CD8 och CD4 T-cellpopulationer i mänskliga njurar
Mar 25, 2022
Abstrakt:Bakgrund: Vid gränsplatser och i inre organ bidrar vävnadsbosatta minnes-T-celler (TRM) till immunbarriären mot patogener som virus, bakterier, svampar och cancer. Information om förekomsten och funktionen av dessa celler i den mänskliga njuren är dock knapphändig. För att bättre förstå det T-cellsmedierade immunologiska försvaret i detta organ, syftade vi till att bestämma fenotypiska och funktionella aspekter av CD8- och CD4-T-celler som finns i friska och allotransplantatnjure vävnad. Metoder: Med hjälp av flerkanalig medcytometri utvärderade vi fenotypen och funktionen hos T-celler i friska njurvävnadsprover (n=5) ochnjureallograftvävnad (n=7) och jämförde dessa aspekter med T-celler i perifert blod från friska kontroller (n=13). Resultat:Njurevävnadsprover innehöll avsevärda mängder CD8- och CD4-T-celler. I motsats till de cirkulerande cellerna,njureT-celler uttryckte ofta CD69 och CD103 och cyklade oftare aktivt. Dessutom nästan allanjureT-celler uttryckte CXCR3 och uttryckte ofta CXCR6 jämfört med T-celler i cirkulationen. Märkligt nog,njureT-celler producerade större mängder IFN än cirkulerande celler och var ofta polyfunktionella. Slutsats: Funktionella T-celler med de karakteristiska egenskaperna hos TRM finns hos människornjurevävnader. Dessa celler cyklar oftare aktivt och uttrycker ofta CXCR3 och CXCR6.
Nyckelord:vävnadsresidenta lymfocyter; T-celler; CD8; CD4; CD69; CD103; njure; allotransplantat
CISTANCHE KOMMER FÖRBÄTTRA NJUR-/NJÖRSJUKDOMAR
1. IntroduktionResident memory T-celler (TRM) kvarstår i vävnader för att tillhandahålla ett långsiktigt lokaliserat försvar mot patogener. I motsats till recirkulerande T-celler kan TRM-populationer inte detekteras i perifert blod och skiljer sig signifikant från recirkulerande T-cellpopulationer med avseende på deras fenotyp, funktion och metabolism [1]. Detta är faktiskt inte förvånande med tanke på det faktum att olika organsystem, som lungorna, utsätts för högre belastningar av olika patogener än vad som är fallet för cirkulationen, som i allmänhet är isolerad från omvärlden [2].Vävnadsretention av TkM kvarstår i åratal och förmedlas av mekanismer som involverar sfingosin-1-fosfatreceptor1 (S1PR1)-sfingosin 1-fosfataxeln (SP1). S1PR1 är en receptor som uttrycks av T-celler som förmedlar utträde från sekundära lymfoida organ vid bindning till den bioaktiva signalmolekylen SP1, som är en viktig mediator för T-cellshandel. Denna axel kan avbrytas av CD69, ett membranbundet lektin av c-typ som antagoniserar S1PR1-uttryck, vilket förmedlar retention. Dessutom induceras S1PR1-uttryck hos möss av transkriptionsfaktorn Krüppel-liknande faktor 2 (KLF2), som visade sig vara nedreglerad i TRM, och därigenom också hämmande av lymfocytutträde [3]. I sin tur visades nedreglering av KLF2 förmedlas av transkriptionsfaktorhomologen av Blimpl i T-celler (Hobit), som uttrycks på ett TpM-specifikt sätt i murina T-celler [4]. Dessutom uttrycker vissa TRM också CD103 (integrin E), varvid TRM kan identifieras med CD69 och CD103 uttryck [1].
Medan kunskapen om TRM-fenotyp och funktion ökar för olika mänskliga vävnader, är lite känt om dessa aspekter injure. Här exponeras T-celler för en distinkt uppsättning patogener såsom bakterier som stiger upp från de nedre urinvägarna och renotropa virus som polyomavirus BK (BKPyV). Faktum är att vi nyligen beskrev hur mänskliga njurar innehåller en undergrupp av T-celler som uttrycker CD69 och/eller CD103, bland vilka det finns CD8 T-celler som specifikt riktar in sig på BKPyV-proteinerna virionprotein1(VP1) och stort T-antigen (LTAG)-protein [5]. Vi, och andra, visade också närvaron av CD69/CD103-uttryckande slemhinneassocierade invarianta T (MAIT)-celler injurevävnad [6,7].
För att bättre förstå vilken typ av T-celler som utgör det lokaliserade immunsvaret i detta organ, använde vi flerkanalig flödescytometri för att undersöka fenotypen och funktionen avnjureTRMs, isolerade från givarenjurematerial från njurtransplanterade (RTR) och från friskanjurevävnad intill renal clear cell carcinom, för att se hur dessa populationer jämförs med T-cellspopulationer i cirkulationen.Vi hittade den där människannjurevävnad innehåller betydande mängder CD4- och CD8-T-celler som bara uttrycker CD69, CD69 och CD103, eller ingen av dessa markörer. Vi hittade att CD69-CD103- celler injurevävnad skiljer sig väsentligt från T-celler i cirkulationen och kan representera en TRM-population som saknar de kanoniska TRM-markörerna. Dessutom visar vi att njurens T-celler oftare cirkulerar aktivt, vilket bedöms av ökat uttryck av Ki-67, jämfört med blod. Vi fann också att CD8 och CD4 T-celler injurevävnad uttrycker nästan alltid CXCR3 och uttrycker ofta CXCR6. Dessa fynd implicerar en roll för dessa kemokinreceptorer i attraktionen och underhållet av njurboende minnes-T-cellpopulationer.
