Abstrakt:Fytokemisk undersökning av frön av egyptisk mandarin (Citrus reticulata Blanco, F. Rutaceae) gav tretton kända föreningar, 1–13. Strukturerna för isolerade föreningar tilldelades med 1D och 2D NMR och HRESIMS-analyser. För att karakterisera den farmakologiska aktiviteten av dessa föreningar användes flera integrerade virtuella screening-baserade och molekylär dynamiksimuleringsbaserade experiment. Som ett resultat identifierades föreningarna 2, 3 och 5 förmodat som hyaluronidas-, xantinoxidas- och tyrosinashämmare. Den efterföljande in vitro-testningen gjordes för att validera de in silikonbaserade experimenten för att belysa potentialen hos dessa flavonoider som lovande hyaluronidas-, xantinoxidas- och tyrosinashämmare med IC50-värden som sträcker sig från 6,39 ± 0,36 µM till µ237. . Den aktuella studien belyser potentialen hos egyptisk mandarinapelsin avfallsprodukt (dvs. dess frön) som ett naturligt hudhälsofrämjande medel. Dessutom avslöjade den användbarheten av integrerad invers dockningsbaserad virtuell screening och MDS-baserade experiment för att effektivt förutsäga den biologiska potentialen hos naturliga produkter.

Glykosid av cistanche kan också öka aktiviteten av SOD i hjärt- och levervävnader och avsevärt minska innehållet av lipofuscin och MDA i varje vävnad, effektivt rensa upp olika reaktiva syreradikaler (OH-, H₂O₂, etc.) och skydda mot DNA-skador orsakade av OH-radikaler. Cistanche-fenyletanoidglykosider har en stark rensande förmåga av fria radikaler, en högre reducerande förmåga än vitamin C, förbättrar aktiviteten av SOD i spermiesuspension, minskar innehållet av MDA och har en viss skyddande effekt på spermiemembranfunktionen. Cistanche-polysackarider kan öka aktiviteten av SOD och GSH-Px i erytrocyter och lungvävnader hos experimentellt åldrande möss orsakade av D-galaktos, samt minska innehållet av MDA och kollagen i lungor och plasma, och öka innehållet av elastin, har en bra rensande effekt på DPPH, förlänger hypoxitiden hos åldrande möss, förbättrar aktiviteten av SOD i serum och fördröjer den fysiologiska degenereringen av lungor hos experimentellt åldrande möss. Med cellulär morfologisk degeneration har experiment visat att Cistanche har den goda antioxidantförmågan och har potential att vara ett läkemedel för att förebygga och behandla åldrande hudsjukdomar. Samtidigt har echinacoside i Cistanche en betydande förmåga att avlägsna DPPH-fria radikaler och har förmågan att avlägsna reaktiva syrearter och förhindra friradikal-inducerad kollagennedbrytning, och har även en god reparationseffekt på anjonskada av tymin-fria radikaler.

Klicka på Cistanche Tablets Benefits

【För mer information: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

1. Introduktion

Mandariner, C. reticulata, är några av de mest anmärkningsvärda citrusgrödorna för färsk användning [1]. De introduceras ofta som 'tangeriner;' men "Mandarin" är det mer populära namnet. Flera hybrider och sorter av mandarinarter finns utspridda i naturen [1]. De mest kända, sofistikerade arterna består av C. unshiu Marcovitch, C. nobilis Loureiro, C. deliciosa Tenore och C. reticulata Blanco [1,2]. Mandariner är bland de viktigaste citrusfrukterna som skördas i många länder. Även om grödorna huvudsakligen används till efterrätt, har de en betydande kommersiell betydelse på grund av deras eteriska oljor [3]. Citrusaromer används i drycker, konfektyr, kakor och desserter [4]. C. reticulata peeling används också för aromer av sprit [4].

