DELⅠ: Nya skyddande effekter av Cistanche Tubulosa-extrakt mot låg-luminans blått ljus-inducerad degenerativ retinopati
Mar 04, 2022
Kontakt: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com
Man-Ru Wu Cheng-Hui Lin Jau-Der Hob George Hsiao, Yu-Wen Cheng
School of Pharmacy, College of Pharmacy, Taipei Medical University, Taipei, Department of Ophthalmology, Taipei Medical University, Taipei, Department of Pharmacology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, Taipei, Graduate Institute of Medical Sciences, College of Medicin, Taipei Medical University, Taipei, Ph.D. Program i bioteknologisk forskning och utveckling, College of Pharmacy, Taipei Medical University, Taipei, Taiwan
Abstrakt
Bakgrund/Mål:Blått ljusemitterande diodljus (BLL)-inducerad fototoxicitet spelar en viktig roll vid ögonsjukdomar och orsakar retinal degeneration och apoptos i humana retinala pigmentepitelceller (RPE).Cistanche tubulosa extrakt (CTE)är en traditionell kinesisk medicin med många fördelaktiga skyddsegenskaper; dock har få studier undersökt de ögonskyddande rollerna för CTE. I denna studie undersökte vi mekanismerna bakom effekterna av CTE på BLL-inducerad apoptos in vitro och in vivo. Metoder: RPE-celler användes i den aktuella in vitro-studien och cellviabiliteten bestämdes med en 3-(4,5-dimetyltiazol- 2-yl)-2,{{6} }difenyltetrazoliumbromidanalys. Apoptosrelaterat proteinuttryck bestämdes genom western blot-analys och immunfluorescensfärgning. Bruna norska råttor användes för att undersöka exponering för kommersiellt tillgänglig BLL in vivo. Hematoxylin- och eosinfärgning, terminal deoxinukleotidyltransferas dUTP nick end-märkning (TUNEL) och western blot-analyser användes för att undersöka retinal morfologisk deformation. Resultat: CTE hämmade signifikant väteperoxid-, tertbutylhydroperoxid-, natriumazid- och BLL-inducerad RPE-skada. Vidare minskade CTE uttrycket av apoptotiska markörer som kluvet kaspas-3 och TUNEL-färgning efter BLL-exponering genom att inaktivera apoptotiska vägar, vilket visas via immunfluorescerande färgning. Dessutom inhiberade CTE den BLL-inducerade fosforyleringen av c-Jun N-terminalt kinas, extra signalrelaterade kinaser 1/2 och p38 i RPE-celler. In vivo räddade oral administrering av CTE 60-dagars periodiska BLL-exponeringsinducerade minskningar i näthinnetjockleken och minskade antalet TUNEL-positiva celler i den bruna norska råttmodellen. Slutsats: CTE är ett potentiellt profylaktiskt medel mot BLL-inducerad fototoxicitet
Introduktion
Studier av åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) har rapporterat att 8,7 procent av världens befolkning lider av denna sjukdom [1]. AMD är en neurodegenerativ sjukdom som orsakar fotoreceptordeformation, retinal pigmentepitel (RPE) atrofi, ganglioncellapoptos och central synförlust hos den äldre befolkningen och håller på att bli en global social börda. AMD klassificeras i antingen torr eller våt form [2, 3]. Förbättringar i tekniken har resulterat i att människor spenderar mer tid på att använda moderna digitala enheter, och följaktligen utsätts människor för utsläpp av blått ljus (BL) under långa perioder. Emellertid är frågan om BL-inducerad fototoxicitet i näthinnan inte väl undersökt. Överexponering för BL med kort våglängd (450–495 nm) resulterar i generering av reaktiva syrearter (ROS), såsom superoxid och hydroxylradikaler, som orsakar ökad syreförbrukning och inducerar mitokondriell DNA-skada. Ansamlingen av ROS resulterar i oxidativ stress och den omfattande ackumuleringen av retinoidadukter, som skadar näthinnan ytterligare [4]. Forskning har visat att oxidativ stress är en ledande faktor i patogenesen av torr AMD [5]. Dessutom minskar BL-bestrålning uttrycket av retinala antioxidantenzymer, såsom superoxiddismutas och katalas, genom att mediera Bax/Bcl{13}}-proteininteraktioner och främja endogen ROS-produktion. Som sådan lider RPE-celler och det yttre segmentets mitokondrier av fotoreceptorer av BL-strålningsinducerad skada [6, 7]. Förutom ROS-generering aktiverar BL-bestrålning mitogenaktiverade proteinkinaser (MAPK), som spelar en viktig roll i cellöverlevnad och apoptos. mitokondrieberoende apoptosrelaterade pro-apoptotiska proteiner, såsom Bax och kaspas-3, aktiveras av BL-emitterande diodljus (BLL) bestrålning via c-Jun N-terminal kinas (JNK) och p38 vägar i RPE och retinala ganglieceller [8]. Dessutom är fosfatidylinositol 3-kinas (PI3K)/Akt och nukleär faktor erytroid 2-relaterade faktor 2 (Nrf2)-beroende antioxidativa vägar komponenter i RPE-cellers försvarssystem [{{34} }].
