest Company, Shanghai, Folkrepubliken Kina) (100 mg/kg). Blod samlades in efter införande av en kapillär nål och serum separerades snabbt och lagrades vid -80 grader för analys. Efter hjärtperfusion med kall-PBS för att avlägsna blodet, avlägsnades fri PBS med filterpapper. Hjärtvävnad separerades och vägdes och hjärtats torrvikt mättes. Buken på möss rakades, buken öppnades efter alkoholdesinfektion (70 procent) och den subkutana fettvävnaden från buken avlägsnades snabbt och vägdes blöt. Mössens skenben isolerades och mättes. Hjärthypertrofi bedömdes genom förhållandet mellan hjärtvikt och tibial längd (HW/TL) (mg/mm). Hjärtvävnader fixerades med 4 procent paraformaldehyd (Google biotechnology, Wuhan, Folkrepubliken Kina) och biopsier utfördes för att övervaka myokardvävnadens morfologi. Den återstående hjärtvävnaden placerades i flytande kväve i 1 timme och lagrades vid -80 grader före RT-PCR och Western blot-analys.

Ekokardiografi

Ultraljud (VisualSonics, Toronto, ON, Kanada) utfördes för ekokardiografiska mätningar i slutet av experimentet. Möss bedövades genom intraperitoneal injektion av 4 procent kloralhydrat vid 30 mg/kg under en halvtimme,21 rakades för att exponera bröstområdet och fixerades på en platt platta. Den vänstra ventrikulära systoliska diametern (DVD), LV diastolisk diameter (LVD), LV ejektionsfraktion (EF) och LV fraktionell förkortning (FS) bestämdes.

Metaboliska och biokemiska parametrar

Vid 18 veckors ålder centrifugerades blodprover vid 4 grader under 20 minuter för serumuppsamling. En totalautomatiserad biokemisk analysator (ADVID2400, Tokyo, Japan) användes för att detektera totalkolesterol (TC), triglycerider (TG), fria fettsyror (FFA), högdensitetslipoproteinkolesterol (HDL-c) och lågdensitet lipoprotein-kolesterol (LDL-c) i serumet.

Antioxidation: cistanche tubulosa

Oxidationsindex och antioxidantnivåer

Färska vänsterkammarmyokardvävnader (50 mg) av varje grupp erhölls. Nivåerna av SOD, GSH-px och MDA i myokardcellerna bestämdes med användning av kommersiella kit (Nanjing Jiangcheng Bioengineering Institute, Kina).

Trikrom-, Tunel- och Sudan II-färgning Den vänstra kammarregionen av myokardvävnaden hos varje grupp av möss fixerades i 4 procent paraformaldehyd under 24 timmar, paraffininbäddades, snittades och HE-färgades. Patologiska och morfologiska förändringar av myokardfibrerna i varje grupp av möss observerades under ljusmikroskopi (JEOL, Tokyo, Japan). Hjärtmyocytapoptos detekterades med Tunel-analyser (nummer 11684817910, Roche, USA). Hjärtvävnad förbehandlades med paraformaldehyd, inbäddades och skivades. Sektioner tvättades med xylen I (Shanghai, Folkrepubliken Kina) (20 min) -xylen II (20 min) -vattenfri etanol I (10 min) -vattenfri etanol II (10 min) -95 procent alkohol (5 min){{ 14}} procent alkohol (5 min)-80 procent alkohol (5 min) −70 procent alkohol (5 min) och destillerat vatten. Sektioner torkades genom skakning och histokemiska borstringar användes för att förhindra vätskeförlust. Proteas K tillsattes till ringarna för att täcka vävnaden. Efter inkubation vid 37 grader i 15 minuter placerades objektglasen i PBS (pH 7,4) och tvättades i en avfärgande skakapparat (tre gånger under 5 minuter). Reagens 1 (TdT) och 2 (dUTP) blandades i ett förhållande av 1:9 och sattes till det inre höljet av vävnaden. Blandningar inkuberades i ett vattenbad vid 37 grader under 60 min. En liten volym vatten tillsattes för att upprätthålla fuktigheten. Objektglasen sköljdes i PBS och DAPI-färgades (Biologisk Aspen, Wuhan, Folkrepubliken Kina) i mörker under 5 min. Objektglasen sköljdes i PBS och monterades med användning av ett antifluorescenssläckningsmedel. Sektioner visualiserades med fluorescerande mikroskopi och avbildades. Sudan II-färgning användes för att observera lipidackumulering i hjärtmyocyterna. Vänsterkammarvävnad fixerades i 10 procent paraformaldehyd i 30 minuter, färgades med Sudan red II (Gefen, Shanghai, Kina) vid rumstemperatur i 10 minuter, avfärgades med 75 procent alkohol och färgades om i PBS i 15 minuter . Förhållandet mellan myokardfibrosen och den totala ytan i Massons färgade trikromsektioner bestämdes med hjälp av Image-Pro Plus kvantitativ programvara. Objektglasen monterades med användning av glyceringelatin och avbildades via mikroskopi.