Invers dockning är en typ av virtuell screeningmetod som kan manipuleras för att förutse de potentiella molekylära målen för en given sammansättningsstruktur. Tidigare har vi använt denna effektiva virtuella screeningsmetod för att bestämma de bästa proteinmålen för flera isolerade naturliga produkter [5]. Dock ger dockningspoängen som resulterade från detta preliminära screeningssteg bara viss information om den strukturella komplementariteten mellan proteinmålen och frågeföreningsstrukturen [6]. Följaktligen ger experiment med molekylär dynamiksimulering (MDS), inklusive absolut bindningsfri energi (∆Gbinding), mer rigorösa och pålitliga resultat som kan väljas för in vitro-testning. Häri utsatte vi C. reticulata-frön för en stegvis kromatografisk isolering för att få en uppfattning om den viktigaste fytokemikalien i denna avfallsprodukt. Därefter undersökte vi om dessa fytokemikalier har vissa farmakologiska effekter genom att utsätta dem för en stegvis kiselbaserad analys som initierades av en omfattande omvänd dockning och avslutades med flera MDS-experiment. Potentialen hos de bioaktiva fytokemikalierna som härrör från C. reticulata-frön belyser den höga kapaciteten hos ätbara frukters restprodukter som en enorm reservoar för hälsofrämjande medel.

2. Material och metoder

2.1. Växtmaterial

C. reticulata-frukter samlades in i januari 2021 från en lokal region i Beni-Suef, Egypten, och autentiserades av en senior botaniker, Prof. Dr. Abd El-Halim A. Mohammed Institutionen för flora- och fytotaxonomisk forskning; Trädgårdsforskningsinstitutet; Dokki; Kairo; Egypten). Ett exemplar av frukterna förvarades under verifikationsnummer 2021-BuPD 80 på farmakognosiavdelningen; School of Pharmacy; Universitetet i Beni-Suef; Egypten).

2.2. Kemikalier och reagenser

Etylacetat (EtOAc), metanol (MeOH), n-hexan (n-Hex), etanol (EtOH), diklormetan (DCM) och n-butanol (n-BuOH) förvärvades från El-Nasr Company, Egypten. Sigma Aldrich, Saint Louis, MO, USA, tillhandahöll deutererade lösningsmedel för NMR-analys samt lösningsmedel med hög renhet för HPLC, spektroskopiska och kromatografiska analyser (t.ex. metanol-d4 (CD3OD), dimetylsulfoxid-d6 (DMSO), kloroform -d (CDCI3), metanol för HPLC, vatten av HPLC-kvalitet och acetonitril av HPLC-kvalitet). För kromatografisk isolering, Sephadex LH20 (0.25–0,1 mm, GE Healthcare, Sigma-Aldrich; CA, USA) och kiselgel (E-Merck, Sigma-Aldrich, CA, USA) var använda. För vakuumvätskekromatografi användes en silikagel för TLC (Pharmaceuticals and Chemicals; El-Nasr Company; Kairo, Egypten) (VLC). Förbelagd silikagel (E-Merck, Darmstadt, Tyskland) användes för TLC-studier. Producerade fläckar identifierades av paraanisaldehyd efter upphettning vid 110 ◦C [7]. Allt material för biologiska undersökningar kom från Sigma Chemical Company (SCC; CA, USA).

2.3. Spektralanalyser

NMR-signaler erhölls vid 400 för IH-NMR och 100 MHz för 13C-NMR. CDCl3-d, CD3OD-d4 och DMSO-d6 lösningsmedelstopparna användes som referenssignaler. NMR-signalen erhölls med användning av en NMR-maskin Bruker Advance-III 400 MHz (Bruker AG-Billerica, Kalifornien, MA, USA).

Högupplösta massdata samlades in med hjälp av en Acquity-Ultra-Performance-LiquidChromatography-maskin kopplad till en Quadrupole-Time-of-Flight-Hybrid-Mass-Spectrometer (Waters, Milford, MA, USA). En Agilent/1260-Infinity-preparative-HPLC användes för att uppnå HPLC-kromatografiska separationer.