Cistanche tubulosa extrakt (CTE)innehåller fenyletanoidglykosidderivat och har använts som traditionell kinesisk medicin i årtionden. Echinakosid, akteosid och isoakteosid är tre huvudsakliga aktiva föreningar av CTE som kännetecknas av att ha neuroprotektiva, minneshöjande, immunreglerande och anti-leverfibrosegenskaper [13, 14]. Echinacoside är en ROS-rensare och skyddar mot 1-metyl-4-fenylpyridiniumjon (MPP plus)-inducerad apoptos i djurmodeller av Parkinsons sjukdom [15, 16]. Acteosid skyddar mot amyloid{10}}inducerad neurotoxicitet och minskar lipopolysackaridstimulerad inflammation, hänförlig till translokationen av Nrf2 från cytoplasman till kärnan och bindning till antioxidantresponselement. De nuvarande tillgängliga terapierna för våt AMD, såsom pegaptanib, ranibizumab, bevacizumab och aflibercept, används för att hämma överdriven angiogenes [17, 18]. Det finns dock inga effektiva behandlingar för torr AMD, på grund av de många patologiska komplikationerna av denna sjukdom.
I denna studie visar vi de skyddande effekterna av CTE i RPE-celler och Brown Norway (BN)-råttor. Dessutom tillämpade vi långvarig låg luminans BLL-exponering på både in vitro- och in vivo-modeller för att utvärdera de skyddande effekterna av CTE. Vi fann att CTE minskade uttrycket av apoptosrelaterade proteiner efter exponering för BLL. Dessutom minskade CTE antalet terminala deoxinukleotidyltransferas dUTP nick end-märkning (TUNEL)-positiva celler i näthinnan hos BN-råttor efter långvarig exponering för låg luminans BLL. Denna studie ger ytterligare insikter i de nya anti-apoptotiska effekterna av CTE och information om en ny strategi för behandling av retinal degeneration.
Cistanche tubulosa-extrakt (CTE): fenyletanoidglykosid
Material och metoder
Kemikalier och produkter
CTE tillhandahölls generöst av Sinphar Pharmaceutical Company (Yilan, Taiwan). In situ celldödsdetektionskit (kat. nr. 11-684-817-910) köptes från Roche (Mannheim, Tyskland).
RPE-cellkultur
RPE-celler (ARPE{{0}} och ATCC® CRL-2302™) köptes från American Type Culture Collection (Manassas, VA) och odlades i Dulbeccos modifierade Eagles medium (Gibco, Grand Island, NY) kompletterat med 10 procent fetalt bovint serum i en fuktad atmosfär av 5 procent CO2 vid 37 grader . ARPE-19-celler vid passage 19–30 bibehölls på 10-cm cellodlingsskålar (Orange Scientific, Braine-l'Alleud, Belgien). Efter passage med 0,05 procent trypsin-etylendiamintetraättiksyra (Gibco) utströks cellerna på nytt i ett förhållande av 1:4. Före testning såddes ARPE-19-celler på 48-brunnsplattor (Orange Scientific) för cellviabilitetsanalyser med en densitet av 1,0 × 105 celler/mL och på 6-cm skålar (Orange Scientific) ) för western blotting-analyser vid en densitet av 2,0 × 105 celler/ml under 24 timmar. Efter att ARPE-19-celler nått 80 procent sammanflöde utfördes följande experiment.
