Förändringar i humant erytrocytmembran exponerat för vattenhaltiga och etanoliska extrakt från Uncaria Tomentosa

Kontakt:tina.xiang@wecistanche.com

Abstrakt: Uncaria tomentosa (Willd.)DC är en trädartad klättrare med ursprung i Syd- och Centralamerika som har använts vid behandling av astma, reumatism, högt blodtryck och blodrening. Vår tidigare studie visade att U.tomentosaextraktförändrad human erytrocytform, vilket kan bero på införlivandet av föreningarna som ingår i extrakten i erytrocytmembranet. Syftet med föreliggande studie var att fastställa hur föreningarna som ingår i UI.tomentosa-extrakten införlivas i det mänskliga erytrocytmembranet. Studien har utvärderat effekten av vattenhaltiga och etanoliska extrakt från löv och bark av U. tomentose på den humana erytrocytens osmotiska motstånd, viskositeten hos erytrocyternas inre och flytbarheten hos erytrocytplasmamembranet. Mänskligerytrocyterinkuberades med de studerade extrakten i koncentrationerna 100 250 och 500 ug/ml under 2,5 och 24 timmar. Alla testade extrakt orsakade en minskning av erytrocytmembranets fluiditet och ökad erytrocytosmotisk känslighet. Etanolextrakten från barken och bladen ökade erytrocyternas viskositet. De största förändringarna i de studerade parametrarna observerades i cellerna inkuberade med bark etanolextrakt. Vi anser att föreningarna från U. tomentosa-extraktet huvudsakligen byggs in i det yttre, hydrofila monoskiktet av erytrocytmembranet, vilket skyddar erytrocyterna mot de negativa effekterna av oxidativ stress.

Nyckelord: erytrocyter; membranfluiditet; osmotisk motstånd; Uncaria tomentosa; extrakt

Klicka för att lära dig mer information

1. Introduktion

Uncaria tomentosaextraktanvänds ofta för att stödja behandlingen av olika sjukdomar på grund av derasantioxidant[1-4] och immunstimulerande [5,6] aktiviteter. Extrakt från U.tomentosa har också visat sig uppvisa anticancer [7-9], antimutagena [10,11] och antiherpetiska aktiviteter [11].

Etnomedicinska undersökningar och andra studier har visat många tillämpningar av denna växt i traditionell medicin i olika kulturer, t.ex. behandling av inflammation, artrit, astma, cancer, magsår, urinvägssjukdomar och blödningar [12,13]. Sådana olika egenskaper beror på att den komplexa kemiska sammansättningen av U. tomentosa huvudsakligen är förknippad med högt innehåll av olika biologiskt aktiva sekundära metaboliter, mestadels fenoler och alkaloider [14].

Många artiklar har också indikerat den gynnsamma verkan (utan några biverkningar) av UI.tomentosa-extrakt (används i terapeutiska doser) i blodkroppar i både in vivo[15,16] och in vitro-studier [17-19]. Sheng et al. [20] observerade inga förändringar i blodpresentationen efter administrering av höga koncentrationer av U. tomentosa-extrakt C-MED-100TM till friska frivilliga. De observerade inga statistiskt signifikanta förändringar, inklusive hemoglobinnivå, hematokritvärde och medelvolym av röda blodkroppar (RBC), vilket snarare uteslöt möjlig för tidig eliminering av RBC exponerade för U. tomentosa-extrakt.

På liknande sätt har kliniska prövningar utförda av Piscoya et al. [21] på patienter med knäartros, angående utvärderingen av effekten av Uncaria gujanensis vid behandling av denna sjukdom, visade inga förändringar i hematokrit, hemoglobinnivå, såväl som värdet för erytrocytsedimentationshastighet (ESR) jämfört med en grupp av patienter som får placebo. Ändå är ytterligare studier på större mänskliga kohorter nödvändiga för att utesluta möjligheten till eliminering av prematurerytrocyterfrån cirkulationen av människor som exponeras för Uncaria-arter. Våra tidigare studier har visat att etanol- och vattenextrakt från bladen och barken av U. tomentosa även vid en mycket hög koncentration av 500 ug/ml inte var toxiska för erytrocyterna. Vi har också observerat att de studerade extrakten lindrade hemoglobinoxidation och lipidperoxidation samt minskade ROS-bildning och hemolys inducerad av ett toxiskt ämne 24-diklorfenol (2,4-DCP)[17]. Dessutom fann vi en skyddande effekt av U. tomentosa-extrakt på aktiviteten av katalas i humana erytrocyter inkuberade med 2,4-DCP och katekol [22].

Den fysiologiska koncentrationen av växtpolyfenoler är svår att bedöma. I litteraturen ges vanligtvis information om rekommenderade doser av preparat eller koncentrationer av testade föreningar (för människor 210-500 mg/dag eller för djur 350-500 mg/kg kroppsmassa) [23,24 ].

Vissa av föreningarna absorberas utan att ändra form, medan andra, särskilt i form av glukosider, under absorption berövas hela eller en del av sockerrester. Tarmfloran deltar också i omvandlingen av växtpolyfenoler.