2.4. Framställning av C. reticulata fröextrakt

C. reticulata frön (1 kilogram) köptes färska och lufttorkades sedan i skuggan. Därefter rivs fröna med en slipmaskin (Henan, Kina). Den pulveriserade produkten extraherades sedan noggrant med 70 procent EtOH (1 L × 5). Det resulterande flytande extraktet koncentrerades med en rotationsindunstare (Buchi-Rotavapor-R-300, ColeParmer, Vernon Hills, IL, USA) under vakuum vid 45 ◦C för att ge 100 g orent torrextrakt, som sedan fördelades med användning av en serie lösningsmedel med ökande polaritet: n-Hex-DCMEtOAc-n-BuOH. Fraktioner I (24,0 g), II (5,0 g), III (3,0 g) och IV (6,0 g) erhölls genom att indunsta den separerade organiska fasen vid minskat tryck. Alla extrakt och fraktioner lagrades vid 4 ◦C för efterföljande fytokemisk och biokemisk analys.

2.5. Isolering av C. reticulata fröns viktigaste naturprodukter 

TLC-kiselgelkolonn användes för att exponera fraktion I (20 g) för normal VLC. EtOAc och n-Hex successiv eluering (0–100 procent, 5 procent ökande) användes. Tre delfraktioner (I1–I3) erhölls genom att samla identiska fraktioner och indunsta dem under reducerat tryck. På en annan silikagelkolonn fraktionerades subfraktion Il (1,0 g) omfattande. Kromatografisk eluering utfördes med n-Hex till EtOAc, gradientblandningar (0–10 procent, 1 procent stigande, 100 ml vardera) för att ge förening 13. (10 mg).

Underfraktion I2 (50 mg) kromatograferades ytterligare på silikagel-60 (100 × 1 cm, 20 g). Det kromatografiska förfarandet gjordes med användning av DCM: MeOH, isokratisk blandning (0,5 procent, 500 ml) för att erbjuda föreningarna 8 (20 mg) och 9 (15 mg). Underfraktion I3 fraktionerades något på silikagel 60 (100 x 1 cm, 20 g). Eluering producerades med användning av DCM: MeOH, isokratisk blandning (0,5 %, 500 ml) för att ge 10 (20 mg).

TLC-kiselgelkolonn användes för att exponera fraktion II (2,5 g). DCM: EtOAc (0–100 procent, en ökning med 5 procent) användes för att eluera proverna. Det producerade avloppsvattnet mottogs i 250 ml delar. Identiska fraktioner erhölls och reducerades till två delfraktioner (II1–II2) vid reducerat tryck. På en annan silikagelkolonn fraktionerades subfraktion Il (1,0 g) omfattande. Förening 5 eluerades med användning av DCM: EtOAc (0–10 procent, 1 procent stigande, 100 ml vardera) (10 mg).

Subfraktion I2 (50 mg) kromatograferades ytterligare på silikagel60 (100 x 1 cm, 20 g). Kromatografisk eluering applicerades med användning av DCM till MeOH (isokratisk eluering; 0,5 %, 500 ml) för att erbjuda föreningarna 11 (20 mg) och 12 (15 mg).

Vid normal VLC separerades fraktion IV (6,0 g) med användning av silikagel. DCM: EtOAc (0–100 procent, 5 procent stigande, 250 ml vardera) användes för att eluera proverna. De kromatografiska utflödena mottogs i steg om 250 ml.

Identiska fraktioner grupperades och reducerades under reducerat tryck för att ge fem subfraktioner (IV1–V5); underfraktionerna IV1, IV2, IV3 och IV4 kromatograferades endast något på en Sephadex-LH20-kolonn eluerad med MeOH för att ge 4 (30 mg), 6 (50 mg), 7 (70 mg) och 1 (15 mg, medan subfraktion IV5 var signifikant pur (10 mg).

