Metaanalys av NAD(P)(H)-kvantifieringsresultat uppvisar variation mellan däggdjursvävnader
Jun 01, 2023
Nikotinamid Adenin Dinukleotid (NAD plus) spelar en viktig roll i energimetabolism och signalvägar som kontrollerar viktiga cellulära funktioner. Deökat intresse för NAD plus metabolismochNAD plus-förstärkande terapierhar förstärkt nödvändigheten av korrekt NAD plus kvantifiering. För att undersöka de publicerade NAD(P)(H)-måtten över däggdjursvävnader utförde vi enmetaanalys av befintliga data. En Ovid MEDLINE-databassökning identifierade artiklar med NAD(P)(H)-kvantifieringsresultat erhållna från däggdjursvävnader publicerade mellan 1961 och 2021. Vi screenade 4890 poster och extraherade kvantitativa data, såväl somkvantifieringsmetoder, preanalytiska förhållanden och ämnesegenskaper. De extraherade fysiologiska NAD(P)(H)-koncentrationerna iolika vävnaderfrån möss, råttor och människor, avslöjade en viktig inter- och intrametodvariation som sträckte sig till nyare publikationer. Detta belyser den relativt dåliga potentialen för korsexperimentella analyser för NAD(P)(H) kvantitativa data och vikten av standardisering för NAD(P)(H) kvantifieringsmetoder ochföranalytiska förfarandenför framtida prekliniska ochkliniska studier.
Klicka här för att få Cistanche antioxidationsegenskaper och anti-aging produkter
Nikotinamidadenindinukleotid spelar en dubbel roll som enreduktion–oxidation (redox)co-enzym, i dess oxiderade (NAD(P) plus ) ochreducerade (NAD(P)H)-former, och som ensamsubstrat (NAD(P) plus ) för enzymer involverade i deacylering1, mono- och poly-ADP-ribosylering2,3, och skapandet av adeninbaserade andra budbärare4–7. Te NAD(P) plus /NAD(P)H-förhållandet är en viktig indikator på det intracellulära redoxtillståndet och spelar en avgörande roll i regleringen av viktiga metaboliska vägar8,9. Till exempel är NAD plus väsentligt för glykolys, tillsammans med trikarboxylsyracykeln (TCA), för att ge reducerande ekvivalenter under genereringen av adenosintrifosfat (ATP), den huvudsakliga energikällan för cellen8,9. När NAD plus är begränsad kan det också regenereras från NADH genom fermentering av pyruvat för att producera laktat i däggdjursceller, och därigenom upprätthålla cellulär redoxbalans25. NAD plus och NADH kan också fosforyleras till NADP respektive NADPH med NAD plus kinaser (NADK)10,11. NADPH är avgörande för reduktiv biosyntes, signaltransduktion, cellulära antioxidantsvar och särskilt glutationreduktion12–14. I cytosolen reduceras NADP plus till NADPH av glukos-6-fosfatdehydrogenas och 6-fosfoglukonatdehydrogenas från pentosfosfatvägen (PPP), bland andra reaktioner13. I mitokondrierna upprätthålls NADPH-produktionen av olika reaktioner, inklusive de som är beroende av nikotinamidnukleotidtranshydrogenas (NNT) och isocitratdehydrogenaser (IDH2) enzymaktivitet15. Som ett resultat har NAD(P)(H)-status visat sig påverka cellsignalering och metabolism, energihomeostas, mitokondriell biogenes, oxidativ stressrespons och DNA-underhåll och reparation16–18. Sedan utvecklingen av åldersrelaterade sjukdomar, såsom fetma19, icke-alkoholisk fettleversjukdom20,21, neurodegeneration22, mitokondriella23 och kardiovaskulära24 sjukdomar, och muskelatrofi eller dystrofi25, har vidare kopplats till förändringar i NAD plus-relaterade metaboliter, tillvägagångssätt. som syftar till att upprätthålla NAD plus homeostas är för närvarande under utredning.
