Metaanalys av NAD(P)(H)-kvantifieringsresultat uppvisar variation mellan däggdjursvävnader Ⅱ

Effekten av vävnadsinsamling före mort kontra obduktion på NAD(P)(H)-nivåer.

Vi förutspådde att det kan finnas någon observerbar skillnad i NAD(P)(H) redoxtillstånd som är beroende av vävnadsskördningsprocedurer. För att svara på denna fråga undersökte vi effekten av vävnadsinsamlingsprocedurer före och efter slakt på NAD(P)(H) redoxstatus. För denna analys jämförde vi värden från råttlevervävnader med tanke på det större antalet studier som definierar deras offerprotokoll. När de avslöjades, angav alla granskade studier att vävnadsproverna hölls kalla och omedelbart extraherades på is eller frystes vid -80 grader före NAD(P)(H)-mätningar. Denna analys fastställde att det inte fanns någon signifikant skillnad i NAD plus koncentrationer i råttlever (Fig. 6a) mellan vävnader extraherade före eller efter dödshjälp. De rapporterade NADH-nivåerna i råttlever är dock signifikant högre i obduktionsprover (Fig. 6b). Inga skillnader i totala NAD(H)-nivåer (Fig. 6c) observerades men NAD plus/NADH-förhållandet var lägre i vävnader som samlats in efter dödshjälp (Fig. 6d), vilket överensstämmer med variationen i NADH-nivåer. NADP plus, NADPH och NADP plus/NADPH-förhållandet resulterar i råttlever grupperade efter tidpunkt för vävnadsskörd visas i tilläggsfigur 9; Det otillräckliga antalet obduktionsprov tillåter oss dock inte att tolka effekten av tidpunkten för vävnadsskörd på NADP(H)-nivåer. I muslever fanns det ingen skillnad mellan NAD plus-nivåer före och efter slakt, men antalet rapporterande studier var begränsande (Fig. 6e). NejNADH,NADP plus, ellerNADPHobduktionsdata imusleverfanns att jämföra.

Klicka här för att få Hebrs Cistanche

Diskussion

Många nyare studier har visat att NAD(P)(H)-reglering är avgörande för cellulär homeostas och redoxstatus. Data erhållna från gnagare har lett till studier som undersöker NAD plus-nivåer i humant blod, som en mindre invasiv indikator på NAD plus-nivåer i hela kroppen. Nyligen genomförda kliniska studier visade att NAD plus-nivåer reducerades i sjukdomstillstånd23,47 och förhöjda efter NAD plus boostingstrategier23,44,48,49. Vi utförde en metaanalys av alla studier publicerade mellan 1946 och 20 juni 2021, som innehöll kvantitativa data för NAD(P)(H)-nivåer hos däggdjursarter med särskilt fokus på möss, råttor och människor eftersom de representerar de mest studerade arter inom det biomedicinska området. Denna analys gjordes delvis för att bestämma den genomsnittliga standardnivån för NAD(P)(H)-koncentrationer i normala däggdjursvävnader givet den välkända variansen i dessa mått över studier. Vi hoppas att dessa data kan användas för att stimulera standardiserade protokoll inom området NAD plus forskning och för att främja användningen av NAD(P)(H)-nivåer och redoxkvoter som tillförlitliga biomarkörer för sjukdoms- och behandlingsregimer.

Trots avsevärd variation i mått mellan gnagarvävnader visade denna metaanalys liknande genomsnittliga NAD plus-nivåer över vävnader med några undantag. Intressant nog uppvisade musskelettmuskler lägre medianhalter av NAD plus (Fig. 2a) än andra mycket metaboliska vävnader (dvs lever, njure, hjärta och hjärna). Detta kan indikera olika NAD(H) redoxstatus i skelettmuskulaturen eller kan peka på större problem med metabolitextraktion i fibrösa vävnader. Dessa observationer kunde dock inte verifieras hos människor på grund av brist på provtagna vävnader bortom blod och muskler.

Det finns många potentiella faktorer som kan påverka noggrannheten av fysiologiska NAD(P)(H)-mätningar i vävnadsprover. När de rapporterades beskrev alla studier vävnader som skördade och direkt nedsänkta i flytande kväve, eller hölls på is före frysning eller bearbetning för att bevara de värmekänsliga fraktionerna (NAD plus och NADP plus). Effekten av pH på de olika NAD(P)(H)-fraktionerna, såsom den syralabila naturen hos de reducerade NAD(P)H-formerna, har lett till användningen av pH-neutrala extraktionslösningsmedel i majoriteten av studierna . Men med tanke på den snabba omvandlingen av de reducerade och oxiderade metaboliterna och effekten av anoxi på NAD(H)50–53, är det också viktigt att säkerställa snabb extraktion av vävnadsmetaboliter och lämpliga procedurer för att släcka cellulär NAD(P)(H) )-redox/konsumtionsenzymer, såsom genom deproteinisering. I enlighet med dessa linjer indikerar vår analys av vävnadsinsamling före och efter slakt att analys efter slakt gynnar minskningen av NAD plus. Minskningen av vävnads-NAD plus har tidigare beskrivits in vivo i hjärnan, hjärtat och levern hos råttor som exponerats för en förlängd 2.{10}}h hypoxisk atmosfär54, en miljö som delvis kan recapituleras av långa perioder av post- offra vävnadsinsamling innan snäppfrysning. Detta kan indikera att extrahering av vävnader under narkos eller prioritering av den omedelbara skörden av vävnader som är avsedda att användas för metabolitanalys efter avlivning, bör ske för att få representativa NAD(P)(H)-mätningar.