Läkemedelsbehandling och cellviabilitetsanalys
RPE-celler vid passage 19–30 såddes på 48-brunnsplattor och sambehandlades i 24 timmar med olika koncentrationer av CTE, väteperoxid (H2O2), tert-butylhydroperoxid (t-BHP) och natriumazid ( NaN3). Cellerna odlades sedan med 3-(4, 5-dimetyltiazol-2-yl)-2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) i en slutlig koncentration av 1 mg /ml och inkuberades under 30 min. Dimetylsulfoxid (200 µL) sattes sedan till varje brunn för att lösa upp cellerna. Absorbansen mättes vid 570 nm med användning av en Sunrise™ spektrofotometer enzymkopplad immunosorbentanalysläsare (MRX-TC; Dynex Technologies, Chantilly, VA). Värden korrigerades för bakgrundsabsorbans genom att subtrahera de lämpliga blankämnena. Data är från fem oberoende analyser.
In vitro BL exponeringsprotokoll
Ljuskällan och cellplattorna placerades 25 cm från varandra, som beskrivits i vår tidigare studie [19]. Luminansen mättes med en ljusmätare (LM-81LX; Lutron Electronic Enterprise, Taipei, Taiwan). BLL toppade vid 46 0 nm (60 lux) under den angivna tiden (0–48 timmar), beroende på experimentdesignen.
Western blotting
Efter 0–48- timmars samtidig behandling med CTE- och BLL-exponering tvättades cellerna två gånger med iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och återsuspenderades i en radioimmunoutfällningsanalys-lysbuffert (1 procent Nonidet) P-40, 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM Na3VO4, 1 mM etylenglykol-bis (-aminoetyleter)-N,N,N',N'-tetraättiksyra, 1 mM NaF och proteas/fosfatasinhibitorcocktail). Cellysatet erhölls via centrifugering vid 12, 000 x g under 35 minuter, och supernatanten samlades upp för att bestämma proteinkoncentrationer via Bradford-reagenset (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Lika mängder proteinprover separerades med 10–12 procent natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores och överfördes sedan till ett polyvinylidendifluoridmembran. Efter att membranet blockerats med 5 procent fettfri mjölk och inkuberats i Tris-buffrad saltlösning med Tween 20 (TBST) i 1 timme, utfördes immunblotting med primära antikroppar specifika för kluvna kaspas -3, fosfo-JNK, JNK , fosfo-p38, p38, fosfo-extracellulärt signalrelaterat kinas (ERK), ERK, Bcl-2, Bax, Fas-associerat protein med dödsdomän (FADD), kaspas-8 (GeneTex, Irvine , CA), Fas-ligand (Abcam, Cambridge, Storbritannien) och b-aktin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Blotterna inkuberades sedan med pepparrotsperoxidaskonjugerade sekundära antikroppar (1:6000 i TBST; Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) under 1 timme vid rumstemperatur. Med användning av ett förbättrat kemiluminescenskit (Millipore, Billerica, MA) analyserades intensiteten av banden på varje blöt med Image J-mjukvara efter normalisering till b-aktin.
