Biokemiska och histopatologiska svar från Biomphalaria Alexandrina på RIPEX (växttillväxtregulator)Ⅱ

3. Resultat

3.1 RIPEX-toxicitet

Toxicitetsresultaten för RIPEX mot Biomphalaria alexandrina efter 1 dag indikerade att värdena för LC50 och LC90 var 39,9 5 respektive 73,6 µL/L. De subletala koncentrationerna av LC10 och LC20 var 8 respektive 16 µL/L (tabell 1 och fig. 1).

3.2 Effekt av RIPEX på markörerna för oxidativ stress

Exponeringen för RIPEX påverkade aktiviteterna av SOD och GST och nivåerna av MDA i matsmältningskörteln hos B. Alexandrina (tabell 2). Sniglar exponerade för RIPEX vid 8 µL/L visade en obetydlig ökning (p=0.6) i aktiviteten hos SOD jämfört med kontrollsniglarna. B. alexandrina-sniglar exponerade för 16 µL/L under 7 dagar uppvisade dock en signifikant minskning av SOD-aktivitet (p=0.05). GST-aktiviteten ökade signifikant (p Mindre än eller lika med 0,001) efter exponering för båda koncentrationerna. Den högsta ökningen noterades hos sniglar exponerade för 16 µL/L under 1 dag (39,7±3,2 U/mg) och det högsta värdet vid koncentrationen 8 µL/L var (33,7±1,7 U/mg) efter 7 dagar, jämfört med kontrollerna vid 17,1±3,6 U/mg (efter 1 dag) och 22,6±1,3 U/mg (efter 7 dagar).

Klicka för att hitta beneficios för testosteron

Beroende på tidsintervall orsakade exponering under 7 dagar en signifikant ökning (p=0.0{{20}}3). Exponeringen för olika koncentrationer av RIPEX orsakade en signifikant ökning (p Mindre än eller lika med 0,04) i nivåerna av MDA. Koncentrationen på 8 µL/L ökade MDA-nivån (45,06±4,1) jämfört med kontrollen (16,4±2,1). Beroende på exponeringstidpunkten var MDA-nivåerna 45,06±4,1 och 56,1±0,7 nmol/g vid koncentrationerna, 8 respektive 16 µL/L, jämfört med 13,5±0,7 nmol/g för kontrollen (tabell 2).

3.3 Effekt av RIPEX på aktiviteten av steroidhormoner

Exponering för 16 µL/L orsakade en signifikant ökning av testosteronkoncentrationen (52,6±2,5 nmol/L) (p=0.002) jämfört med kontroll (34,6±2,3 nmol/L). Medan koncentrationen på 8 µL/L RIPEX orsakade en signifikant ökning (p=0.005) i testosteron efter 3 dagars exponering jämfört med 16 µL/L. Beroende på tidsintervallen finns det ingen betydelse förutom den signifikanta minskningen av testosteronkoncentrationen som inträffade vid de 7 dagar (19,6±2 nmol/L) av exponering (p=0.003) jämfört med 3 dagar (47,3± 6 nmol/L). När det gäller östradiol var det en signifikant ökning (p=0.003) i hormonkoncentrationen efter 3 dagars exponering för 16 µl/L (73,6±3,5 pg/ml jämfört med kontrollen (43,3 pg/ml) och 7 dagars exponering för 8 µL/L (56,3±1,5 pg/ml jämfört med kontrollen (50,3±5,6 pg/ml) (Fig. 2, b).

3.4 Effekt av RIPEX på immunpotentiella enzymer

Exponeringen av B. Alexandrina för två koncentrationer av RIPEX orsakade en signifikant ökning av aktiviteten av MPO-enzymet (fig. 3a) beroende på exponeringstidpunkten efter 3 dagar (p=0.0{ {35}}4) och 7 dagar (p=0.01). Exponering för 8 µL/L RIPEX ökade signifikant aktiviteten av MPO (55,3±4,8 mU/mg protein (p=0.004) jämfört med 15,4±1,2 mU/mg för kontrollen. Medan 16 µL/L exponerades aktiviteten för sniglar var (53,03±2,3 mU/mg protein och 73,9±2,8 mU/mg protein, p Mindre än eller lika med 0,05). Koncentrationen på 16 µL/L orsakade också en signifikant ökning (p=0 0,05) i aktiviteten jämfört med 8 µL Båda koncentrationerna (8 och 16 µL/L) ökade signifikant (p Mindre än eller lika med 0,009) aktiviteten av ADA jämfört med kontrollen (fig. 3b) vid alla tidpunkter poäng. Ökningen av aktiviteten vid 16 µL/L koncentration. Beroende på tidsintervallen registrerade exponeringen under 7 dagar en signifikant ökning jämfört med 1 dag och 3 dagar (p Mindre än eller lika med 0,05). aktivitet vid 7 dagar var 27,03±14 och 74,3±1,9 U/mg protein