Det mesta av den absorberade dosen utsöndras från kroppen via urin och avföring. Det uppskattas att inte mer än 10-20 procent av den intagna dosen av quercetin och isoflavoner (genistein och daidzein) detekteras i plasma efter 1-3 timmars administrering. Antocyaniner anses vara mindre effektivt absorberade - deras absorption uppskattas till 1-2 procent av den initiala dosen [25]

Oxidativ stress uppstår när nivån av ROS i en cell överväldigar cellensantioxidantförsvarssystem. Röda blodkroppar är särskilt mottagliga för oxidativ stress på grund av det höga innehållet av fleromättade fettsyror som finns i deras membran och autooxidationen av hemoglobin. Det mänskliga erytrocytmembranet är sammansatt av mättade fettsyror, enkelomättade fettsyror, fleromättade fettsyror och långkedjiga N-3 fleromättade fettsyror [26]. Oxidationsmedel ändrar membranstyvhet, ändrar membrandipolpotential och orsakar bildandet av spektrin-hemoglobinkomplex [27]. För att klara av oxidativ stress är erytrocyterna utrustade med ett specialiserat cytoskelett som ger den mekaniska stabilitet och flexibilitet som krävs för att motstå krafter som uppstår under cirkulationen. Erytrocytmembranet består av ett lipiddubbelskikt, transmembranproteiner och ett filamentöst nätverk av proteiner (såsom spektrin, F-aktin, protein 4.1 och aktinbindande proteindomän, adducin, tropomyosin och tropomodulin) som bildar ett membranskelett längs hela den cytoplasmatiska ytan av deras membran [28]. ROS är också kapabla att inducera eryptos genom förändringar i membranfosfatidylserin (PS) translokation [29]. Oxidativ stress kan också leda till utmattning av cellulära reduktiva komponenter och orsaka strukturella och funktionella förändringar i membranet av röda blodkroppar: nedbrytning av fosfatidylserin och sialinsyra, som är huvudkomponenterna som etablerar den negativa laddningen på utsidan av membranet [30].

Det har bevisats att polyfenoler isolerade från U.tomentosa uppvisar mycket starka antioxidativa egenskaper. Flera rapporter har visat att vattenhaltiga och metanoliska extrakt erhållna från olika delar av U. tomentosa skyddade celler från produktion av fria radikaler och lipidperoxidation in vitro, samt hämmade fria radikaler-inducerade DNA-skador och celldöd [2,3,31]. I vår tidigare studie visade vi också att UI.tomentosa-extrakt under fysiologiska förhållanden skyddade erytrocyter mot ROS-bildning och hemolys. Dessutom visade vi att etanolextrakt från .tomentosa uppvisade de starkaste skyddseffekterna [17].

För att ta reda på om de testade föreningarna kan penetrera membranet (och på vilket djup de är lokaliserade) utvärderades erytrocytmembranets fluiditet. Många fysikaliska och kemiska faktorer påverkar membranfluiditeten[32,33]. Kemiska medel inkluderar xenobiotika som orsakar lipid- och proteinoxidation och de föreningar som interkalerar

in i membranet [34,35]. Införlivandet av främmande föreningar i membranstrukturen kan störa arrangemanget av dess element, vilket vanligtvis resulterar i en förändring i membranfluiditeten. Förändringar i membranfluiditeten kan leda till erytrocytdysfunktion såväl som till förändringar i erytrocytens reologiska egenskaper [36]. Å andra sidan kan de ämnen med antioxidantegenskaper som har förmåga att penetrera membranet uppvisa en skyddande roll mot cellen [37]. Därför, för att klargöra om föreningarna som ingår i U.tomentosa-extrakt kan byggas in i det inre eller/och yttre membranbladet, utvärderade vi förändringar i membranfluiditet på dess olika nivåer samt utvärderade osmotisk resistens och inre viskositet hos erytrocyter. Vi valde relativt höga koncentrationer (men inte toxiska som visats i tidigare studier) av de testade extrakten för att observera potentiella förändringar i de studerade parametrarna samt för att bestämma platsen för extraktkomponenterna i erytrocytmembranet.

2. Resultat

2.1.Membranfluiditet

2.1.1. Beställningsparameter S

Efter 2 timmar och 24 timmars inkubation av erytrocyterna med vattenhaltiga och etanoliska extrakt från bark och löv, noterades statistiskt signifikanta förändringar i ordningsparametern S. Figur 1 visar genomsnitts- och standardavvikelsevärdena för fyra (2 timmars inkubation) och fem( 24 timmars inkubation) oberoende experiment. Efter 2 timmars inkubation orsakade alla extrakt som studerats vid 500 ug/mL en ökning av ordningsparametern S i humana röda blodkroppar. Efter 24 timmars inkubation noterades statistiskt signifikanta förändringar i den studerade parametern både vid 250 ug/mL och 500 ug /ml av alla undersökta extrakt.

2.1.2. Korrelationstid TB och Tid TC

Efter 2 timmars inkubation observerades statistiskt signifikanta förändringar för korrelationstiden TB och tiden tc för erytrocyterna behandlade endast med etanolextrakt vid 500 ug/ml. Efter 24 timmars inkubation observerades inga statistiskt signifikanta förändringar i tid till och tid Tc i röda blodkroppar behandlade med något testat extrakt (tabell 1).

2.2. Röda blodkroppars inre viskositet

Efter 2 timmar och 24 timmars inkubation av röda blodkroppar med vatten och etanolextrakt från barken och bladen i koncentrationerna från 100 till 500 ug/ml observerades inga statistiskt signifikanta förändringar i den relativa viskositeten av erytrocyternas inre (Figur 2) . Graferna visar medel- och standardavvikelsevärdena för fyra (2 timmar) och fem (24 timmar) oberoende experiment.