Immunfluorescens
RPE-celler fixerades med 4 procent paraformaldehyd i PBS under 15 min. Triton X-100 i PBS (0,2 procent) tillsattes sedan till cellerna under 15 minuter, följt av 5 procent fetalt bovint serum i PBS under 30 minuter; cellerna inkuberades sedan med en anti-klyvd kaspas-3-antikropp i ett förhållande på 1:250 under 24 timmar (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). En sekundär get-anti-kanin-IgG-antikropp (Dylight 594) användes i ett förhållande av 1:200 (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Cellkärnor färgades med 4′-6-diamidino-2-fenylindol (DAPI; AAT Bioquest, Sunnyvale, CA). Förändringar i fluorescens observerades med ett laser CS SP5 konfokalt spektralmikroskop avbildningssystem (Leica, Teban Gardens, Singapore).
TUNEL-färgning
DNA-fragment, som kan detekteras med en TUNEL-analys, är ett betydande kännetecken för apoptos. Vi använde ett In Situ Cell Death Detection Kit (kat. nr. 11-684-817-910; Roche) för att mäta apoptotisk programmerad RPE-celldöd enligt tillverkarens protokoll. Kortfattat fixerade vi RPE-celler med 4 procent paraformaldehyd och märkte DNA-strängbrotten i en enzymatisk reaktion för att detektera TUNEL-positiva celler, som presenterades med en grönfluorescerande färg. De färgade cellerna skannades sedan och analyserades med ett Tissue FAXS-plus Imaging System (TissueGnostics, Wien, Österrike). Tiotusen händelser räknades i den gated RPE-regionen, och vi analyserade bilderna för antalet TUNEL-positiva celler med TissueQuest/HistoQuest programvara (TissueGnostics).
Djurförsök
BN-hanråttor (300–350 g kroppsvikt) köptes från National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan) och hölls i 2–3 månader. Råttorna hölls i en 12-h/12-h ljus/mörkercykel vid 26 ± 1 grad, 35–47 procents relativ luftfuktighet och ad libitum tillgång till vatten och mat. Obehandlade råttor hölls i mörker för att tjäna som kontroller. Studieprotokollen godkändes av Institutional Animal Care Use Committee vid Taipei Medical University (godkännandenummer: LAC-2016-0442). Alla experimentella förfaranden som involverade användning av djur överensstämde med Association for Research in Vision and Ophthalmology statements för användning av djur i oftalmisk och synexperimentell forskning.
BLL-inducerad råttmodell av retinal degeneration
Vi använde en periodisk låg-luminans långvarig BLL-exponeringsinducerad modell av retinal degeneration, som beskrivits i vår tidigare studie [19]. Kortfattat delades BN-råttor in i tre grupper: en kontrollgrupp, som hölls under mörka förhållanden; en BLL-exponerad grupp, som exponerades för periodisk BLL i mörker utan pupillvidgning (460 nm, 150 lux) under 3 timmar per dag i 60 dagar; och en CTE-behandlad plus BLL-exponerad grupp, som förbehandlades med CTE (100 mg/kg kroppsvikt) i 14 dagar och sedan samtidigt behandlades med periodisk BLL-exponering i 3 timmar per dag i 60 dagar. Alla råttor återfördes till djurkolonierna och den normala ljus/mörker-cykeln (250 lux, 12 h/12 h) återupptogs vid slutet av experimentperioden.
Statistisk analys
Signifikanta skillnader beräknades med en enkelriktad variansanalys följt av Tukeys post hoc-test och multipla jämförelsetest. Statistisk signifikans bestämdes av p-värden av<>
Företagsnyheter Cistanche tubulosa
Resultat
CTE skyddar RPE-celler från skador på oxidativ stress
För att utvärdera cytotoxiciteten av CTE via MTT-analysen applicerades flera koncentrationer av CTE ({{{{20}}}}–500 ug/mL) på RPE-celler. CTE-behandling hade inga uppenbara toxiska effekter på RPE-cellers livsduglighet vid någon av de testade koncentrationerna (Fig. 1A). Därför användes 50 och 100 ug/mL CTE i de efterföljande experimenten. För att undersöka de anti-apoptotiska effekterna av CTE, administrerades olika oxidativa inducerare (H2O2, t-BHP och NaN3) tillsammans med CTE till RPE-celler i 24 timmar. H2O2, NaN3 och t-BHP minskade cellviabiliteten och skadade RPE-celler på ett dosberoende sätt (skurna staplar, Fig. 1B, 1C och 1D); cellviabiliteten var signifikant lägre i celler behandlade med 0,03 mM H2O2, 0,3 mM NaN3 och 0,3 mM t-BHP än i kontrollgruppen.