2. Material och metoder
2.1. Patienter och proverProver erhölls från Biobank Renal Diseases vid Amsterdam UMC-platsen AMC. I denna Biobank kan patientprover, såsom blod ochnjurevävnad, samlas in och lagras från ett hälsosamt livnjuredonatorer och RTR som följs före och efter njurtransplantation. Denna studie genomfördes enligt principerna i Helsingfors- och Istanbuldeklarationerna och alla deltagare lämnade skriftligt informerat samtycke innan de registrerades i biobanken. Dessutom donerades restvävnad från patienter som genomgick tumörnefrektomi (njurvävnad på avstånd från tumören) av patologiska institutionen och lagrades även i biobanken. Dessa vävnader behandlades anonymt enligt Federation of Dutch Medical Scientific Societies' Code of Conduct (Human Tissue and Medical Research: Code of Conduct for Responsible Use, 2011 www.federa.org).
2.2. Perifera blodmononukleära celler (PBMC)Blodprov togs från cytomegalovirus (CMV)-seronegativa friska kontroller (levandenjuredonatorer före operationen, n= 13). Karakteristika för deltagarna i denna studie visas i tabell 1. PBMC isolerades från natriumheparinblod genom standarddensitetsgradientcentrifugering och kryokonserverades därefter till analysdagen.
2.3. NjurvävnadFriska njurvävnadsprover (n {{0}}) erhölls från njurar som avlägsnats kirurgiskt på grund av njurcellscancer (avlägsen icketumörvävnad från njurens kontralaterala pol) och transplanterad njurvävnad (n {{1 }}) erhölls från explanterade njurallotransplantat efter transplantationssvikt. Dessa prover kallas friska respektive transplanterade njurprover. Skivor av njurbarken hackades i 1-mm kuber med McElwain Tissue Chopper (Ted Pella, Redding, CA, USA), överfördes till 50 mL rör och tvättades med kall PBS tills inget blod försvann synligt närvarande och supernatanten var klar. Förvärmt (37 grader) uppslutningsmedium tillsattes, 40 ml per 10 g vävnad (DNAs typ IV (50 KU/ml) (Sigma Aldrich, Zwiindrecht, Nederländerna), kollagenas typ IV (0,5 mg/ml) (Worthington Biochemical, Lakewood, NJ, USA), BSA (60 mg/ml) (Sigma Aldrich), 20 uL/ml fetalt kalvserum (FCS, VWR International BV, Amsterdam, Nederländerna), TRIS (0,025 M) (Merck BV, Amsterdam, Nederländerna), penicillin-streptomycin (Biochrom GMBH, Berlin, Tyskland) i HBSS (Westburg BV, Leusden, Nederländerna)), och inkuberades i en shaker i 20 minuter vid 37 grader. Den varma suspensionen överfördes till ett C-rör (Miltenvi, Bergisch Gladbach, Tyskland) och utsattes för programmet M_mjälte_04.01 på GentleMacs(Miltenyi). Uppslutningsmediet deaktiverades med kall PBS och den resulterande cellsuspensionen passerade genom en cellsil för att erhålla en encellssuspension, som utsattes för standarddensitetsgradientcentrifugering enligt tillverkarens protokoll (Lymphoprep, Abbott Diagnostics Technologies AS, Oslo, Norge ). De isolerade mononukleära cellerna (njure MNCs) varkryokonserverad till analysdagen i IMDM kompletterat med 20 procent FCS, 000036 volymprocent -merkaptoetanol, 5 procent DMSO, penicillin och streptomycin.
2.4. FlödescytometriMätningar utfördes på en LSRFortessa flödescytometer (BD Biosciences). För varje prov analyserades 2×106 PBMC eller 0,5×106 till 10×106 njure MNC. Volymen av varje färgningsreaktion var i förhållande till antalet celler och antikroppskoncentrationerna förblev konstanta. Celler inkuberades med ytantikropparna (kompletterande tabell S1) i 30 minuter vid 4 grader i mörker. Döda celler uteslöts med användning av det fixerbara livskraftsfärgämnet eFluor455UV (eBioscience Inc., Thermo Fisher Scientific, San Diego, CA, USA). Monoklonala antikroppar med intracellulära mål (kompletterande tabell S1) tillsattes efter fixering och permeabilisering av cellerna med användning av FoxP3/Transcription Factor Staining Set (eBioscience Inc.). Publicerade metoder för flödescytometri och cellsortering för immunologiska ändamål följdes [8]. Grindningsstrategin som används för den fenotypiska analysen finns i tilläggsfigur S1. Vi har tidigare visat att ingen av de analyserade markörerna påverkades av matsmältningsmetoden som användes för att isolera njur-MNC [7].