Utöver vanliga redoxövergångar kan NADP plus konsumeras genom att byta ut sin nikotinamidgrupp med nikotinsyra i en reaktion katalyserad av cADPR-syntaser, såsom CD38, för att bilda den andra budbäraren NAADP, som är involverad i kalciummobilisering, hormonutsöndring och immunceller spridning6,7,26. NAD plus kan också konsumeras när det fungerar som ett samsubstrat för att bilda nikotinamid (NAM), som kan användas som ett substrat för att regenerera NAD plus via NAM-räddningsvägen. NAM kan också metyleras för att bilda 1-metyl NAM (meNAM), som kan oxideras ytterligare till nedbrytningsprodukterna N1-metyl-2-pyridon-5-karboxamid (2py) och N1-metyl-4-pyridon-3-karboxamid (4py). I slutändan kan de metylerade kataboliterna avlägsnas från kroppen via urin27,28. NAD plus-poolen kan också reduceras genom konsumtionen av NADP plus via en basutbytesreaktion för bildandet av den andra budbäraren NAADP14. Att upprätthålla poolen av NAD plus kräver därför biosyntes via Preiss-Handler-vägen (som börjar med den vanliga vitamin B3-molekylen niacin (NA; nikotinsyra)), de novo biosyntesvägen (som börjar med aminosyran tryptofan (Trp)) eller regenerering från konvertering av NAM via räddningsvägen till NMN och sedan till NAD plus. Slutligen är räddningsvägen också viktig för biosyntesen av NAD plus från nikotinamidribosid (NR), en alternativ form av vitamin B3 som finns i livsmedel, efter dess fosforylering av nikotinamidribosidkinas till NMN och sedan omvandling till NAD plus via räddningsvägen .
Att förstå dynamiken i NAD plus-metabolomen har därför blivit avgörande och kräver i slutändan noggrann metabolitkvantifiering för att bättre förstå fusionen av NAD plus-metaboliter under normal fysiologi, eller med sjukdomsprogression eller hälsosamt åldrande. En tydlig bild av dessa förändringar är väsentlig för att koppla förändringar i NAD plus metabolom till nedströms enzymatiska eller redoxreaktioner, som håller nyckeln till förändringar i vävnadsfenotyper. Med tanke på den betydande mängden tidigare rapporterade kvantitativa data om NAD plus metaboliter hos däggdjur, inklusive ett växande antal rapporter hos människor, är det viktigt och lägligt att sammanfatta dessa förändringar under hälsa och sjukdom. Många studier har undersökt komponenter i NAD plus-metabolomen hos gnagare och människor under olika metaboliska tillstånd, åldrar och sjukdomar, men förlitar sig på olika metoder för provberedning eller kvantifiering. Provberedningen är viktig för metaboliter som är involverade i redoxreaktioner på grund av potentiell nedbrytning och interkonversioner under vissa förhållanden29,30. För kvantifiering anses vätskekromatografi kopplad till masspektrometri (LC–MS) och magnetisk resonansspektrometri (MRS) vara känsliga och specifika metoder31–33, medan enzymcykelanalyser är de vanligaste. Kvantitativa LC–MS-metoder kräver en omfattande inkludering av kvalitetskontroller för enskilda metaboliter som mäts och för provernas övergripande matriseffekt, en effekt som förklarar varierande masspektrometriska svar för en given analyt när den mäts i olika lösningar. Utan dessa kontroller är LC–MS i bästa fall semikvantitativ. I denna studie identifierade vi avsevärd variation i NAD(P)(H)-mått över gnagar- och humanstudier, vilket betonade behovet av korrekta metoder för rapportering och standardiserad provbearbetning och analytiska protokoll. Sammantaget behövs jämförbara NAD(P)(H)-datauppsättningar över studier för meningsfull tolkning av befintliga och framtida data inom området NAD plus biologi.
Resultat
Metaanalys av vanliga kvantifieringsmetoder, tillsammans med studerade arter, kön och vävnader.