2.6. I Silico Study

2.6.1. Omvänd dockning

De troliga molekylära målen för de separerade flavonoiderna avslutades genom att utsätta deras strukturer för en virtuell screening beroende på omvänd dockning mot nästan alla proteiner som delas ut i Protein-Data-Banken; PDB.

Den onlinebaserade IdTarget-plattformen användes för detta steg. Detta ynka screeningprogram för virtuell struktur använder en speciell omvänd dockningsmetod, nämligen DivideConquer-Docking, som konstruerar begränsade överlappande nätverk, vilket gör proteinets utforskning mer begränsad. Som ett resultat kan den utföra ett stort antal dockningar på kort tid [8]. Resultaten beskrevs som en lista över betyg som sträckte sig från de sämsta till de bästa. För att identifiera de optimala proteinmålen för varje given struktur använde vi en affinitetspoäng på -10 kcal/mol som ett gränsvärde (tabell 1).

Molecular dynamics simulation (MDS) experiment utfördes som tidigare rapporterats av Alhadrami et al. 2021 [6]. MDS-maskinen för Maestro-programvaran (dvs. Desmond v. 2.2; Hamburg, Tyskland) användes för att driva MDS-experiment [9-11]. OPLS-Force-Field användes för simuleringskörningar.

Beredningen av proteinstrukturer utfördes av System-Builder-algoritmen, i vilken de packades inuti en ortorombisk vattenlåda (20 Å3) med användning av TIP3P-vattenmodellen tillsammans med Na plus och Cl−joner, {{ 16}}.15 M för var och en av dem. Sedan utsattes de optimerade modellerade strukturerna för en preliminär ekvilibrering under 10 ns. Ligandstrukturer parametriserades automatiskt under strukturförberedelsesteget enligt OPLSForce-fältet. Metallinnehållande proteiner som MMPs som involverar histidin-Zn plus 2-komplex i det effektiva stället bör parametriseras under proteinbildningssteget. För att fortsätta bör ett heterotillstånd ställas in för heteroatomer som Zn (Generera heterotillstånd). Denna funktion är en del av maestros guide för proteinbildning. Detta steg kommer att underlätta utvecklingen av ett korrekt heterotillstånd eller koordinatkovalent tillstånd, för heteroatomen (dvs Zn plus 2) i ett nätverk med proteinet så att kraftfält som OPLS snabbt kan observera zinkatomen. För reproduktioner gjorda av Nano-scale Molecular Dynamics-mjukvara (NAMD 3.0) [12] bestämdes topologierna och parametrarna för modellerade strukturer av onlineplattformen Ligand Reader and Modeler. Harmoniska Tcl-krafter användes för att hålla Zn plus 2 på plats.

Beräkningen av bindningsfri energi (∆Gbindning) utfördes som tidigare beskrivits av Alhadrami et al. 2021 [6]. ∆Slipning utfördes med förfarandet för fri energistörning (FEP) [12], som beskrivs i Kim et al:s publikation. I ett nötskal beräknar denna teknik den nödvändiga tillgängliga energin ∆Gbindning med hjälp av ekvationen ∆Gbindning=∆GComplex − ∆GLigand. Värdet för varje ∆Grinding beräknas med hjälp av NAMD-programmet i separata experiment.

Alla indatafiler kan förberedas via webbplatsen CharmmGUI. Filerna användes sedan för att producera de planerade ∆Gbindande beräkningarna med användning av FEP-protokollet i NAMD. Jämvikten sattes senare i NPT (300 K, 1 atm, Langevin-Piston-Pressure "Complex"-"Ligand") i förekomsten av TIP3P-vattenmodellen. Senare producerades 10 ns FEP-simuleringar för varje struktur, och de sista 5 ns av de tillgängliga energimängderna beräknades för de färdiga fria energihastigheterna [12]. I slutändan förutsågs och utvärderades de bindande poserna genom att använda VMD-programmet [13].