Begränsningar av vävnadsprov resulterade i uteslutning av prover från gardinpaneler. CD3 plus cellantal analyserade per prov i friska PBMCs, friska njure MNCs och TX njurar kan hittas i figur S3. MNC-prover analyserades endast när de innehöll över 50 procent levande celler i lymfocyten, vilket bedömdes av viabilitetsdve, och CD69/CD103-baserade T-cell-undergrupper karakteriserades endast ytterligare om deras totala cellantal översteg 50.
CISTANCHE KOMMER ATT FÖRBÄTTRA NJUR-/NJÖRSFULLT
2.5. StimuleringsanalysPBMC och njure MNC stimulerades som tidigare beskrivits [7,9]. PBMC och njur-MNC tinades i närvaro av DNAse I(200 KU/mL), tvättades och fick återhämta sig över natten i obehandlade, rundbottnade 96-brunnsplattor (Corning) i odlingsmedium (RPMI kompletterat med 10 procent FCS och penicillin-streptomycin) vid en koncentration av 20 × 106/ml (100 μL/brunn).
Nästa morgon tillsattes forbol 12-myristat 13-acetat (PMA, 10 ng/ml; Sigma Aldrich) och jonomycin (1 ug/ml; Sigma Aldrich) för att stimulera cellerna. Enbart medium tillsattes som negativ kontroll. Alla inkubationer utfördes i odlingsmedium i närvaro av CD28 (klon 15E8; 2 ug/ml), CD29 (klon TS 2/16; 1 ug/ml), brefeldin A (10 ug/ml, Invitrogen) och GolgiStop ( BD Biosciences) i en slutlig volym på 200 uL i 4 timmar vid 37 grader och 5 procent CO2.
Därefter inkuberades cellerna i 30 minuter med ytantikropparna (kompletterande tabell S2). Döda celler uteslöts med användning av fixerbart viabilitetsfärgämne eFluor780 (bioscience Inc., Thermo Fisher Scientific, San Diego, CA, USA). Monoklonala antikroppar för intracellulär färgning (tabell S1) tillsattes efter fixering och permeabilisering av cellerna med användning av Cytofix/Cytoperm Reagent Set (BD Biosciences). Celler tvättades två gånger och analyserades på en LSRFortessa flödescytometer. Grindningsstrategin som används i den funktionella analysen finns i tilläggsfigur S2. För att bestämma polyfunktionaliteten för varje T-cellsdelmängd beräknades det genomsnittliga antalet funktioner för varje population med hjälp av följande formel:((procent av celler som producerar 1 cytokin]*1) plus ([procentandel av celler som producerar 2 cytokiner]*2) plus ([procent av celler som producerar 3 cytokiner]*3) plus ([procent av celler som producerar 4 cytokiner]*4) plus ([procent av celler som producerar alla 5 cytokiner]*5))/100.
2.6.Dataanalys
Data analyserades med användning av FlowJo version 10 (FlowJo, Ashland, OR, USA). Alla grafer och figurer skapades med Graphpad Prism version 8.00 för Windows (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Samma program användes också för de statistiska analyserna av data. Det icke-parametriska Mann-Whitney-U-testet användes för att bestämma signifikansen av oparade prover. För att jämföra parade prover användes Wilcoxon signed-rank test. p-värden<0.05 were="" considered="" statistically="">
3. Resultat
3.1. Distinkt uttryck av CD8 och/eller CD4 och markörer för vävnadsresidency av T-celler i frisk njurvävnadFörst jämförde vi uttrycket av CD4 och CD8 av CD3-positiva T-celler i perifert blod med celler som upptäckts i frisk njurvävnad. CD4-CD8 plus (CD8) T-celler upptäcktes betydligt oftare i njurvävnad än i blod ((median)25 procent vs.38 procent )(Figur la). Däremot CD4*CD{{9} }(CD4)T-celler detekterades i högre frekvenser i blod än i njurvävnad ((70 procent vs. 52 procent) Figur la). Totalt sett sågs CD4 T-celler oftare i frisk njurvävnad än CD8 T-celler (Figur 1b).
Därefter undersökte vi uttrycket av vävnadsresidensmarkörerna, CD69 och CD103, i CD8- och CD4-definierade T-cellsundergrupper. Som förväntat uttrycktes CD69 och CD103 praktiskt taget inte av celler i perifert blod (Figur 1c). I frisk vävnad uttrycktes fenotyperna CD69-CD103-, CD69 plus CD103-, CD69tCD103 plus och CD69-CD103 plus med 46 procent , 45 procent , 6,6 procent och 1,8 procent av CD8T-celler, 61 procent, 38 procent, 0,44 procent respektive 0,43 procent av CD4T-celler (Figur lc). Sammanfattningsvis upptäcktes CD8, men särskilt CD4 T-celler i betydande antal i frisk mänsklig njurvävnad. Vidare upptäcktes uttryck av CD69 och CD103, markörer för vävnadsuppehållstillstånd, främst bland T-celler som hittades i frisk vävnad och inte i blod.