Historiskt sett förlitade sig tidiga metoder för NAD(P)(H)-kvantifiering på de spektrofotometriska eller fluorometriska egenskaperna hos dessa metaboliter34,35. På senare tid är enzymcyklingsmetoder kopplade till spektrofotometrisk eller fluorometrisk detektion mer vanligt förekommande för att särskilja NAD(P)(H)-koenzymnivåer36–38. Det växande behovet av hög känslighet och upplösning i kvantifieringen av dessa koenzymer, tillsammans med nödvändigheten att mäta andra NAD plus-relaterade metaboliter, ledde till användningen av högpresterande vätskekromatografi (HPLC) och LC–MS-tekniker. Av dessa tillvägagångssätt har LC–MS blivit den föredragna metoden, eftersom masspektrometri kombinerat med vätskekromatografi möjliggör specifik identifiering av eluerade föreningar tillsammans med den extra fördelen att inkludera NAD(P)(H)-isotopmetaboliter som intern spike-in-kvalitet kontroller. Trots sina fördelar jämfört med klassiska spektrofotometriska eller fluorometriska analyser förblir HPLC och LC-MS båda dyra och tidskrävande, vilket förklarar varför enzymcykelanalyser kvarstår i nyare studier.
Med hjälp av ett systematiskt tillvägagångssätt, av de 241 kvalificerade studierna (tilläggsmaterial 2), valdes 205 studier som inkluderade en kvantitativ metaanalys av NAD(P)(H)-koncentrationer i mus-, råtta- och mänskliga vävnader för ytterligare analys. Av dessa studier använde 46,7 procent enzymcykelanalyser, av vilka inkluderade kolorimetrisk (40,9 procent) eller fluorometrisk (5,8 procent) detektion, medan 17,8 procent använde HPLC-metoder (kopplade med UV- eller fluorescensdetektorer) och 13,2 procent använde LC–MS-analyser ( Fig. la). De flesta studier inkluderade inte en detaljerad beskrivning av metabolitextraktionsprocedurerna. Vanligt använda extraktionsförfaranden bestod emellertid av antingen extraktionsbuffertar med eller utan ytaktiva ämnen (Triton®, Tris, Dodecyltrimetylammoniumbromid), eller polära organiska lösningsmedel såsom acetonitril, metanol, etanol eller kloroform. Tidigare studier har visat att enzyminaktivering och optimala pH- och temperaturförhållanden var effektiva för att bevara stabiliteten hos de olika NAD(P)(H)-formerna30,39,40. När de avslöjades bearbetades proverna under lågtemperaturförhållanden och inga redoxtillsatser nämndes i de inkluderade studierna. Redoxreaktioner begränsades av inaktiveringen av enzymerna i proverna före mätningar av NAD(P)(H)-metaboliter, vanligtvis genom utfällning med lösningsmedel som etanol, metanol, acetonitril eller perklorsyra (PCA). Användningen av PCA var dock sällsynt på grund av den syralabila naturen hos de reducerade formerna (dvs. NADH och NADPH), såväl som nödvändigheten av ett ytterligare neutraliseringssteg. Bland studierna som rapporterade användningen av PCA under metabolitextraktionen (5,4 procent), rapporterade 3,7 procent endast NAD(P) plus resultat eller använde en andra icke-sur extraktionsmetod för korrekt NAD(P)H-kvantifiering. Endast 1,7 procent av studierna rapporterade NADH, totalt NAD(H) och/eller NAD plus /NADH resultat med endast PCA-extraktion. Den potentiella biasen från dessa studier kunde inte analyseras på grund av de begränsade data.
Jämförelser av genomsnittliga fysiologiska NAD(P)(H)-nivåer över vävnader för gnagare och människor.
För att hjälpa till att identifiera de förväntade betyda fysiologiska NAD(P)(H)-nivåerna för de mest studerade mus-, rått- och mänskliga vävnaderna, sammanställde vi data från alla kontroll- och vildtypskohorter från var och en av de inkluderade studierna (tilläggsmaterial 2) ). Specifikt registrerade vi de genomsnittliga NAD(P)(H)-nivåerna normaliserade till vävnadsvikt eller, i fallet med blod, volym. Data från studier som normaliserade metabolitnivåer till proteininnehåll inkluderades i vår sammanställda datauppsättning (tilläggsmaterial 2) men användes inte för ytterligare analys med tanke på det låga antalet rapporterade resultat. Dessutom, när det var möjligt, beräknade vi NAD(P) plus /NAD(P)H-förhållandena, som en reflektion av redoxtillståndet, såväl som de totala NAD(P)(H)-nivåerna (NAD(P) plus plus NAD (P)(H)) som är vanliga rapporteringsutdata för NAD(P)(H)-fixar. De extraherade uppgifterna inkluderade också arter, stammar, ålder, kön, kvantifieringsmetod, diet och utfodringsschema, provtyp, provtagningsmetod och tidpunkt för skörd (före eller post mortem).