Det måste noteras att efter 2 timmar, och särskilt efter 24 timmars inkubation av erytrocyterna med etanolextrakt från barken, kunde en tendens till ökad viskositet av erytrocytinternum observeras (resultaten var inte statistiskt signifikanta) (Figur 2) .

2.3. Osmotisk bräcklighet

Inkubation av erytrocyterna med vattenhaltiga och etanoliska extrakt från barken och bladen vid en koncentration av 100 ug/L utfördes under 2 timmar, 5 timmar och 24 timmar. Det osmotiska resistansdiagrammet (Figur 3) visar medelresultaten för 5 oberoende experiment för varje inkubationstid. För läsbarheten av diagrammet plottades inga standardavvikelser. IC5o-plotterna (Figur 4) visar de beräknade medelvärdena och standardavvikelsen för 5 oberoende experiment för varje inkubationstid.

Efter 2 timmars inkubation av erytrocyterna med de testade extrakten observerades inga förändringar i den osmotiska känsligheten hos dessa celler, och därför observerades förändringar i ICs 0 parametervärden (figur 3 och 4). Det noterades också att de testade extrakten efter 5 timmars inkubation ökade den osmotiska känsligheten hos humana erytrocyter. Förutom det vattenhaltiga bladextraktet, de andra extrakten sensibiliserade röda blodkroppar för skador genom osmotisk stress. Erytrocyterna inkuberade med de studerade extrakten genomgick hemolys vid högre NaCl-koncentrationer jämfört med kontroll-RBC (Figur 3). En ökning av IC50-parametervärdena var också statistiskt signifikant för erytrocyterna inkuberade i 5 timmar med vattenhaltiga och etanoliska barkextrakt och etanoliskt bladextrakt (Figur 4). Efter 24 timmars inkubation noterades större känslighet för osmotisk stress i erytrocyterna som behandlats med alla testade extrakt jämfört med

kontrollera RBC (Figur 3). På liknande sätt noterades en statistiskt signifikant ökning av ICs-värden i erytrocyterna inkuberade med alla studerade extrakt från U. tomentosa (Figur 4).

3. Diskussion

En tidigare studie visade att extrakt av U.tomentosa förändrade morfologin hos mänskliga erytrocyter [19]. Bildandet av schistocyter hittades, vilket indikerade införlivandet av extraktens komponenter i det yttre monoskiktet av erytrocytmembranet[38,39]. En annan studie visade att föreningarna i U. tomentosa-extrakt hämmade hemoglobinläckage (hemolys) troligen genom att försegla cellmembranet [17]. En av egenskaperna hos det biologiska membranet, som är ett resultat av dess struktur och interaktion mellan dess komponenter, är membranfluiditet. Membranets fluiditet är omvänt proportionell mot dess viskositet.

Med hjälp av paramagnetisk resonansspektroskopi (EPR) bestämdes fluiditeten hos erytrocytmembran inkuberad med etanol och vattenhaltiga extrakt från bark och löv vid två nivåer av 5 och 16 kolatomer i fettsyraresten.

Baserat på de EPR-spektra som erhölls för 5-doxy-stearinsyraspintaggen (5-DSA), beräknades S-ordningsparametern, vilket gav information om fluiditetsförändringarna vid nivån av 5 kolatomer av fettsyraresten. För beställningsparametern S observerades en statistiskt signifikant ökning av dess värde efter inkubation av erytrocyter med etanol och vattenextrakt från bark och blad av U. tomentosa, vilket visade

en minskning av membranfluiditeten vid nivån av 5 kolatomer i en fettsyrarest. En statistiskt signifikant ökning av parametern S observerades efter 2-h inkubation av erytrocyter med etanolextrakt från barken samt vatten och etanolextrakt från löv vid 250 ug/mL och 500 ug/mL, medan vattenextrakt från barken endast vid 500 ug/ml orsakade förändringar i den diskuterande parametern (Figur 1A). Förlängning av inkubationstiden upp till 24 timmar orsakade en statistiskt signifikant ökning av S-parametern i erytrocyterna inkuberade med alla studerade extrakt från deras koncentration på 250 ug/ml (Figur 1B). Minskningen av membranfluiditet vid nivån av 5 kolatomer i en fettsyrarest kan ha kopplats till effekten av polyfenoler på strukturen av plasmamembranet som beskrivs av Duchnowicz et al.[40]. Forskning av Koren et al.[37] antydde en gynnsam effekt av polyfenoler på den totala antioxidantkapaciteten i blodet, särskilt i erytrocyterna. De postulerade att cirkulerande erytrocyter och möjligen andra blodkroppar ständigt kan beläggas med polyfenoler från kompletterade näringsämnen, som fungerar som antioxidantdepåer och därmed kan uppträda som skydd mot de skadliga konsekvenserna av oxidativ stress. Polyfenoliska föreningar som bestäms i U. tomentosa klassificeras som sekundära metaboliter som har en positiv effekt på människokroppen. De uppvisar antioxidantaktivitet, kelatmetalljoner (järn, koppar) och stödjer antioxidativa enzymaktiviteter. Den skyddande effekten av polyfenoler på människokroppen är främst förknippad med cellskydd mot oxidativ stress, vilket kan vara förknippat med att förhindra utvecklingen av olika sjukdomar, inklusive åderförkalkning eller cancer [41,42]. Forskning utförd av Heitzman et al. [43] såväl som vår studie[17] visade närvaron av polyfenoler i extrakt av U.tomentosa. Författarna, genom att analysera olika extrakt, bestämde det högsta innehållet av polyfenoler i etanolextraktet från barken och det lägsta i det vattenhaltiga extraktet från bladen. Fenoliska föreningar närvarande i Ul. tomentosa representeras mestadels av tanniner, flavonolderivat, katekiner, tanniner (inklusive katekiner och epikatekiner) och procyanidiner. Polyfenoler har på grund av sin struktur olika vattenlöslighet, men de löser sig alla bra i organiska lösningsmedel. Därför har etanolextrakt från växter vanligtvis en mer varierad sammansättning och en högre koncentration av polyfenoler än vattenhaltiga extrakt.