3.2. Olika uttrycksmönster av vanliga delmängdsbenämnande markörer efter T-cell i hälsa/efter njurvävnad
CD45RA, ett tyrosinfosfatas, CCR7, en kemokinreceptor känd för att förmedla T-cellstrafik till sekundära lymfoida organ, och CD28 och CD27, båda samstimulerande receptorer starkt involverade i T-cellsaktivering, är alla markörer som traditionellt används för att identifiera funktionella T-cellssubset J1{ {53}},1l. Vi ville undersöka i vilken utsträckning fördelningen av dessa delmängder i blod skiljer sig från fördelningen i njurvävnad. Som väntat var de största CD8 T-cellsundergrupperna som upptäcktes i cirkulationen (dvs. de som rör mer än eller lika med 5 procent av den totala populationen) de med en CD45RA plus CCR7 plus CD28 plus CD27 plus (naiva T-celler eller TN, ( median) 13 procent ), CD45RA-CCR7 plus CD28 plus CD27 plus (centralminnes Tceller eller TcM, 6 procent ), CD45RA-CCR7-CD28 plus CD27 plus (TEv1,30 procent ), CD45RA-CCR7-CD28 plus CD27-(Tau2,10 procent ), CD45RA-CCR7-CD28-CD27*(TEy3,6 procent) , CD45RA-CCR7-CD28-CD27-(TM4,6 procent )och CD45RA plus CCR7-CD28-CD27-(TEMRA ,10 procent )fenotyp. I frisk vävnad upptäcktes nästan inga (0,6 procent) CD8 T-celler med en TN-fenotyp och endast ett fåtal (0,8 procent) uppvisade en Tax-fenotyp. Däremot bestod CD8 T-celler som upptäckts i frisk njurvävnad av betydande TEv1-(22 procent),TEM2-(12 procent), Tpx3-(18 procent),TEx{ {65}} (23 procent) och TEyRA(11 procent) T-cellpopulationer (Figur ld och Figur S4). När man tittade på CD4 T-celler i blodet var de största populationerna de som uttryckte Ty-(35 procent), TcM-(25 procent), TEMl-(16 procent), TFM2-(9 procent) och en population med en icke specificerad CD45RAtCCR7-CD28 plus CD27* fenotyp (0,4 procent) (Figur 1d och Figur S4). I frisk njurvävnad uttryckte få CD4 T-celler en TN- (3 procent) eller en TcM -(3 procent) fenotyp. I stället upptäcktes ett stort antal celler med en TEM1-(22 procent), TEM2-(40 procent) eller TEM4(14 procent) fenotyp i frisk vävnad (Figur ld och Figur S4) . Sammanfattningsvis skiljer fördelningen av CD45RA/CCR7/CD28/CD{101}}definierade CD8- och CD4-T-cellsundergrupper avsevärt mellan blod och frisk njurvävnad.
3.3. CD8 och CD4 T-celler i frisk mänsklig njurvävnad omfattar oftare aktivt cyklande cellerDärefter undersökte vi om det finns skillnader i uttrycket av markörer som är typiska för en cytotoxisk effektor-minnesprofil, mellan CD8 och CD4 T-cellpopulationer i blod och njurvävnad. Först tittade vi på uttrycket av T-box-transkriptionsfaktorerna T-bet och eomeso-dermin(Eomes). Dessa transkriptionella regulatorer är direkt involverade i att generera akutfaseffektorceller, inducera uttrycket av molekyler som interferon-y och granzym B, och i genereringen av sekundära minnessvar. Som väntat var uttryck av T-bet frekvent bland cirkulatoriska CD8 T-celler (54 procent), medan cirkulatoriska CD4 T-celler sällan uttryckte denna transkriptionsfaktor (13 procent). Intressant nog för CD4 T-celler var T-bet-uttrycket signifikant högre bland T-celler som upptäckts i frisk njurvävnad än i cirkulationen (53 procent mot 13 procent). Viss uttryck detekterades också ofta bland cirkulatoriska CD8 T-celler (59 procent), medan det återigen var sällsynt bland cirkulatoriska CD4 T-celler (15 procent). Emellertid var Eomes-uttryck vanligare bland CD4 T-celler i njurvävnad (32 procent) än i blod (Figur 2a,b).
Därefter undersökte vi uttrycket av granzym B, ett serinproteas som är känt för att mediera apoptos efter injektion i cytoplasman av cytotoxiska T-celler. I linje med tidigare rapporter detekterades T-bet och granzym B-uttryck i betydande antal i cirkulerande CD8 T-celler (28 procent). Dess uttryck var dock sällsynt bland cirkulerande CD4 T-celler (1 procent). För CD8 T-celler var uttrycket av granzym B liknande i njurvävnad och cirkulerande populationer (28 procent ys.23 procent) (Figur 2c). Intressant nog motsvarade de högre uttrycksfrekvenserna för T-bet och Eomes som detekterades i CD4-T-celler från njure inte med en högre uttrycksfrekvens för granzym B i detta fack (5 procent). Vi tittade sedan på uttrycket av KLRGl, en samhiberande receptor som är känd för att övervägande uttryckas av cytotoxiska akutfaseffektorceller och effektorminnesceller. KLRG1 uttrycktes ofta av cirkulerande CD8 T-celler (54 procent), men inte av CD4 T-celler ( 10 procent). Inga skillnader hittades mellan anatomiska fack i KLRG1l-uttryck för CD8- eller CD4-T-celler. Slutligen undersökte vi uttrycket av Ki-67, en markör som anger aktivt cirkulerande celler. I linje med tidigare observationer var Ki-67-uttryck bland cirkulerande CD8- och CD4-T-celler sällsynt (1 procent respektive 2 procent). Intressant nog, bland CD8 T-celler, men särskilt bland CD4 T-celler, upptäcktes Ki-67-uttryck betydligt oftare i T-celler i njurvävnad (3 procent respektive 11 procent) (Figur 2e). Sammanfattningsvis upptäcktes CD4 T-celler i frisk mänsklig njurvävnad, men inte CD8 T-celler i detta fack, mer frekvent uttryckta T-bet och Homes. Detta översattes dock inte till ett mer frekvent uttryck av granzym B av CD4 T-celler från njure. Dessutom, även om det totala antalet cyklande celler var lågt, innehöll njurvävnaden betydligt mer aktivt cyklande CD8- och CD4-T-celler än cirkulationen.