Metaanalysen av NAD(H)-data identifierade de fysiologiska medelkoncentrationerna för NAD plus och NADH i mus (Fig. 2a,b, Kompletterande Fig. 1a,b) och råtta (Kompletterande Fig. 2a,b) från djur yngre än 14 månader för möss och 18 månader för råttor. Det extraherade området av fysiologiska NAD plus/NADH-kvotvärden och totala NAD(H)-nivåer (NAD plus plus NADH) plottades för möss (fig. 2c, d) och råttor (kompletterande fig. 2c, d). Till skillnad från musstudierna inkluderade de flesta av de rapporterade råttdata inte djurens ålder; vi valde dock att inkludera dessa data förutsatt att studien inte klassificerade deras kohorter som åldrade. Av de mest framträdande studerade vävnaderna visar denna metaanalys att medianvärdet för NAD plus för levern (596 nmol/g, n=26) är högre än alla andra vävnader hos möss, samtidigt som skelettmuskulaturen överraskande nog (162,8 nmol) /g, n=9) uppvisar ett av de lägsta medianvärdena per gram vävnad (Fig. 2a). Dessa resultat kan antingen antyda en minskad effektivitet i NAD plus metabolitextraktion, på grund av muskelns mycket fibrösa natur eller att det finns viktiga skillnader i muskel NAD plus metabolism jämfört med andra mycket metaboliska vävnader, såsom lever och njure.
Trots få kvantitativa åldrandestudier var NAD plus-nivåer från åldrade möss i genomsnitt reducerade i lever, muskler och retinalt pigmenterat epitel (RPE), jämfört med deras unga kohorter, och i jämförelse med medelvärdet av alla studier utförda med möss yngre än 14 månaders ålder (tilläggsbild 3). En metaanalys av NADH och NAD plus/NADH-förhållandet i åldrade djur var inte möjlig med tanke på att endast en av dessa kvantitativa studier utförde dessa mätningar.
Dessa data visar bristen på kvantitativa NAD(H)-data hos åldrande djur.
För data som hämtats från studier med friska människor varierade åldersintervallen mycket mellan studier (från 15 till 92,3 år) och i de flesta fall var data inte stratifierade över dessa åldrar. De vanligast uppmätta mänskliga vävnaderna inkluderade skelettmuskulatur och blodkomponenter, på grund av deras mindre invasiva karaktär av insamling (Fig. 3a–d). Resultat från andra mänskliga vävnader (n= 1–2) visas i tilläggsbild 4. Denna analys visade en median NAD plus koncentration på 44,62 nmol/ml (n=23) i helblod, med liknande NAD plus-koncentrationer rapporterade för röda blodkroppar vid 46,96 nmol/ml (n=7) (Fig. 3a; Kompletterande tabell 1). Men nivåerna av NAD plus i blodplasma var väsentligt lägre med en median på 0.37 nmol/ml (n=8) (Fig. 3a). Medianhalten av NAD plus som hittades i skelettmuskulaturen hos människor var 191,9 (n=4) nmol/g i våta muskelpreparat jämfört med 1713 (n=3) nmol/g i frystorkade preparat, en låg temperatur dehydreringsprocess som sannolikt koncentrerar metaboliter (fig. 3a). I de mer vanligt undersökta vävnaderna för NADH-mätningar var mediannivåerna i mänskliga röda blodkroppar, plasma och frystorkad skelettmuskel 1,75 nmol/ml (n =7), 0,39 nmol/ml (n=8) respektive 136,8 nmol/g (n=6 (fig. 3b). Motsvarande median NAD plus /NADH-förhållanden var 23,65 (n=8), 1,57 (n=7) och 12,7 (n=3) (Fig. 3c). Intressant nog var median NAD plus /NADH-förhållandet för röda blodkroppar (23,65) och frystorkad skelettmuskel (12,7) (Fig. 3c) flera gånger högre än de flesta mus- och råttvävnader (Fig. 2c och Kompletterande Fig. 2c). , vilket indikerar ett starkt oxidativt redoxtillstånd med ett överflöd av tillgängligt NAD plus i dessa mänskliga vävnader. När det gäller muskelvävnad kan detta få konsekvenser när man överväger translationspotentialen hos gnagarstudier som har identifierat fördelarna med att öka NAD plus-nivåerna i muskler. Ett förhöjt NAD plus/NADH-förhållande i muskler kan dock också vara resultatet av fördröjda provfrysningsprocedurer i en klinisk miljö, vilket kan leda till icke-fysiologiska förändringar i provets redoxstatus.