I fallet med 16-doxylstearinsyraspintaggen (16-DSA) bestämdes två korrelationstider T och tc. Efter inkubation av erytrocyter i 2 timmar med etanolextrakt från barken vid en koncentration av 500 ug/ml observerades en ökning av korrelationstiden tp och tiden Tc. Inga statistiskt signifikanta förändringar i dessa parametrar noterades dock efter 24 timmars inkubation. Andra testade extrakt orsakade inte statistiskt signifikanta förändringar i TB-korrelationstid både efter 2 timmar och 24 timmars inkubation. En uppåtgående trend för denna parameter visades i erytrocyter inkuberade (särskilt under 24 timmar) med alla studerade extrakt vid 500 ug/ml (tabell 1). En ökning av korrelationstiderna tB och tc indikerar en förstyvning av filmen vid nivån av 16 kolatomer av fettsyraresten. Inga förändringar efter 24 timmars inkubation tyder dock på att detta är en tillfällig effekt som orsakas av komponenterna i extraktet, som initialt införlivas i membranet, men efter en längre inkubationstid avlägsnas de utanför cellen. Sådana effekter av polyfenoler beskrevs i studien av Tarahovsky et al. [44]. Dessa författare föreslog att flavonoider penetrerade det hydrofoba stället i lipiddubbelskiktet, särskilt in i de avdelningar som kallas lipidflottar, eller in i hydrofoba proteinfickor. Flavonoider efter komplexbildning med metaller har fortfarande den antioxidativa potentialen, medan deras lipofilicitet kan öka, vilket underlättar skyddet av membranlipider mot oxidation.

Vi föreslår att polyfenoler från barkextraktet av U. tomentosa inte bara penetrerade djupare nivåer av erytrocytmembranet utan också överfördes inuti cellen, vilket bekräftades av ökningen av RBCs inre viskositet. En av nyckelparametrarna som påverkar erytrocyternas deformerbarhet är deras inre viskositet [45]. I denna studie utvärderades förändringar i erytrocytviskositet med spinmarkörer. Det fanns inga statistiskt signifikanta förändringar i den relativa viskositeten för erytrocyter behandlade med vattenextrakt från U.tomentosa både efter 2-h och 24-h inkubation, medan etanolextrakt inducerade förändringar i den diskuterande parametern (Figur 2). Detta kan tyda på att polyfenoler ingår i mycket

högre koncentrationer i etanolextrakt penetrerade intensivt RBC-membranet och orsakade förändringar i viskositeten i erytrocytens inre. Erytrocyter inkuberade med vattenextrakt kunde lätt kompensera för förändringar i deras viskositet, som framkallades av lägre koncentrationer av polyfenoliska ämnen (Figur 6).

Det bör dock betonas att placeringen av polyfenoler i de djupare lagren av cellmembranet, och följaktligen deras penetration in i cellen med samtidig störning av RBC-viskositeten, kan inträffa endast vid en mycket hög koncentration av dessa ämnen som inte finns. i människokroppen även efter terapeutisk behandling med U. tomentosa-extrakt. Vid låga koncentrationer är polyfenoler huvudsakligen belägna i det yttre monoskiktet, vilket framgår av förändringar i värdet på parametern S. Förändringar i erytrocyternas inre viskositet kan vara förknippade med en förändring i formen på erytrocyterna. Detta indikerades av förändringar i parametern forward scatter channel (FSC) erhållen från flödescytometrisk analys och foton erhållna från en faskontrast mikroskopisk undersökning [19]. Bildandet av schistocyter kan vara resultatet av placeringen av polyfenoler närvarande i U. tomentosa-extrakt både i den hydrofila regionen och i den hydrofoba regionen av det yttre cellmembranmonoskiktet, vilket föreslås av ändringar i ordningsparametern S och korrelationstiderna tB och Tc. Förändringar i formen av röda blodkroppar kan vara förknippade med vattenförlust och ökningen av viskositeten inuti cellerna. Dessutom kan de bero på en minskning av det osmotiska motståndet hos erytrocyterna. Placering av förändrade erytrocyter i en isotonisk NaCl-lösning kan leda till snabbare cellys (jämfört med kontrollceller) på grund av den ökade effekten av vatten och en begränsad möjlighet till deformation av erytrocytmembranet och därför förändringar av cellformen.

Resultaten visade att beroende på inkubationstiden kan extrakten från U, tomentosa ha olika inverkan på plasmamembranets fluiditet och erytrocyternas osmotiska motstånd.