3.4. CD8 och CD4 T-celler i frisk njurvävnad är nästan alla CXCR3-positionVi letade sedan efter skillnader i uttryck av andra markörer, typiska i cirkulerande populationer av inte omedelbart cytotoxiska minnesceller, som visats tidigare för cirkulerande T-cellspopulationer. Vi tittade först på uttrycket av IL-7R, uttryckt främst på naiva och tidigt differentierade minnesceller i cirkulationen, där det är involverat i att upprätthålla homeostatisk proliferation [10,12,13]. I perifert blod uttrycktes IL-7Ra ofta av CD8 T-celler (84 procent) och CD4 T-celler (98 procent). CD8 och CD4 T-celler i frisk njurvävnad uttryckte denna markör betydligt mindre ofta än cirkulerande T-celler (71 procent respektive 76 procent) (Figur 2f).
Därefter undersökte vi uttrycket av olika andra kemokinreceptorer. Intressant nog uttrycktes CXCR3, en kemokinreceptor involverad i T-cellstrafik till inflammerade vävnader[14-17], av ett mycket stort antal CD8- och CD4-T-celler i njurvävnad (99) procent respektive 91 procent), och betydligt mindre ofta genom cirkulerande T-celler (58 procent respektive 26 procent) (Figur 2g). Slutligen bestämde vi uttrycket för CXCR6, som är känt för att vara inblandat i bildandet av TRM-populationer [18-22]. Medan CXCR6 uttrycktes av endast en liten population av cirkulerande CD8 T-celler (16 procent), och praktiskt taget inte av cirkulerande CD4 T-celler. en signifikant större andel av CD8- och CD4-T-celler i njurvävnad uttryckte denna molekyl (40 procent respektive 40 procent) (Figur 2h). Sammanfattningsvis uttrycktes markörer som vanligtvis är förknippade med ett icke omedelbart differentierat tillstånd i cirkulationen, sannolikt-7Ra, CCR7, CD28 och CD27, signifikant mindre ofta av CD8- och T-celler från njurarna jämfört med de i blodet. Däremot uttryckte njur-T-celler oftare CXCR6 och uttryckte nästan alltid CXCR3.
3.5. Skillnaderna i fenotyp mellan friska njurar och allograft-T-celler är minimalaDärefter ville vi undersöka om dessa fynd förblev stående i vävnad från transplanterade njurallotransplantat som erhölls för olika kliniska indikationer (Tabell 1).När det gäller antalet CD8- och CD4-T-celler i frisk och allograftvävnad sågs inga skillnader (Figur 3a). Vi märkte dock en icke-signifikant trend mot fler CD4T-celler och mindre CD8T-celler i frisk vävnad än i allograftvävnad (Figur 3b). Dessutom, när man tittar på CD69/CD103expression och CD45RA/CCR7/CD28/CD27-definierade delmängder, finns det inga skillnader i distribution av CD69/CD103- eller CD45RA/CCR7/CD28/CD27- definierade delmängder noterades, oavsett CD8/CD4-fenotyp (Figur 3d och Figur S5). När vi undersökte uttrycksfrekvenser för markörerna mer typiska för cytotoxiska cirkulerande T-celler, fann vi inga skillnader i uttryck av T-bet, KLRG1 eller granzym B mellan friska njure eller allograft-T-celler (Figur 3a, gh). Vi fann att Eomes uttryck sågs mindre ofta i allograftvävnad CD4 T-celler än i friska vävnads T-celler (Figur 3f). Inga skillnader i uttrycket av de andra markörerna observerades. (Figur 3-l och Figur S5b-d). Sammanfattningsvis, bortsett från en lägre uttrycksfrekvens av Eomer bland allograft CD4 T-celler, skilde sig cellpopulationer inte mellan studiepopulationer.