De fysiologiska NADP(H)-nivåerna i gnagarvävnader sammanställdes, med den vanligaste mätningen i levern. Muslever uppvisade ett medianvärde på 124,2 nmol/g NADP plus (n=13) och 140,2 nmol/g NADPH (n=4) (Fig. 4a,b) ), medan råttlever visade en median av 95,11 nmol/g NADP plus (n=10) och 240,7 nmol/g NADPH (n=9) (kompletterande fig. 5a,b). Medianvärdet för NADP plus/NADPH, härlett från studier som mätte båda metaboliterna, var lägre än 1 i de flesta mus- och råttvävnader (Fig. 4c, Kompletterande Fig. 5c). Medianvärdena för totala NADP(H) (NADP plus plus NADPH) i mus- och råttlever var 244,4 (n=3) (fig. 4d) och 342.1 (n=9) (kompletterande fig. 5d) , respektive. Hos människor utfördes de vanligaste mätningarna av NADP(H) i röda blodkroppar som visade en median på 33,2 nmol/ml för NADP plus (n=14) och 22,4 nmol/ml för NADPH (n{{30} }) från icke-matchande studier, med ett median-NADP plus/NADPH-förhållande på 1,27 och en median för total NADP(H) på 52,0 nmol/ml från studier som mätte båda metaboliterna (n=11) (Fig. 4e– h). Totalt sett är mängden tillgänglig data för NADP(H) sparsam hos alla arter vilket leder till lägre tilltro till medianvärdena för varje vävnad.
Analys av bias och variabilitet i NAD(P)(H) kvantifieringsmetoder.
Med tanke på att en majoritet av studierna som ingår i denna metaanalys undersökte NAD plus-nivåer i leverprover från gnagare (fig. 1c, e), använde vi både mus- och råttleverfysiologiska NAD plus-nivåer för att identifiera eventuella fördomar i resultaten som motsvarar till kvantifieringsmetoden (fig. 5a,b). Medelåldern på mössen som ingick i denna analys var 17,9 veckor (intervall: 2–55 veckor), med 6 studier som inte avslöjade djurens ålder. För råttor avslöjade de flesta studier inte djurens ålder förutom tre som sträckte sig från 2 dagar till 8 månader. Ingen av studierna rapporterade användning av gamla djur. I muslever sträckte sig det stora intervallet av de rapporterade koncentrationerna för NAD plus från 1,8 till 1132 nmol/g av levern med ett medelvärde på 596.0 (n=26) (Fig. 5a) , medan NADH-koncentrationerna varierade från 0,9 till 109 nmol/g vävnad med ett medelvärde på 66,43 (n=6) (kompletterande fig. 6a). Viktigt är att en variationskoefficient på 52,5 procent och 76,5 procent beräknades för de genomsnittliga fysiologiska NAD plus- och NADH-resultaten i muslever, mätt med flera kvantifieringsmetoder, vilket visar omfattningen av variationen mellan studier. Som förutspåtts från dessa resultat, visade medelvärdet av NAD plus /NADH-förhållandet i muslever (3,41 plus /− 3,16 SD, n=19) ett lika stort variabilitetsområde med en CV på 92,7 procent (kompletterande fig. 6c) . Liknande variationer i NAD plus- och NADH-mått observerades också i råttlever (CV=42,6 procent för NAD plus och CV=44,4 procent för NADH). Motsvarande koncentrationer för NAD plus och NADH i råttlever varierade från 159 till 796 (n=16) respektive 65 till 265 (n=12) nmol/g (fig. 5b, kompletterande fig. 6b) ), medan NAD plus /NADH-förhållandena uppvisade en CV på 50,1 procent (medelvärde: 3,219 plus /− 1,612 SD, n=23) (kompletterande fig. 6d). Medelvärden och standardavvikelser för NAD plus , NADH, total NAD(H) och NAD plus /NADH-kvotdata i