Samtidig behandling med 50 och 100 ug/mL CTE dämpade dock H2O2-, NaN3- och t-BHP-inducerad RPE-cellskada och vände minskningen av cellviabilitet (svarta staplar, Fig. IB, IC och ID). Ovanstående data tyder på att CTE räddar RPE-celler från oxidativ stressskada.
CTE hämmar BLL-inducerad RPE-celldöd
I vår tidigare studie fann vi att BLL är cytotoxiskt för RPE-celler, vilket kan tillskrivas förändringar i uttrycket av Bcl-2 och Bax. I den aktuella studien undersökte vi ytterligare de skyddande effekterna av CTE på BLL-inducerad RPE-cellskada. Vi placerade två blå elektriska LED-plattor i en cellkulturinkubator. Avståndet mellan ljuskällan och cellplattorna var 25 cm, och BLL-intensiteten var 60 lux, mätt med en ljusmätare (Fig. 2A). En MTT-analys visade att BLL-exponering under olika tidsperioder (6–48 timmar) orsakade RPE-celldöd på ett tidsberoende sätt (Fig. 2B). De BLL-inducerade minskningarna av cellviabilitet efter 24 och 48 timmar försvagades signifikant när cellerna sambehandlades med CTE (100 ug/ml) (Fig. 2C). Dessa data tyder på att CTE skyddar RPE-celler från BLL-inducerad fototoxicitet.
CTE hämmar BLL-inducerad apoptos i RPE-celler genom att reglera Bcl-2/Bax- och Fas/FasL-vägarna
På grundval av de potentiella skyddande effekterna av CTE i RPE-celler undersökte vi ytterligare den möjliga inblandningen av CTE i denna process. Två apoptotiska signalvägar undersöktes, dvs. Bax/Bcl{{0}}- och Fas/Fas-ligand (FasL)-vägarna, och relaterade proteiner (t.ex. pro-kaspas-8 och pro-kaspas -3; Fig. 3A och 3B). BILL-exponering (6–48 timmar) visade sig uppreglera proteinuttrycket av Bax/Bcl-2, FasL och FADD på ett tidsberoende sätt (Fig. 3A). Dessutom nedreglerade BLL proteinuttrycket av prokaspas-3 och prokaspas-8, vilket resulterade i fler klyvningsformer av kaspas-3 och kaspas-8 efter BLL-exponering, vilket är förenligt med vår tidigare studie [19]. För att ytterligare utvärdera de skyddande effekterna av CTE applicerades olika koncentrationer av CTE på BLL-exponerade RPE-celler (Fig. 3B). Efter 48-h BLL-exponering minskade CTE (50 µg/mL) förhållandet Bax/Bcl-2. Vidare minskade CTE (100 µg/mL) proteinuttrycket av FasL och FADD, men ökade signifikant nivåerna av prokaspas-8 och prokaspas-3 (Fig. 3C och 3D). Studier har visat att kaspas-3-aktivering är en markör för apoptos i RPE-celler [20]. För att ytterligare bekräfta de skyddande effekterna av CTE utförde vi immunfluorescerande färgning av kluvet kaspas-3. BILL-exponering under 48 timmar visade sig inducera kaspas-3-klyvning och translokation in i kärnan, vilket resulterade i RPE-cellapoptos (gula pilar, Fig. 4A). När BLL-exponerade celler sambehandlades med CTE (100 µg/mL), hämmades det BLL-inducerade uttrycket av klyvt kaspas-3. För att bättre förstå de anti-apoptotiska effekterna av CTE använde vi TUNEL-färgning för att detektera DNA-fragment i RPE-celler. Efter 48-h BLL-exponering ökade TUNEL-positiva celler från 1,78 ± 0,36 procent till 23,82 ± 0,33 procent; denna effekt försvagades genom sambehandling med CTE (23,82 ± 0,33 procent till 2,22 ± 0,11 procent; Fig. 4B, 4C och 4D). Dessa resultat indikerar att CTE-behandling starkt skyddar RPE-celler från BLL-inducerad apoptos genom att förmedla Bax/Bcl-2- och FasL/FADD-vägarna.