3.6. CD69-CD103-T-celler i njurvävnad skiljer sig från cirkulerande cellerMed tanke på den liknande fenotypiska sammansättningen av CD8- och CD4-T-celler som finns i frisk njurvävnad och i njurallotransplantatvävnad, slog vi ihop data från båda studiegrupperna för att ytterligare undersöka egenskaperna hos dessa celler enligt CD69- och CD103-uttryck. Eftersom CD69-CD103 plus-celler alltid upptäcktes i mycket låga frekvenser(<50 events),="" we="" excluded="" these="" cells="" from="" further="" analyses.="">Först undersökte vi skillnader i dessa undergrupper enligt CD69/CD1 03-samuttryck i njur-T-cellspopulationer (Figur 4 och Figur S6). Intressant nog, för både CD8- och CD4-T-celler, noterades betydande skillnader i fördelningen av CD45RA/CCR7/CD28/CD27-definierade delmängder bland CD69-CD103-, CD69 plus CD{ {14}}och CD69*CD103* underuppsättningar. För CD8 T-celler innehöll CD69-CD103-celler en ansenlig population av TeyRA-celler (21 procent) som var mycket mindre bland CD69 plus CD103- och CD69 plus CD103 delmängder (5,8) procent respektive 2,2 procent). Istället innehöll dessa senare populationer mycket större TEy3 (13 procent, 30 procent respektive 32 procent) och TEy4 (8 procent, 19 procent respektive 33 procent) subpopulationer. För CD4 T-celler sågs få TEyRA-celler bland CD69-CD103-, CD69*CD103- och CD69 plus CD103* undergrupper (2,6 procent ,0 procent och 1,7 procent , respektive). Istället innehöll dessa celler stora delpopulationer av TFw1 (26 procent ,24 procent respektive 10 procent) och TEy2-celler (30 procent, 46 procent respektive 27 procent). Bland CD69 plus CD103-och särskilt bland CD69*CD103*-cellerna sågs en mycket större TEM4-subpopulation (6 procent, 11 procent respektive 34 procent).
Med tanke på dessa distinktioner och den tidigare observationen att njur-T-cellpopulationer knappt bestod av TN- och TcM-celler, undersökte vi ytterligare CD69-CD103--cellerna som finns i njurvävnad för att avgöra i vilken utsträckning dessa celler var inte bara cirkulerande celler som passerar genom njurcirkulationen. För att göra det jämförde vi dessa celler med cirkulerande celler. CD69-CD103~celler i njurvävnad skilde sig signifikant från de i cirkulationen: T-bet, Ki-67 och CXCR3 uttrycktes oftare av njurens T-celler, oavsett CD8/CD4-fenotyp (Figur 5a-c). Däremot uttrycktes IL-7R, CCR7, CD28 och CD27 alla signifikant mindre frekvent av CD69-CD103- njur-T-celler, oavsett CD8/CD4-fenotyp (Figur 5d- g). CD69-CD103-CD4 T-celler i njurvävnad uttryckte KLRG1 signifikant oftare än i blod och CD69-CD103-CD8 T-celler i njurvävnad uttryckte Eomer betydligt oftare än i blod.
Därefter ville vi se hur CD69 och CD103 samuttryck påverkade markörer för funktionell potential. Först tittade vi på markörer associerade med cytotoxisk potential. Även om skillnader noterades mellan individuella subpopulationer, sågs inga följdmönster för T-bet och Eomes i CD8 T-celler när CD69 eller CD103 samuttrycktes (Figur 6a,b). I motsats till CD4 T-celler ökade dessa transkriptionsfaktorer båda tillsammans med Samuttryck av CD69 och CD103 (Figur 6a,b). När vi tittade på KLRG1 märkte vi att för CD8 T-celler minskade KLRG1-uttrycket tillsammans med CD69/CD103-samuttryck. För CD4 T-celler sågs en liknande trend. Men här uttryckte endast CD69-CD103-celler KLRG1 med en högre frekvens än CD69 plus CD103- och CD69 plus CD103* celler (Figur 6c). Uttrycksfrekvenserna för granzym B minskade också tillsammans med markörer för vävnadsresidens, där dess uttrycksfrekvens var lägst bland CD69 plus CD103*-celler, inom både CD8- och CD4-T-celler (Figur 6d). Uttrycket av Ki-67, som var högre bland njur-T-celler jämfört med T-celler i blodet, skilde sig inte enligt CD69- eller CD103-samuttryck (Figur 6e).
Vi undersökte sedan markörer som normalt är associerade med en icke-cytotoxisk minnesprofil enligt CD69/CD103-samuttryck. Uttrycket av IL-7Ra, CCR7 och CD28 var högst inom CD69-CD103--populationerna, med en trend för att definiera uttryck tillsammans med samuttryck av CD69/CD103 (Figur 6f-h ). Vi tittade sedan på uttrycket av CXCR3 och CXCR6. Båda kemokinreceptorerna uttrycktes oftast av CD69tCD103t-celler, oavsett CD8/CD4-fenotyp, och visade en uppåtgående trend med samuttryck av CD69/CD103. Endast för CXCR6 var denna trend statistiskt signifikant och påverkade både CD8 och CD4 Tells (Figur 6j,k). Sammanfattningsvis skiljer sig CD69-CD103--celler i njurvävnad avsevärt från celler i cirkulationen och kan röra en annan TBv-population som inte är märkt av CD69- eller CD103-uttryck. Den enda markören som skiljde sig konsekvent, oavsett CD8/CD4-fenotyp, när det gäller CD69 och CD103 samuttryck, var CXCR6.