3.5 Differentiellt antal hemocyter

Undersökning av hemolymfprover från B. alexandrina sniglar indikerade tre morfologiskt distinkta typer av hemocyter; hyalinocyter, runda små och spridande hemocyter. Hyalinocyter kännetecknas av deras cirkulära form, klara, täta cellmembran och stora förhållande mellan kärna och cytoplasma. Det representeras av ett högt antal i kontroll (56,3±0,5, 1 dag). Små runda celler är mellanliggande celler med få cytoplasmatiska granuler och ingen pseudopodi. Spridande hemocyter har olika storlekar, med en liten kärna och stora cytoplasmatiska granuler. De är fagocytiska celler eftersom de kan bilda få och kortspridande pseudopodier. Exponeringen för de två koncentrationerna av RIPEX ökade hemocytantalet, och en signifikant ökning observerades i granulocyterna hos sniglar exponerade för 8 µL/L (p=0.02) och 16 µL/L (p{{12) }}.006) under 1, 3 och 7 dagar jämfört med kontrollen. (Tabell 3). Behandlingen orsakade vissa morfologiska abnormiteter i hemocyter såsom hyalinocyter med filopodial förlängning, deformerade granulocyter med vakuoler och spridande filopodia (fig. 4).

3.6 Effekt av RIPEX på histopatologin i matsmältningskörtlarna och ovotestis

Matsmältningskörtlarna hos B. Alexandrina är sammansatta av tubuli, och varje tubuli består av ett lager kolumnära epitelceller differentierade till matsmältnings- och sekretoriska celler, som är arrangerade runt en central lumen (Fig. 5a). Tubuli är sammanlänkade av bindväv. RIPEX-exponering orsakade vissa förändringar, såsom degeneration i bindväven. Sniglar exponerade för 8 µL/L visade närvaron av cellulära blåsor, vilket indikerar celldöd och igensättning av lumen. Osmält mat observerades (fig. 5b–d). Sniglar exponerade för 16 µL/L uppvisade degeneration av de fodrade cellerna med vissa patologiska tecken såsom vakuolering och dilatation av lumen. Tubuli blev skadad, deformerad och nekrotisk (fig. 5e, f).

Ovotestis av kontroll B. alexandrina sniglar består av flera acini förenade av bindväv. Varje acinus är fodrad med germinalt epitel som består av olika stadier av spermatogoni och oogoni. De skiljer sig till primära, sekundära och en eller två mogna oocyter (oogonia). Mogna spermier finns i grupper inuti acinus (fig. 6a). Den histologiska strukturen hos ovotestis hos exponerade sniglar förändrades efter 7 dagars exponering för RIPEX. Hos sniglar exponerade för 8 µL/L observerades ett ökande antal spermier, nekrotiska spermier och atrofi. Deformation av manliga eller kvinnliga gametocyter och degenerering av acini var också riklig. Exponeringen för 16 µL/L gjorde också att acini degenererades och nekrosen ökade (Fig. 6b–e).

4. Diskussion

Det finns en omfattande användning av PGR i jordbruksmetoder. Dessa ämnen har många skadliga effekter på levande organismer. Den aktuella studien syftade till att bedöma de toxikologiska effekterna av RIPEX (en organisk fosforbekämpningsmedel som innehåller etefon som innehåller 48 procent etefon som aktiv ingrediens plus 52 procent inerta ingredienser). Toxicitetsanalyser av RIPEX med B. Alexandrina indikerade att 1-dagens LC50- och -LC90-värden var 39,95 respektive 73,6 µl/L.

Dessa resultat stöddes av [54] som visade EC50-värdet för etefon mot Daphnia magna-embryon (125 mg/L efter 48 timmars exponering). Denna bekämpningsmedel verkar giftigare för Biomphalaria än andra formuleringar av organofosforföreningar såsom klorpyrifos (LC50 9.6 mg/L; [30] och profenofos (LC50 1.10 mg/L; [10]) .

En homeostas existerar mellan genereringen av fria syreradikaler och produktionen av antioxidantmolekyler under normala fysiologiska förhållanden [23]. En obalans mellan antioxidant- och oxidantsystemen kallas oxidativ stress [32]. I både eukaryoter och prokaryoter är superoxiddismutas (SOD) och glutation S-transferaser viktiga antioxidantenzymer som kan ta bort för mycket syre från fria radikaler och skydda organismen från oxidativ skada [34, 38].