Osmotisk resistens hos erytrocyter är en parameter som indikerar känsligheten hos RBC för verkan av en hypoton miljö. Genom exponeringen av erytrocyterna för den isotoniska miljön kan en liten osmotisk rörelse av vatten i cellmembranet observeras, vilket inte ändrar cellens volym och form. I fallet med en hypoton miljö kommer vatten in i cellen, vilket gör att dess volym ökar, samt ändrar formen från en tvåkonkav skiva till en sfärliknande form. Celler kan bara öka sin volym i viss utsträckning. Ytterligare ökning av en volym resulterar i en störning av cellmembranintegriteten och frisättning av cellinnehåll av osmotisk Ivsis. Efter en 2-hs inkubation av erytrocyter med extrakt från U.tomentosa, inga förändringar i osmotisk känslighet hos RBC (figurer) 3 och 4), såväl som förändringar i IC50-parametern, observerades. Efter 24-h inkubation observerades emellertid större osmotisk känslighet hos erytrocyter och således noterades en ökning av ICso-värdet mot kontrollen (figurerna 3 och 4). Starkare effekter observerades efter inkubation av erytrocyter med etanolextrakt jämfört med vattenhaltiga extrakt. Detta beror förmodligen på att etanolextrakt har fler polyfenolföreningar och tanniner [17]. Liknande förändringar (en ökning av IC50-värdet) efter längre inkubationstid (90 min vid 37 grader) av erytrocyter med katekiner observerades av Naparlo et al. [46]. Dessa författare föreslog att katekiner troligen under långvarig inkubation tas upp av erytrocyter, vilket kan leda till en ökning av osmolariteten i cellens inre, och därmed lättare hemolys i hypotona lösningar på grund av en större skillnad i osmolaritet mellan cellens inre och yttre. Den andra förklaringen till sådana förändringar var ett förslag om att katekiner genererar ROS under långvarig inkubation, t.ex. väteperoxid, vilket kan skada erytrocytmembranet och öka dess skörhet, inklusive osmotisk skörhet.

Placeringen av föreningarna på nivån 5 kol i erytrocytfettsyrakedjan resulterade i en ökad osmotisk känslighet hos dessa celler (förskjutning av osmotiska motståndskurvor mot högre NaCl-koncentrationsvärden, ökning av IC50-värden). I tidigare experiment utförda av Bors et al. [17] under isotoniska förhållanden (0,9 procent NaCl), inhiberade U.tomentosa-extrakt hemolys inducerad av giftiga ämnen, såsom 2,4-DCP och katekol. Dessa forskare visade också den skyddande rollen av U. tomentosa-extrakt mot den oxidativa verkan av 2,4-DCP i humana erytrocyter, vilket manifesteras i att minska methemoglobin- och ROS-nivåerna. Därmed är den slutliga effekten av extrakten i kroppen troligen positiv. I in vivo-systemet införlivas extrakt från U. tomentosa (vid låga koncentrationer) i membranet (utan att störa dess struktur) och uppvisar antioxidantskyddande egenskaper [12,47]. Resultaten av studierna på råttor såväl som på friska frivilliga som administrerades U.tomentosa visade inga förändringar i membranet av röda blodkroppar eller andra förändringar i erytrocyterna, vilket uteslöt möjligheten till för tidigt avlägsnande av dessa celler från cirkulationen [ 20,48].

Vi hävdar att bindningen av polyfenoler till erytrocytytan kan vara ansvarig för deras skyddande egenskaper (observerat i tidigare studier). Polyfenoler, som är de oftast representerade i extrakt från U.tomentosa, kan interagera direkt med biologiska membran, och de fungerar också som rensare av fria radikaler och hämmare av lipidperoxidation, vilket ökar cellresistensen mot oxidativ skada. Detta bekräftades av den senaste forskningen på bioaktiva membran. Kim et al.[49] tillsatt U. tomentosa-extrakt i processen med nanostrukturerad alginatmembranformulering för att förbättra dess biologiska aktiviteter. Författarna visade att membraninnehållande komponenter från U. tomentosa hade en utmärkt antioxidantaktivitet, som visade nästan 100 procent av reduktionskapaciteten för fria radikaler på 15 minuter.

Begränsningen av denna studie är en brist på utvärdering av effekten av testade extrakt på fettsyrasammansättningen i erytrocytmembranet. Mänskligt erytrocytmembran består av mättade fettsyror (palmitinsyra, stearinsyra), enkelomättade fettsyror (palmitolsyra, vaccensyra, cis-oljesyra, transoljesyra), fleromättade fettsyror (cis-linolsyra, transinolensyra, linolensyra, eikosatriensyra) och långkedjiga N-3 fleromättade fettsyror (eikosapentaensyra, docosahexaensyra).

I denna studie applicerades emellertid extrakten på erytrocyter erhållna från friska donatorer. Således kan det antas att lipidsammansättningen av erytrocytmembranet är typisk för normala celler [26]. Eftersom mänskliga mogna erytrocyter inte har en kärna, syntetiserar de inte cellulära komponenter, inklusive fettsyror. Av denna anledning bör lipidsammansättningen inte förändras i motsats till in vivo-studier: vid skivepitelcancer i huden [26] eller under tillskott [50,51]. Flip-flop-processen, lipidoxidation, förändring av interaktioner i lipiddomänerna och deras fördelning är möjliga, men eftersom lipidbiosyntes i erytrocyter inte inträffar tillsätts den kvalitativa och kvantitativa sammansättningen av erytrocytmembranlipiderna under påverkan av testade extrakt in vitro är mycket osannolikt att inträffa.