3.7.T-celler i njurvävnad producerar oftare interferon- än T-celler i blodSlutligen undersökte vi cytokinproduktionskapacitet genom CD8/CD4-definierade T-cellspopulationer i njurvävnad. Först jämförde vi produktionen av interferon-y (IFNy), tumörnekrosfaktor (TNF ), interleukin-2 (IL-2), granulocyt-makrofager kolonistimulerande faktor (GM-CSF) och IL-17 av stimulerade CD8/CD4-definierade T-cellspopulationer som finns i blod till de i frisk njurvävnad (Figur 7a-e). Intressant nog uttrycktes endast IFNy konsekvent av en större andel T-celler i frisk njurvävnad, jämfört med T-celler i blodet, oavsett CD8/CD4-fenotyp (Figur 7a). Skillnader märktes också på en individuell delmängdsnivå. Specifikt producerades TNF och GM-CSF oftare av CD4 T-celler i njurvävnad (Figur 7b.c). När det gäller polyfunktionalitet (dvs. antalet samtidigt producerade cytokiner), visade sig CD4 T-celler i njurvävnad vara mer polyfunktionella än CD4-celler i blodet (Figur 7f).
Därefter tittade vi på skillnader i cytokinproduktionskapacitet mellan stimulerade T-celler från frisk och allograftvävnad. Inga skillnader i produktionen av individuella cytokiner, eller i ett antal samtidigt producerade cytokiner detekterades mellan T-celler från frisk eller allograft njurvävnad (Figur S7). Eftersom CD69 uttrycks vid stimulering av T-celler, studerade vi bara skillnaden mellan CD103-negativa och CD103-uttryckande CD4- och CD8-T-celler (Figur 7g-). När vi jämförde CD4- och CD8-T-celler som uttrycker CD103 med celler som inte uttrycker CD103 i njurvävnad, märkte vi att CD8- och CD4-CD103-celler uttryckte mer IFNy än CD103--celler (Figur 7g). Dessutom, även om IL-1ZA-producerande celler var låga bland CD103 plus CD8 och CD4 T-celler i njurvävnad, påträffades de genomgående oftare i denna population jämfört med CD103--populationen. Sammanfattningsvis producerade fler T'-celler i njurvävnad IFNy jämfört med cirkulerande T-celler, oavsett CD8/CD4-fenotyp. Den högsta andelen IFNy-producerande celler hittades faktiskt bland de CD103-som uttrycker CD4- och CD8-njurhärledda T-celler. Dessutom skilde sig T-celler i njurallotransplantat inte från de i frisk njurvävnad med avseende på dessa parametrar.
4. Diskussion
I den aktuella studien tog vi upp mångfalden av T-cellsundergrupper, enligt uttrycket av CD8 och CD4, och markörerna för vävnadsresidens, CD69 och CD103, i mänskliga njurar och jämfört med dessa med blod. Ett betydande antal CD8- och CD4-T-celler upptäcktes verkligen i njurvävnad. Dessutom innehöll dessa T-celler i njurarna ett stort antal CD69*CD103-celler. CD69 plus CD103 plus celler detekterades också, men övervägande bland CD8 T-cellerna och var praktiskt taget obefintliga bland CD4 T-celler. Ett liknande fynd gällde lung-TRM tidigare [23]. Som väntat var sådana populationer som uttrycker CD69 och CD103- i stället nästan frånvarande i cirkulationen. En slående skillnad när man jämförde T-celler i njuren med de i blod gällde en distinkt fördelning av de traditionella CD45RA/CCR7/CD28/CD27-definierade undergrupperna. Intressant nog uttrycktes uttrycket av CD28 oftare inte när T-celler samuttryckte CD69 enbart eller i kombination med CD103. Teoretiskt sett borde detta göra dessa populationer mindre mottagliga för samstimulerande signaler från CD80 och CD86. Andra skillnader gällde en högre uttrycksfrekvens av CXCR3, CXCR6 och Ki-67. Dessutom innehöll njur-T-celler oftare IFNy-producerande celler och var ofta polyfunktionella. I själva verket innehöll CD103 plus Tpys i njuren fler IFN-producerande celler än deras CD103-negativa motsvarigheter. Dessutom producerade CD103T-celler oftare IL-17, även om detta gällde en blygsam population.
CISTANCHE KOMMER ATT FÖRBÄTTRA NJUR-/NJURINFEKTION
När det gäller det mer frekventa uttrycket av CXCR3 av CD8- och CD4-njur-T-celler, har CXCR3/CXCL10-axeln tidigare visat sig vara involverad i utformningen av TpM-populationer i hud, lever och lymfoidvävnad [24-28]. Dessutom är det inblandat i handeln till stressat epitel och inflammation i allmän mening [14-17]. Med tanke på de höga frekvenserna av CXCR3 bland dessa T-celler i frisk njurvävnad, verkar CXCR3 vara inblandad i TRM-homeostas i njurvävnad också och behöver inte nödvändigtvis involvera inflammation eller farosignaler för att göra det. När det gäller CXCR6, har CXCR6/CXCL16-axeln verkligen redan visat sig vara väsentlig för handel med Tpst till olika fack som lungor, hud, lever och hjärna, och kan röra en universell mekanism som är nödvändig för att styra och behålla TRM till och i vävnader, även om TRM i mänsklig njurvävnad [18-22].