Resultat

Effekter av ECH på Db/Db-möss

Möss i db/db-grupperna visade tydlig polyfagi och polyuri. Kroppsstorlekarna var också signifikant större än de hos db/m mössen. Kroppsvikterna i db/db-gruppen ökade signifikant i förhållande till db/m-gruppen (Figur 1A; **p<0.01). body="" weights="" of="" the="" db/db="" +="" ech="" group="" were="" significantly="" lower="" than="" those="" of="" the="" db/="" db="" group="" after="" 10="" weeks="" of="" ech="" treatment="" (figure="" 1a;=""><0.05). at="" week="" 15,="" the="" difference="" in="" body="" weight="" of="" each="" group="" gradually="" appeared="" after="" ech="" intervention.="" the="" abdominal="" fat="" thickness="" of="" mice="" in="" the="" db/db="" group="" was="" higher="" than="" those="" in="" the="" db/m="" group="" (figure="" 2b;=""><0.01). ech,="" therefore,="" improves="" obesity="" in="" db/db="" mice,="" the="" specific="" mechanisms="" of="" which="" require="" further="">

Fastande blodsockernivåer bedömdes varje vecka. Som visas i figur 1B, jämfört med db/m-möss, ökade fastande blodsockernivåer hos db/db-mössen signifikant med åldern och visade uppenbar hyperglykemi (figur 1B; *p<0.01). over="" a="" 10="" week="" period,="" fasting="" blood="" glucose="" levels="" in="" the="" db/db="" and="" db/db="" +="" ech="" group="" increased,="" whilst="" glucose="" levels="" in="" the="" db/m="" group="" remained="" stable.="" fasting="" blood="" glucose="" levels="" in="" the="" db/="" db="" +="" ech="" group="" were="" slower="" than="" those="" of="" the="" db/db="" group="" (figure="" 1b;=""><0.01), suggesting="" that="" ech="" markedly="" improved="" hyperglycemia="" in="" db/db="" diabetic="" mice.="" we="" speculated="" that="" ech="" could="" promote="" the="" synthesis="" of="" liver="" glycogen="" and="" inhibited="" the="" activity="" of="" α-glucosidase="" to="" suppressed="" glucose="" transport="" in="" the="" small="" intestine,="" significantly="" contributing="" to="">