Sammanfattningsvis är extrakten av U. tomentosa huvudsakligen tillfälligt inkorporerade i membranet, och exakt i dess yttre monolager. Men vid mycket höga koncentrationer kan de tränga djupare in i membranet och i slutändan förändra erytrocyternas viskositet. Baserat på de erhållna resultaten samt litteraturdata anser vi att fysiologiskt låga koncentrationer av föreningarna som ingår i extrakt från U.tomentosa kommer att finnas i det yttre monoskiktet av cellmembranet och kommer att skydda erytrocyter mot oxidativ stress och skada.

4. Material och metoder

4.1. Kemikalier

5-Doxylstearinsyra (5-DSA),16-doxylstearinsyra (16-DSA),4-hydroxi-2,2,6,{{ 8}}tetrametylpiperidin-1-oxyl(TEMPOL) köptes från Sigma-Aldrich, Saint Louis, MI, USA. Andra kemikalier erhölls från Roth, Karlsruhe, Tyskland och Avantor Performance Materials Poland, Gliwice, Polen.

4.2.Biologiskt material

4.2.1. Anläggning

Råmaterialet (bark och löv) från U. fomentosa härrörde från Instituto Peruano de Investigaciones Fitoterapia Andina i Lima, Peru, vänligen levererat av Wilcaccora

Lomianki Centre, Polen. De allmänna egenskaperna hos detta material har beskrivits tidigare av Pilarski et al. [3].

Verifikationsmaterialet deponerades på Laboratory of Phytochemistry, Institute of Bioorganic Chemistry, Polska vetenskapsakademin, Poznan, Polen.

Beredning av prover: ett gram av råmaterialet (bark och löv) av U.tomentosa extraherades med en volym av 10 ml vatten eller 96 procent etanol vid 37 grader i 8 timmar. Därefter centrifugerades extrakten vid 4000 rpm under 15 min. Supernatanter indunstades med Speed-Vac till torr massa och torkades därefter med P2O5. Vid dessa betingelser täcktes cirka 111 mg preparat per gram bark och cirka 158 mg preparat per gram löv i fallet med vattenextraktion. Vid extraktion med 96 procent etanol uppnåddes 123 mg preparat per gram bark och 158 mg preparat per gram löv. Fyra extrakt erhölls, dvs etanolextrakt från barken (Bet), vattenhaltigt extrakt från barken (Bag), etanolextrakt från löv (Let), ett vattenhaltigt extrakt från löv (Lag). Preparat i pulverform förvarades i ett kylskåp i tättslutna behållare, från vilka stamlösningar bereddes för varje experiment [19].

Den kvalitativa och kvantitativa sammansättningen av oxindolalkaloider i U. tomentosa-extrakten bestämdes med hjälp av HPLC-fingeravtrycksanalys. De allmänna egenskaperna hos de kvantitativa alkaloiderna i detta material beskrevs tidigare av oss i publikationen av Bors et al. [18].

Unkarin F, speciofyllin, mitrafyllin, pteropodin/isomitrafyllin och isopteropodin detekterades i U. tomentosa-extrakt. Mitrafyllin och pteropodin/isomitrafyllin är alkaloider, som är dominerande i bladextrakt, medan pteropodin/isomitrafyllin är dominerande i barkextrakt. Etanolextrakt kännetecknades av en högre alkaloidhalt än vattenhaltiga extrakt (Figur 5).

De allmänna egenskaperna hos den kvantitativa bestämningen av polyfenoler i U. tomentosa-extrakt beskrevs tidigare av oss [17]. HPLC/DAD-analys visade att etanol- och vattenextrakt av bark huvudsakligen innehöll procyanidin B2 och C1 samt (-)-epicatekin. Koffeinsyraderivat bestämdes endast i vattenhaltiga extrakt från löv, medan klorogensyra, flavonoler och polymera proantocyanidiner ingick i alla studerade extrakt. De högsta totala koncentrationerna av fria fenoler bestämdes i etanolextrakten från barken. Den höga halten av fenolföreningar detekterades också i etanolextraktet från löv, medan lägre fenolhalt detekterades i ett vattenhaltigt extrakt från barken och etanolextrakt från löv (Figur 6).

Slutligen löstes alla extrakt i dimetylsulfoxid (DMSO). Den erhållna lösningen tillsattes i en liten volym av 1 μL till 1 mL erytrocytsuspension (DMSO-koncentrationen påverkade inte cellmembranet). Erytrocyterna kompletterade endast med DMSO användes som kontroller.

4.2.2.Isolering av erytrocyter

En leukocyt-buffy coat erhölls från blod som samlats in i Blood Bank i Lodz, Polen. Den leukocytbuffiga beläggningen centrifugerades (3000 rpm under 10 min vid 4 grader) och tvättades två gånger med fosfatbuffrad saltlösning (pH 7,4).

Isolerade erytrocyter suspenderade i PBS inkuberades i 2, 5 och 24 timmar med fyra typer av extrakt (etanoliska och vattenhaltiga extrakt från barken och etanoliska och vattenhaltiga extrakt från bladen) i koncentrationerna 100 ug/mL, 250 ug/mL och 500 ug/mL. Tidigare studier har visat att de studerade extrakten vid dessa koncentrationer inte orsakade skador på erytrocyter, samtidigt som de uppvisade en skyddande effekt på RBC [17,19,22].