Farber och medarbetare har utförligt karakteriserat och jämfört CD8- och CD4 TRM-populationer som finns i olika mänskliga vävnadstyper härrörande från organdonatorer. De beskrev hur TRM-populationer i lungor, mjälte, tunntarm och olika sekundära lymfoida vävnader skiljer sig åt med avseende på transkriptomet, men också till uttrycket av olika proteiner, inklusive cytokiner, som undersökts i den aktuella studien [29-31. Dessa undersökningar omfattade dock inte TRM-populationer i den mänskliga njuren och data om detta
ämnet är knappt. Vi har tidigare visat att CD8 T-celler riktade mot polyomavirus BK VP1- och LTAG-proteiner, härrörande från ett virus som har en stark tropism för njurepitelceller, är detekterbara i allotransplantatnjurar. Dessa virusspecifika T-celler uttryckte CD69 och CD103 i högre antal än deras motsvarigheter som fanns i samma patienters cirkulation. Dessutom uttryckte dessa T-celler i allmänhet en CD45RA-CD27-granzym B-negativ fenotyp[5]. Senare har andra också rapporterat om TRM-populationer i mänsklig njurvävnad erhållen från transplanterade nefrektomier. I denna publikation rapporterar författarna att T-celler i dessa vävnader huvudsakligen rörde CD8 T-celler [321. Vi fann istället att CD4 T-celler i själva verket utgjorde den största T-cellsundergruppen. Men vi fann också att balansen skiftade, men inte signifikant, mot ett större antal CD8 T-celler i allograftvävnad jämfört med frisk njurvävnad. Som sådan kan denna avvikelse förklaras av en annan studiegrupp, och det kan vara så att det immunologiska försvaret inom hälsa är mer fokuserat på extracellulära hot, som bakterier, jämfört med mer intracellulära hot, som virus och cancer i de immunkomprometterade värdarna. Vi hittade inga andra skillnader i de studerade markörerna, mellan friska njure och allograft-T-celler. Men ytterligare forskning, med hjälp av tekniker med en bredare syn på transkriptom, som RNA-sekvensering eller proteom, som masspektrometri, bör användas för att fastställa om detta verkligen är fallet.
Dessutom har de Leur et al. beskriva hur TRM i njurar ofta uttryckte granzym B, medan vi endast upptäckte låga mängder granzym B i både frisk och allotransplanterad njurvävnad [32]. Men vi upptäckte betydande T-bet och Eomes-uttryckande T-celler i njurvävnad, som i cirkulerande T-cellspopulationer, normalt sett är förknippad med ett högre uttryck av granzym B [10]. Även om det senare kanske inte är förvånande, med tanke på det faktum att granzym B-uttryck också induceras direkt av T-bet [33,34], var detta samband inte uppenbart bland njur-T-celler i den aktuella studien. Som vi och andra har visat att även mänskliga lung-, hjärn- och hudhärledda TRM [25,26,3536], såväl som njure-härledda vävnadsbosatta MAIT ælls 【6,7】 har låga granzym B innehåll, samtidigt som det ofta uttrycker betydande mängder T-bet och Eomes, kan detta vara ett vanligt drag hos (mänsklig) TkM. Vidare sågs granzym B-uttryck i lung-TRM vara snabbt uppreglerat vid stimulering [35l, vilket tyder på att detta också kan inträffa i andra TeM. Här antog författarna att sådan 'dold cytotoxicitet tjänar till att skydda den strukturella integriteten hos vävnader från skador av cytotoxiska T-celler.
Sammanfattningsvis visar vi att Tcll i njurvävnad är närvarande i ett betydande antal och omfattar populationer som ofta uttrycker CD69 plus och CD103 plus, molekyler genom vilka T-celler fäster vid och kvarstår i vävnader. Icke desto mindre verkar CD69-CD103- T-cellerna i njurvävnad vara olika från cirkulerande T-celler och kan röra en annan distinkt TiM-population, möjligen kvarstår i njurarna genom andra mekanismer som vet att avslöjas. Ett annat alternativ kan vara att dessa CD69-CD103-T-celler berör en population som nyligen kommit ut ur cirkulationen, och hö endast övergående förvärvat nya fenotypiska egenskaper på grund av en interaktion med njurens mikromiljö. Ytterligare undersökningar av denna population behövs för att klarlägga dessa möjligheter. Vidare. CD8- och CD4-njur-T-celler cirkulerade ofta aktivt och uttryckte oftare CXCR6. Dessutom har CD8- och CD4-populationer undanträngt ett särskilt högt uttryck av CXCR3, vilket starkt implicerar dessa kemokinreceptorer, såväl som CXCR6 i TRM-tillväxt och persistens i mänskliga njurar. Därför behövs ytterligare undersökningar för att förbättra vår bild av Tpv-populationer i den mänskliga njuren. Icke desto mindre utgör resultaten som presenteras här ett solidt första steg mot en mer detaljerad karakterisering av T-cellpopulationer i njurvävnad och deras roll i hälsa och sjukdom.