CTE hämmar BLL-inducerad fosforylering av stressresponsproteiner i RPE-celler
Tidigare studier har visat att MAPK-vägar, såsom ERK, JNK och p38 MAP, aktiveras i RPE-celler och i näthinnan efter exponering för ultraviolett ljus eller BL [21, 22]. För att undersöka de reglerande effekterna av CTE på MAPK-stressresponsvägen efter BLL-exponering, applicerades därför 100 µg/ml CTE på RPE-celler under olika BLL-exponeringstider (Fig. 5A). Western blot-analys indikerade att fosforylerad ERK, JNK och p38 aktiverades vid BLL-exponering, men hämmades signifikant vid samtidig behandling med CTE i RPE-celler (Fig. 5B). Ovanstående resultat indikerar att CTE hämmar BLL-inducerad RPE-cellskada, som kan vara associerad med hämningen av MAPK i RPE-celler.
CTE räddar BLL-inducerad retinal skada efter långvarig periodisk exponering i en råttmodell
För att utvärdera de skyddande effekterna av CTE, exponerade vi BN-råttor för långvarig BLL-exponering i 60 dagar och utvärderade effekterna av CTE. Såsom visas i schemat som presenteras i Fig. 6A, delades BN-råttor in i tre grupper: kontrollgrupp, BLL-exponerad grupp och CTE plus BLL-grupp (Fig. 6A). I CTE plus BLL-gruppen kompletterades BN-råttor kontinuerligt med CTE (100 mg/kg kroppsvikt) genom oral sondmatning en gång dagligen i 14 dagar före BLL-exponering. På dag 0 sambehandlades BN-råttor med CTE (100 mg/kg kroppsvikt) och exponerades för BLL i 3 timmar per dag i 60 dagar. Efter 60 dagars BLL-exponering avlivades djuren för western blot-analys och immunhistokemifärgning. I CTE plus BLL-gruppen var uttrycket av procaspase-3-proteinet i råttögonhomogenat högre efter CTE-behandling än i BLL-gruppen (Fig. 6B och 6C). Dessa data illustrerar att CTE förhindrar långvarig lågluminans BLL-inducerad retinal fototoxicitet och apoptos genom att hämma aktiveringen av klyvt kaspas-3. Immunohistokemifärgning gav fler bevis angående de skyddande effekterna av CTE på strukturen och fysiologiska vägar i näthinnan (Fig. 7). Vidare, efter BLL-exponering fann vi att det inre neuronskiktet minskade och observerade morfologiska deformationer vid det yttre neuronskiktet (ONL), inklusive det inre segmentet/yttre segmentet i både den centrala och perifera näthinnan, vilket överensstämmer med vår tidigare studie ( Fig. 7B). Viktigt är att CTE förhindrade RPE-celldeformation, neuronal cellskada och övergripande uttunning av näthinnan i CTE plus BLL-gruppen (Fig. 7C). Vidare observerade vi inte TUNEL-positiva celler i den centrala och perifera näthinnan hos normala råttor (fig. 8Ab och 8Bb). Omvänt, efter BLL-exponering i 60 dagar, upptäcktes TUNEL-positiva celler ofta i ONL av den centrala och perifera näthinnan (Fig. 8Ae och 8Be). DAPI-färgning av ONL av den centrala näthinnan minskade markant i BLL-gruppen (Fig. 8Ad). Förekomsten av TUNEL-positiva celler försvagades emellertid och DAPI-färgning av den centrala och perifera näthinnan ONL ökade i CTE plus BLL-gruppen (Fig. 8Ai och 8Bi).
Företagsnyheter Cistanche tubulosa