Det finns också potential för olika kvantifieringsmetoder, som var och en har olika begränsningar, för att bidra till den övergripande variabiliteten inom studien av NAD(P)(H)-mätningar. Under de senaste två decennierna var de mest använda metoderna enzymcykelanalyser, LC–MS och HPLC. Var och en av dessa metoder påverkas av metabolitextraktionstekniker, kvantifieringsparametrar och genomförandet av korrekta kvalitetskontroller. Genom att använda LC–MS, Lu et al. har visat att omvandlingen mellan reducerade och oxiderade former av NAD(P)(H)-metaboliter sker i olika hastigheter i olika extraktionsbuffertar eller lösningsmedel med acetonitril:metanol:vatten med 0.1 M myrsyrablandning som ger högsta återhämtningen med minst interkonverteringar31. Men när man använder LC–MS kan denna interkonvertering övervakas mellan enskilda prover av en studie genom att spika med interna kontroller som NAD(P)(H)-isotoper, vilket är en fördel med LC–MS-tekniken jämfört med HPLC och enzym cykelanalyser31,33,55. Ändå, även med välkontrollerade LC–MS-tekniker, kan olika faktorer störa den uppmätta signalen, inklusive matriseffekter och variationer i joniseringseffektivitet. Till exempel använder vissa studier 13C-märkta jästextrakt som interna standarder i LC-MS-baserad metabolomik. Att spetsa den extraherade provets metabolitmatris med en 13C-märkt jästextraktmetabolitmatris kan dock få olika konsekvenser, såsom jonundertryckning, vilket minskar signalen från märkta och/eller omärkta metaboliter, och kan leda till fel i den absoluta kvantifieringen om inte. upptäckts genom en noggrann kvalitetsbedömning56. Även om LC-MS-tekniker teoretiskt tillåter mätning av flera NAD(P)(H)-metaboliter i ett experiment, finns det fortfarande begränsningar eftersom optimala utspädningar måste köras om metaboliterna av intresse har stora skillnader i koncentrationer. Trots deras fördelar jämfört med de enklare enzymcykelanalyserna, kräver komplexiteten hos LC-MS-metoder nödvändigheten av grundlig optimering. Nyligen har nya analytiska metoder, såsom NAD plus biosensorer och bildbaserad masspektrometri, utvecklats men det finns fortfarande otillräcklig kvantitativ data genererad från dessa tekniker för att inkluderas i en metaanalys. Även om en studie inkluderad i vår metaanalys använde en pappersbaserad bioluminescerande biosensor för att mäta NAD plus-nivåer i muslever och andra provtyper57. Denna studie inkluderades i gruppen för bioluminescensanalyser på grund av den liknande detektionsmetoden (Fig. 1a).

Metoder

Dataextraktion.

Numeriska data för NAD(P)(H)-metaboliter erhölls antingen direkt från artiklarna eller extraherades från artikelfigurer med hjälp av en semi-automatisk dataextraktionsmjukvara (WebPlotDigitizer58). Dessutom, där så är tillämpligt, registrerades vävnadsprovtagningstidpunkterna i förhållande till offer och/eller vävnads-/blodprovsmetoder (dvs. metod för anestesi och/eller dödshjälp, vävnadshantering och lagringstemperatur). För djurmodeller registrerades arten, egenskaperna (t.ex. stam, genotyp, ålder och vikt) och miljöförhållanden (t.ex. sömncykel, typ av diet, matningsfrekvens och utfodringstillstånd i förhållande till vävnadsprovtagning). Dessutom, för alla studier, extraherades behandlingar (t.ex. farmakologiska behandlingar, operationer, bestrålning, tumörinduktion och andra förfaranden som tillämpas på försökspersonerna) och all studiegruppsinformation (t.ex. behandlings- eller sjukdomsgrupper och motsvarande kontroller). Slutligen, metoden för NAD(P)(H) kvantifieringsmetod (t.ex. enzymatiska analyser, masspektrometribaserade, HPLC, NMR, bioluminescens) och publikationsspecifikationer (dvs publikationstitel, referenskod [DOI, Medline UI, PMID] eller hyperlänk och utgivningsår) noterades (tilläggsmaterial 2).

Dataanalys. Före analys omvandlades alla koncentrationer till nmol/g vävnad eller nmol/g proteiner för vävnadsprover eller nmol/ml för blodfraktioner. På grund av det låga antalet resultat normaliserade till proteininnehåll visar vi endast resultat normaliserade till vävnadsvikt och blodvolym. Statistisk analys utfördes med GraphPad Prism version 9.3.1 (GraphPad Sofware Inc., San Diego, Kalifornien, USA,DatatillgänglighetAll data extraherad och analyserad under denna studie ingår i denna publicerade artikel och dess tillägginformation fles.Mottaget: 29 april 2022; Godkänd: 7 februari 2023

Referenser

10. Love, NR et al. NAD-kinas kontrollerar djurs NADP-biosyntes och moduleras via evolutionärt divergerande kalmodulinberoende mekanismer. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 1386–1391 (2015).

Fråga för mer:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950