4.3. Membranfluiditet

Fluiditeten hos erytrocytmembranet bestämdes med hjälp av elektronparamagnetisk resonans(EPR)-spektroskopi (Brucker 300 Spectrometer, Tyskland) med användning av 5-doxylstearinsyra (5-DSA) och 16-doxylstearinsyra ( 16-DSA)snurretiketter. Från EPR-spektra erhållna för 5-DSA-spin-etiketten beräknades beställningsparametern S. Korrelationstiderna TB och TC beräknades från EPR-spektra som erhölls för 16-DSA-spin-etiketten. Ordningsparametern Sas samt korrelationstiderna TB och tc visar den omvända korrelationen med membranfluiditet. Ordningsparameter S och korrelationstiderna tB och tc beräknades enligt beskrivningen i studien av Koter et al. [52].

4.4. Röda blodkroppars inre viskositet

TEMPOL spin-etiketten användes för att bestämma erytrocyternas inre viskositet [53]. TEMPOL-lösning (20 mM) löst i buffrad saltlösning (PBS) sattes till erytrocytsuspensionen med 50 procent hematokrit. Efter en 30- min inkubation tvättades erytrocyterna tre gånger med 80 mM K3Fe(CN6-lösning för att reducera signalen från spin-etiketten i det intercellulära utrymmet. Baserat på det spektrum som erhållits för TEMPOL i vatten och i erytrocyter rotationskorrelationstiden bestämdes enligt formeln:

-(2)"-1

(1)

där: k—konstant för nitroxidspinnetiketten, k=6.5×10-9s mT-l, ho—höjden på mittlinjen, h_1—höjden på hög- fältlinje, Wo—mittlinjebredd.

Den relativa viskositeten bestämdes från formeln:

TR

_C

(2)"1 B

där: TR—rotationskorrelationstid för markören i erytrocyter, TB—rotationskorrelationstid för markören i PBS, c—intern viskositet av erytrocyter,1B—PBS viskositet (värde 1 antogs).

4.5. Osmotisk bräcklighet

Efter inkubation av erytrocyterna med extrakt från U. tomentosa, centrifugerades cellerna vid 3000rpm i 10 minuter vid 4 grader. Cellerna tvättades sedan med 0,9% NaCl-lösning. Detta steg upprepades två gånger. Efter avlägsnande av supernatanten suspenderades RBC i en NaCl-lösning i koncentrationsintervallet från 0,2 till 0,9 procent (15 punkter valdes). Cellerna inkuberades i 30 minuter vid 37 grader och centrifugerades sedan vid 3000 rpm i 10 minuter vid 4 grader C. Den optiska densiteten hos supernatanten mättes vid 540 nm (Adobe) med användning av en absorbansläsare för mikroplattor (BioTek Elx808, BIOTEK).

Hemolys i varje rör uttrycktes som en procentandel, med hemolys i destillerat vatten som 100 procent (A100 procent):

×100 (3)

Hemolysprocent (procent o)= Aole

A100

4.6. Statistisk analys

Resultaten presenterades som medelvärde ± SD uppnått från 4 till 6 individuella experiment (4-6 blodgivare), medan experimentpunkten för varje individ (givare) var ett medelvärde av 2-3 replikationer. Flera jämförelser mellan gruppmedelskillnader analyserades genom envägsvariansanalys (ANOVA) följt av Tukey post hoc-test. Skillnaderna ansågs statistiskt signifikanta för p<0.05. all="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" statistica="" software(statsoft,="" inc,="" tulsa,="" va,="">

Referenser

1. de Azevedo, BC; Roxo, M.; Borges, MC; Peixoto, H.; Crevelin, EJ; Bertoni, BW; Contini, SH; Lopes, AA; França, SC; Pereira, AM; et al. Antioxidantaktivitet av ett vattenhaltigt bladextrakt från Uncaria tomentosa och dess viktigaste alkaloider Mitra fyllin och isomitrafyllin i Caenorhabditis elegans. Molecules 2019, 24, 3299. [CrossRef]

2. Navarro, M.; Arnaez, E.; Moreira, I.; Hurtado, A.; Monge, D.; Monagas, M. Polyfenolisk sammansättning och antioxidantaktivitet hos Uncaria tomentosa kommersiella barkprodukter. Antioxidanter 2019, 8, 339. [CrossRef]

3. Pilarski, R.; Zieli 'nski, H.; Ciesiołka, D.; Gulewicz, K. Antioxidantaktivitet av etanol- och vattenextrakt av Uncaria tomentosa (Willd.) DC. J. Etnopharmacol. 2006, 104, 18–23. [CrossRef]

4. Santo, GD; Grotto, A.; Boligon, AA; Da Costa, B.; Rambo, CL; Fantini, EA; Sauer, E.; Lazzarotto, LMV; Bertoncello, KT; Júnior, OT; et al. Skyddande effekt av Uncaria tomentosa-extrakt mot oxidativ stress och genotoxicitet inducerad av glyphosat Roundup med zebrafisk (Danio rerio) som modell. Environ. Sci. Förorena. Res. Int. 2018, 25, 11703–11715. [CrossRef]

5. Allen-Hall, L.; Arnason, JT; Cano, P.; Lafrenie, RM Uncaria tomentosa fungerar som en potent TNF-alfa-hämmare genom NF-kappaB. J. Etnopharmacol. 2010, 127, 685–693. [CrossRef]