De deltar också i avgiftningen av flera främlingsfientliga läkemedel [8, 15]. Den aktuella studien visade att exponering av B. alexandrina-sniglar för subletala koncentrationer av RIPEX 48 procent EC störde antioxidantaktiviteten hos de exponerade sniglarna. Akut exponering (24 timmar) tenderar att minska den totala SOD- och GST-aktiviteten hos sniglar, följt av en ökning efter 3 dagars exponering och en kraftig hämning efter 7 dagars exponering.

MDA-nivåerna var signifikant högre hos exponerade sniglar jämfört med kontroller efter alla exponeringsperioder. Dessa resultat tyder på ett tillstånd av oxidativ stress hos sniglar inducerat av RIPEX-exponering. Sniglarna upplevde en plötslig minskning av enzymaktiviteter efter 1 dags exponering och försökte kompensera genom att överproducera enzymer efter 3 dagars exponering. På den 7:e dagen av exponeringen kunde dock sniglar inte övervinna överskottsproduktionen av reaktiva syrearter, vilket manifesteras av ökningen av MDA-nivåer (lipidperoxidation), vilket leder till en hämning av antioxidantenzymproduktionen. MDA är en av de största effekterna av lipidperoxidation och har förmågan att störa jonbytet i cellmembranet, modifiera jonpermeabiliteten och påverka enzymfunktionen [9].

Mekanismen för RIPEX 48 procent EC-inducerad oxidativ stress i Biomphalaria kan skilja sig från andra organofosforbekämpningsmedel. Det orsakade enzymhämning först efter 7 dagars exponering. Men klorpyrifos, till exempel, orsakade en ökning av SOD-aktivitet och en minskning av GST-aktivitet i B. Alexandrina kort efter 1 dags exponering [30]. Testosteron och östradiol spelar en avgörande roll i reproduktionen av B. alexandrina sniglar [20, 45]. Förändringar i dessa hormoner kan användas som en slutpunkt för kemisk toxicitet [14]. RIPEX 48 procent EC orsakade en hormonell störning hos B. alexandrina sniglar.

Sniglar exponerade för 16 µL/L visade en signifikant ökning av testosteron efter 3 dagars exponering. RIPEX minskade dock hormonnivåerna i sniglar exponerade för 8 µL/L efter 1 och 3 dagars exponering. Om östradiol tenderar hormonet att öka i exponerade sniglar. Den mest framträdande ökningen observerades dock hos sniglar exponerade för 16 µL/L efter 3 dagars exponering. RIPEX kan därför ha en hormonstörande effekt på B. alexandrina sniglar. Liknande fynd rapporterades också av Ibrahim och Hussein [30], som rapporterade en signifikant ökning av nivåerna av både testosteron och östradiol efter exponering av B. Alexandrina för subletala koncentrationer av klorpyrifos 48 procent EC. Andra jordbrukskemikalier, såsom herbiciden oxyfluorfen (24 procent EC), reducerade testosteron- och 17-östradiolnivåerna i B. Alexandrina efter två veckors exponering [31]. Myeloperoxidas (MPO), som omvandlar H2O2 till hypoklorsyra (HOCl), ett potent antibiotikum, anses ofta vara hörnstenen i ROS-medierad cytotoxicitet, och det finns starka bevis för att molluskiska hemocyter har MPO-aktivitet jämförbar med den hos däggdjursfagocyter [22 44, 49]. Adenosindeaminas (ADA) spelar en viktig roll i immunsystemet hos ryggrads- och ryggradslösa djur, inklusive Biomphalaria-sniglar [51].

Dess brist är kopplad till kombinerad immunbristsjukdom [25]. Exponering av B. Alexandrina för 8 och 16 µL/L RIPEX orsakade en signifikant ökning av aktiviteterna för MPO- och ADA-enzymer i matsmältningskörtlarna hos sniglar efter 3 och 7 dagars exponering. Ökningen av enzymaktivitet verkar tids- och samordningsberoende. Matsmältningskörtlarna är den primära platsen för metabolismen av kemiska föroreningar i gastropoder [46]. Ökningen av dessa enzymer antyder ett immunologiskt svar från B. Alexandrina på RIPEX-toxicitet eftersom MPO till exempel kan omvandla föroreningar till fria radikaler via enstaka elektronabstraktioner [41], vilket kan resultera i redoxcykliska händelser som producerar oxiradikaler och eventuellt initierar lipidperoxidation [36].