mus- och råttlever, grupperade efter kvantifieringsmetod, visas i tilläggstabell 2. Angående NADP(H)-nivåer och NADP plus/NADPH-förhållandet, liknande variabilitet observerades i levervävnader. NADP plus-nivåer varierade från 50,4 till 247,4 nmol/g vävnad för möss (tilläggsbild 8a) och från 45,7 till 171 nmol/g vävnad för råttor (tilläggsbild 8b), medan NADPH-nivåer varierade från 28 till 236,9 nmol/g vävnad för möss (kompletterande fig. 8c) och från 90 till 409 nmol/g vävnad för råttor (kompletterande fig. 8d). Slutligen varierade NADP plus/NADPH-förhållandet från 0,12 till 0,55 i muslever (tilläggsbild 8e) och från 0,12 till 1,44 i råttlever (tilläggsbild 8f).
i det största intervallet av resultat (1,8 till 1132,3 nmol/g). Även de senaste LC–MS-studierna som undersöktes exemplifierade intervallet för dessa NAD plus-värden, inklusive värden på 1,8 nmol/g41 och 33,8 nmol/g42 och mycket högre värden på 946,3 nmol/g43 och 1132,3 nmol/g44. Dessutom verkade det stora intervallet av LC–MS NAD plus-värden inte korrelera med studier som uteslöt isotopmärkta interna standarder (Fig. 5a), en metod som används för att förbättra identifieringen av metaboliten och noggrannheten av det kvantifierade värdet . De två identifierade LC-MS-studierna som enbart förlitade sig på en extern standardkurva för NAD plus kvantifiering, snarare än att inkludera en intern kontroll, var i genomsnitt lägre än medelvärdet för alla åtgärder (Fig. 5a). Vidare använde studierna med normalisering av intern standard olika typer av interna standarder, såsom införandet av en enda märkt referensmetabolit45,46 eller märkta metabolitextrakt från jäst43,44 eller cellkulturer41. Intressant nog gav dessa studier som använde jäst- eller cellkulturextrakt-härledda standarder antingen de högsta eller lägsta LC-MS-härledda måtten för lever NAD plus nivåer. Detta understryker potentiellt hur cellulära extrakt av isotoprika standarder kan bidra till variabiliteten i NAD plus-mätningar eftersom matriseffekten av den tillsatta standardjästen eller cellulära extraktet kan störa joniseringseffektiviteten och följaktligen de uppmätta koncentrationerna av målmetaboliterna.
Begränsningarna för denna analys av kvantifieringsbias och variabilitet inkluderar potentiella skillnader i miljön, genetisk bakgrund, offer, kön och ålder. Alla data för denna analys kom från djur på en chow-diet men kan skilja sig i typ. Vid avlivning finns det rapporterade skillnader i djurets utfodrade eller fastande tillstånd och tidpunkten på dagen för avlivning. Dessutom, även om de flesta musstudier utfördes på en C57BL/6-bakgrund, fanns det ett större urval av bakgrunder som användes för råttor över studier (Wistar: 38 procent, Albino Wistar: 25 procent och 6 procent för Hooded Wistar, Sprague–Dawley, Holtzman, ACI, Long-Evans och Zucker-råttor). I musleverstudier fanns det inga statistiska skillnader mellan manliga eller kvinnliga värden för NAD plus, NADH eller totala NAD(H)-nivåer eller för NAD plus/NADH-förhållandet (kompletterande fig. 7). Vi kan dock inte dra några slutsatser på grund av det begränsade antalet kvinnliga kohorter.
Fråga för mer:
E-post:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950