6. Elgawish, RA; Abdelrazek, HMA; Ismail, SAA; Loutfy, NM; Soliman, MTA Hepatoskyddande aktivitet av Uncaria tomentosa-extrakt mot subkronisk exponering för fipronil hos hanråttor. Environ. Sci. Förorena. Res. Int. 2019, 26, 199–207. [CrossRef]

7. Ciani, F.; Tafuri, S.; Troiano, A.; Cimmino, A.; Fioretto, BS; Guarino, AM; Pollice, A.; Vivo, M.; Evidente, A.; Carotenuto, D.; et al. Anti-proliferativa och pro-apoptotiska effekter av Uncaria tomentosa vattenhaltigt extrakt i skivepitelcancerceller. J. Etnopharmacol. 2018, 211, 285–294. [CrossRef]

8. Zari, A.; Alfarteesh, H.; Buckner, C.; Lafreniere, RM Behandling med Uncaria tomentosa främjar apoptos i B16-BL6 musmelanomceller och hämmar tillväxten av B16-BL6-tumörer. Molecules 2021, 26, 1066. [CrossRef] [PubMed]

9. Ko´smider, A.; Czepielewska, E.; Kura´s, M.; Gulewicz, K.; Pietrzak, W.; Nowak, R.; Nowicka, G. Uncaria tomentosa Bladavkok modulerar annorlunda ROS-produktion i cancer och normala celler och effekter Cisplatincytotoxicitet. Molecules 2017, 22, 620. [CrossRef] [PubMed]

10. Almeida, IV; Soares, LC; Lucio, FT; Cantagalli, LB; Återanvändning, AF; Vicentini, VEP Kemoterapeutiska effekter av örtmedicinen Uncaria tomentosa (Willd.) DC. Genet. Mol. Res. 2017, 16. [CrossRef] [PubMed]

11. Caon, T.; Kaiser, S.; Feltrin, C.; de Carvalho, A.; Sincero, TCM; Ortega, GG; Simões, CMO Antimutagena och antiherpetiska aktiviteter av olika preparat från Uncaria tomentosa (kattklo). Food Chem. Toxicol. 2014, 66, 30–35. [CrossRef] [PubMed]

12. Batiha, GE-S.; Magdy Beshbishy, ​​A.; Wasef, L.; Elewa, YHA; Abd El-Hack, ME; Taha, AE; Al-Sagheer, AA; Devkota, HP; Tufarelli, V. Uncaria tomentosa (Willd. ex Schult.) DC.: En översyn av kemiska beståndsdelar och biologiska aktiviteter. Appl. Sci. 2020, 10, 2668. [CrossRef]

13. Santos Araújo, MdC; Farias, IL; Gutierres, J.; Dalmora, SL; Flores, N.; Farias, J.; de Cruz, I.; Chiesa, J.; Morsch, VM; Chitolina Schetinger, MR Uncaria tomentosa-Adjuvansbehandling för bröstcancer: klinisk prövning. Evid. Baserat komplement. Alternativ. Med. 2012, 2012, 676984. [CrossRef]

14. Navarro Hoyos, M.; Sánchez-Patán, F.; Murillo Masis, R.; Martín-Álvarez, PJ; Zamora Ramirez, W.; Monagas, MJ; Bartolomé, B. Phenolic Assessment of Uncaria tomentosa L. (Cat's Claw): Blad, stjälk, bark och träextrakt. Molecules 2015, 20, 22703–22717. [CrossRef]

15. Farias, I.; do Carmo Araújo, M.; Zimmermann, ES; Dalmora, SL; Benedetti, AL; Alvarez-Silva, M.; Asbahr, ACC; Bertol, G.; Farias, J.; Schetinger, MRC Uncaria tomentosa stimulerar spridningen av myeloida progenitorceller. J. Etnopharmacol. 2011, 137, 856–863. [CrossRef] [PubMed]

16. Yunis-Aguinaga, J.; Claudiano, GS; Marcusso, PF; Manrique, WG; de Moraes, JRE; de Moraes, FR; Fernandes, JBK Uncaria tomentosa ökar tillväxten och immunaktiviteten hos Oreochromis niloticus utmanad med Streptococcus agalactiae. Fisk. Skaldjur Immunol. 2015, 47, 630–638. [CrossRef] [PubMed]

17. Bors, M.; Bukowska, B.; Pilarski, R.; Gulewicz, K.; Oszmia 'nski, J.; Michałowicz, J.; Koter-Michalak, M. Skyddsaktivitet av Uncaria tomentosa-extrakten på mänskliga erytrocyter vid oxidativ stress inducerad av 2,4-diklorfenol (2,4-DCP) och katekol. Food Chem. Toxicol. 2011, 49, 2202–2211. [CrossRef]

18. Bors, M.; Michałowicz, J.; Pilarski, R.; Sici´nska, P.; Gulewicz, K.; Bukowska, B. Studier av biologiska egenskaper hos Uncaria tomentosa-extrakt på mononukleära celler från mänskligt blod. J. Etnopharmacol. 2012, 142, 669–678. [CrossRef]

19. Bors, M.; Sici´nska, P.; Michałowicz, J.; Wieteska, P.; Gulewicz, K.; Bukowska, B. Utvärdering av effekten av Uncaria tomentosa-extrakt på storleken och formen av mänskliga erytrocyter (in vitro). Environ. Toxicol. Pharmacol. 2012, 33, 127–134. [CrossRef] [PubMed]