Sniglar förlitar sig främst på cellmedierad cytotoxicitet för att bli av med invaderande föremål [5, 53]. De mest väl studerade försvarscellerna i sniglar är hemocyter. Hemocyter utvecklas från små, rundade, agranulära celler till stora, granulära, spridande celler via mellanliggande faser [6, 53]. Granulära hemocyter fagocyterar mestadels främmande ämnen [28]. Exponeringen för två koncentrationer av RIPEX 48 procent EC ökade antalet hemocyter. Hyalinocyterna uppträdde med vakuoler i prover som tagits från exponerade sniglar. En signifikant ökning noterades i granulocyter, vilket tyder på en ökning av snigelns cellulära immunsvar för att utmana RIPEX-toxicitet. Ibrahim och Hussein [30] visade att exponering av B. Alexandrina för klorpyrifos hade negativa effekter på morfologin och det totala antalet hemocyter hos exponerade sniglar.

Vidare visade ljusmikroskopi att vissa hyalinocyter hade krympta kärnor, ofullständig celldelning och pseudopodibildning. Dessa effekter på hemocytantalet och morfologin hos B. Alexandrina har en negativ inverkan på sniglarnas immunitet, eftersom dessa organismer till stor del är beroende av hemocyter för att skydda dem mot främmande möten. Histopatologiska undersökningar av matsmältningskörtlarna hos B. Alexandrina visade att RIPEX-exponering under 7 dagar orsakade vissa patologiska förändringar såsom degenerering av bindväv, cellulär blåsbildning och degenerering av kantade celler i lumen. Matsmältningsrören blev skadade, deformerade och nekrotiska. Histopatologi är en viktig slutpunkt för att bedöma patologiska förändringar hos vattenlevande djur som exponeras för föroreningar [33].

Den höga känsligheten hos matsmältningskörtlarna tillskrivs direkt till dess roll i homeostas, upptag av föroreningar, matsmältning, metabolism och avgiftningsprocessen [24]. De observerade effekterna kan bero på direkt ackumulering av RIPEX i matsmältningskörtelcellerna eller indirekt via oxidativ skada orsakad av produktion av reaktiva syrearter (ROS). Faktiskt har extrem oxidativ stress kopplats till vävnadsskador som involverar en mängd olika fysiologiska processer och miljövariabler, inklusive nekrotisk och apoptotisk celldöd [19]. Dessutom förändrade exponering för två olika koncentrationer av RIPEX under 7 dagar den histologiska strukturen av ovotestis med en ökning av antalet nekrotiska spermier, atrofi, deformation av manliga eller kvinnliga gametocyter och degeneration av acini. Dessa förändringar kommer sannolikt att minska sniglarnas reproduktionspotential och därmed deras kondition i vattensystemet.

5. Sammanfattning

Subletala koncentrationer av RIPEX 48 procent EC hade en mångfacetterad effekt på Biomphalaria alexandrina sniglar. Hos sniglar minskade kronisk exponering för RIPEX produktionen av antioxidantenzymerna SOD och GST samtidigt som MDA-produktionen ökade, vilket indikerar ett oxidativt stresstillstånd. Dessutom hade det en hormonstörande effekt på sniglar, vilket framgår av en total ökning av steroidhormonnivåerna. Snigelns immunsystem verkar vara sårbart för RIPEX-exponering. Det orsakade en signifikant ökning av aktiviteten av MPO- och ADA-enzymer i snigelmatsmältningskörtlar efter 3 och 7 dagars exponering, såväl som en signifikant ökning av granulocyter i exponerade snigelgrupper. Patologiska avvikelser i exponerade sniglars matsmältningskörtlar och ovotestis var också tecken på histopatologiska förändringar orsakade av RIPEX-exponering. Dessa fynd visar att RIPEX skadar akvatisk fauna, inklusive B. Alexandrina. Tus, Biomphalaria sniglar kan användas som bioindikatorer för miljöföroreningar med växttillväxtregulatorer.

Mekanismen för Cistanche ökar testosteroneffekten

Cistanche har visat sig öka testosteronnivåerna på flera sätt. För det första innehåller den föreningar kända som echinakosid och akteosid, som har visat sig öka produktionen av luteiniserande hormon (LH) i hypofysen. LH stimulerar Leydig-cellerna i testiklarna att producera testosteron. Cistanche innehåller även polysackarider och fenyletanoidglykosider, som har visat sig ha antioxiderande och antiinflammatoriska egenskaper. Detta kan hjälpa till att minska oxidativ stress och inflammation i testiklarna, vilket kan försämra testosteronproduktionen. Dessutom har Cistanche visat sig öka uttrycket av gener som är involverade i testosteronsyntesen och minska aktiviteten hos enzymer som bryter ner testosteron, såsom {{1} }alfa-reduktas. Sammantaget tros kombinationen av dessa mekanismer bidra till Cistanches testosteronhöjande effekter.