2.7. In vitro analys av hyaluronidasaktivitet

Aktiviteten av hyaluronidashämmande bildades enligt det tidigare etablerade förfarandet som beviljats ​​Chaiyana et al. 2019 [14]. Den hämmande effekten mot hyaluronidasaktivitet uppskattades från följande ekvation: hyaluronidashämning ( procent )=(1 − A/B) × 100, där A och B är hyaluronsyrakaraktären efter behandling i existens eller avsaknad av provet, separat. Som en positiv kontroll applicerades 6-O-palmitoyl-laskorbinsyra. Experimentet utfördes i tre exemplar.

2.8. In vitro-analys av xantinoxidasaktivitet

Xantinoxidas (XO)-hämmande potential utfördes enligt den tidigare beskrivna metoden [15]. Färgen som producerades på grund av väteperoxidfrisättning under processen för oxidation av XO mättes vid 570 nm med användning av plattläsaren EPOCH™ "MICROPLATE READER (BIOTEK)". Fyrtiofyra mikroliter xantinoxidasbuffert blandades med 2 µL xantinsubstratlösning och 2 µL XO. L-mimosin applicerades som en positiv kontroll. Detta experiment utfördes i tre exemplar.

2.9. In vitro analys av tyrosinasaktivitet

Aktiviteten av tyrosinashämmande för varje flavonoid observerades med användning av DOPAchrome-processen i enlighet med ett schema enligt Momtaz et al. 2008 [16], som modifierades från Nerya et al. 2003 [17] och Curto et al. 1999 [18]. Den tyrosinashämmande aktiviteten mättes från följande ekvation: inhiberande aktivitet (procent)=(1 − A/B) × 100, (9) där A och B är absorbanserna av blandningen i närvaro eller frånvaro av testa flavonoid, respektive. Varje experiment gjordes i tre exemplar.

3. Resultat och diskussion

3.1. Fytokemisk undersökning av C. reticulata frön

Med användning av UV, 1H och DEPT-Q NMR, förutom jämförelse med litteraturen och med några autentiska prover, de kända föreningarna kaempferol 1 [19], kaempferol-40 -O- -Dglucopyranoside 2 [19], kaempferol -7-O- -D-glukopyranosid 3 [19], 2-hydroxigenistein 4 [19], hesperetin 5 [19], 3000 (1000-O- - D-glukopyranosyl)-sackaros 6 [20], 6(1000 -O- -Dfruktofuranosy)-30 (1"-O- -D-glukopyranosyl)-sackaros 7 [20 ], 1-O-elaidoylglycerol 8 [21], 1- O-oleoyl-2-palmitoyl-glycerol 9 [22], 1-O-oleoyl-glycerol 10 [ 21], (E)-3-((4-metylheptyloxi)karbonyl)akrylsyra 11 [23], (E)-3-((6-metylnonyloxi) karbonyl)akrylsyra 12 [23] och -sitosterol 13 [24] (Figur 1) identifierades från det råa etanolextraktet av C. reticulata-frön. Alla identifierade föreningar 11 och 12 separerades häri för första gången från Citrus-släktet ( Figurerna 1 och S1–S28. Det är värt att notera att, till skillnad från de vitt spridda flavanonerna och flavonerna i C. reticulata luftdelar, inklusive frukterna, verkade flavonoler vara den dominerande typen av flavonoider i fröna.

3.2. I Silico Utredning

För att karakterisera den biologiska aktiviteten hos de isolerade föreningarna, utsatte vi dem för en serie in-silikonbaserade analyser. Först fokuserade vi på de isolerade flavonoiderna (1–5) för vårt första virtuella screeningssteg eftersom flavonoider är välkända bioaktiva sekundära växtmetaboliter. Dessutom är de återstående isolerade föreningarna (6–13) vanliga primära metaboliter som sannolikt inte har någon terapeutisk effekt.