Diskussion

Diabetisk kardiomyopati delas i allmänhet in i fyra stadier. I det första skedet ökade vänsterkammarmassan, diastolisk dysfunktion och ejektionsfraktion (EF) normal. Även kliniskt asymtomatisk ökade myokardfibros, tidig diastolisk fyllning minskade och vänsterkammars slutdiastoliska tryck ökade.22 Det andra stadiet kännetecknas av ökad vänsterkammarmassa, förtjockade kammarväggar, systolisk och diastolisk dysfunktion (EF<50%), mild="" cardiac="" dilatation.="" in="" the="" third="" stage,="" diastolic="" dysfunction="" and="" arterial="" hypertension="" contribute="" to="" systolic="" dysfunction="" and="" microangiopathy.="" stage="" iv,="" moderate-severe="" systolic="" dysfunction,="" cardiac="" dilatation,="" fibrosis,="" and="" microvascular="" and="" macrovascular="" lesions="" cause="" severe="" and="" irreversible="" changes="" in="" heart="" tissue="" ultimately.26="" myocardial="" cell="" apoptosis,="" necrosis,="" hypertrophy,="" and="" fibrosis="" increase="" leading="" to="" disorders="" of="" diastolic="" and="" systolic="" functioning.6,27="" this="" eventually="" develops="" into="" ischemic="" heart="" disease="" and="" heart="" failure.28="" in="" this="" study,="" blood="" glucose="" and="" serum="" lipid="" levels="" of="" db/db="" mice="" significantly="" increased="" in="" the="" db/db="" group.="" symptoms="" of="" obesity="" were="" also="" observed,="" including="" body="" weight="" changes="" and="" increases="" in="" the="" rate="" of="" hw/tl="" compared="" to="" the="" db/m="" group.="" he="" staining="" and="" masson's="" trichrome="" staining="" of="" the="" heart="" showed="" obvious="" pathological="" changes="" in="" the="" cardiac="" myocytes="" of="" the="" db/db="" group,="" including="" hypertrophy="" and="" necrosis,="" disordered="" cardiac="" myocytes,="" and="" high="" levels="" of="" extracellular="" matrix="" deposition.="" these="" data="" indicate="" that="" db/db="" mice="" exhibit="" early="" dcm="" under="" long-term="">

ATP är den grundläggande energikällan för hjärtat. Hjärtenergi tillhandahålls av oxidation och nedbrytning av FA, som står för ~70 procent av hjärtats energitillförsel.29 Återstoden tillhandahålls av kolhydrater som glukos och mjölksyra.30 Diabeteshjärtan utsätts för ökad energiförbrukning och obalanser i myokardkapacitet, som representerar den huvudsakliga orsaken till myokardmetaboliska störningar, inklusive minskad glukosmetabolism och ökad FA-metabolism. Detta leder till ökat FA-upptag och oxidation som leder till fettackumulering och bildning av giftiga fettämnen, vilket direkt leder till DCM-lesioner.31

Slutsatser

Hos db/db-möss med diabetiskt myokardium är glukos- och lipidmetabolismen dysreglerad, vilket leder till ökade nivåer av oxidativ stress och apoptos. Denna studie bekräftade att ECH avsevärt kan minska långvarig hyperglykemi hos db/db-möss genom PPAR/M-CPT-1/GLUT-4-signalering. Samtidigt förbättrade ECH oxidativ stress och hämmade myokardial apoptos hos db/db DCM-möss, vilket kan vara relaterat till förbättrad energimetabolism. Även om de underliggande mekanismerna som styr dessa effekter inte upptäcktes, ger dessa fynd en ny riktning för behandlingen av DCM och ECH:s skyddande roll för att förbättra myokardskada.

Referenser

1. Bauters C, Lamblin N, Mc Fadden EP, Van Belle E, Millaire A, de

Groote P. Inverkan av diabetes mellitus på hjärtsviktsrisk och resultat. Kardiovasc Diabetol. 2003;1(8):1–2. doi:10.1186/1475- 2840-2-1

2. Tate M, Grieve DJ, Ritchie RH. Finns riktade terapier för diabetisk kardiomyopati i horisonten? Clin Sci. 2017;131(10):897–915. doi:10.1042/CS20160491

3. Khan H, Anker SD, Januzzi JJ, et al. Hjärtsviktsepidemiologi hos patienter med diabetes mellitus utan kranskärlssjukdom. J-kort misslyckas. 2019;25(2):78–86. doi:10.1016/j.cardfail.2018.10.015

4. Sheila K, Patel B. CTGF-genen -945 G/C polymorfism är inte associerad med hjärt- eller njurkomplikationer hos patienter med typ 2-diabetes. Kardiovasc Diabetol. 2012;1(11):42.