Strukturerna av flavonoider 1–5 utsattes för en dockningsbaserad virtuell screening mot nästan alla proteiner som finns i PDB. Onlineplattformen, nämligen idTarget, användes för denna preliminära virtuella screeninguppgift [8]. De återvunna poängen hämtades som en lista från det största negativa värdet till det minsta. Vi satte ett slutgiltigt affinitetspoäng på -10 kcal/mol som ett utskärningsvärde för att peka ut de goda målen för varje isolerad flavonoid (1–5). Flera intressanta molekylära mål befanns vara förmodligen bra mål för dessa relaterade föreningar, inklusive proteinkinaser och syntaser (tabell 1).

Intressant nog rapporterades tre vanliga molekylära mål mellan dessa flavonoider, hyaluronidas, xantinoxidas och tyrosinasenzymer. Dessa enzymer är relaterade till att upprätthålla frisk hud [25-30], och därför identifierade det preliminära virtuella screeningssteget förmodat dessa flavonoider som troliga hudvårdsfrämjande medel.

3.3. Molekylär dynamiksimulering och absolut bindningsfri energiberäkning

För att ytterligare stödja det preliminära dockningsbaserade screeningssteget uppskattade vi de absoluta bindningsfria energierna (∆Gbindning) av föreningarna 1–5 med hyaluronidas, xantinoxidas och tyrosinasenzymer med hjälp av den MDS-beroende metoden, nämligen den fria energistörningsmetoden ( FEP) [26,31].

Som visas i tabell 2 kunde endast föreningarna 2, 3 och 5 uppnå den högsta affiniteten mot hyaluronidas-, xantinoxidas- och tyrosinasenzymer med ∆Grinding-värden som sträckte sig från -8,1 till -9,9 kcal/mol. De återstående föreningarna fick ∆Gbindningsvärden högre än −6 kcal/mol.

Ytterligare 50 ns MDS-experiment utfördes för att undersöka interaktionerna och bindningsstabiliteten hos föreningarna 2, 3 och 5 med hyaluronidas, xantinoxidas och tyrosinasenzym. Såsom visas i figur 2 uppnådde både förening 3 och den samkristalliserade liganden liknande bindningsstabilitet inuti enzymets bindningsställe genom MDS med RMSD på ~2,8 Å från de initiala dockningspositionerna. Förening 2 0 s RMSDs var också som den för förening 3 fram till 28,7 ns när den börjar avvika något högre från förening 3 och den samkristalliserade liganden för att uppnå en genomsnittlig RMSD på 3,8 Å genom MDS. Den sista ögonblicksbilden härledd från MDS för föreningarna 2 och 3 och den samkristalliserade liganden indikerade att TYR-75, ASP-129 och GLU-131 var de vanliga interagerande aminosyraresterna via H- bindning.

När det gäller xantinoxidas uppnådde förening 3 stabil bindning inuti sitt aktiva ställe genom MDS, och registrerade ett genomsnittligt RMSD på 2,6 Å som var konvergent till det för den samkristalliserade inhibitorn (RMSD ~2,4 Å). En sådan stabil bindning av förening 3 berodde uppenbarligen på H-bindningsnätverket som den etablerade med LYS-771, PHE-798, GLU-802, SER-876, ARG{{ 12}}, PHE-911, ARG-912 och THR-1010 (Figur 3).

Slutligen var förening 5 också stabil inuti tyrosinasens aktiva ställe under 50 ns MDS med ett genomsnittligt RMSD-värde på 4,9 Å, vilket var högre än det för den samkristalliserade inhibitorn (RMSD ~3,8 Å). Som visas i den sista MDS-härledda ögonblicksbilden kunde förening 5 interagera med de två Zn2 plus-jonerna på liknande sätt som den samkristalliserade inhibitorn. Dessutom stabiliserades den med flera H-bindningar med LYS-198, GLY-209, TYR-362, ARG-374 och THR-391 (Figur 4) ).

【För mer information: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】