Kemiska beståndsdelar i bladen på Cistanche Ⅱ

3. Diskussion

Fytokemiska undersökningar för att identifiera biologiskt aktiva föreningar i persimmonblad har utförts i stor utsträckning. Hittills har ett stort antal triterpenoider och flavonoider, inklusive kaempferol och quercetinderivat, rapporterats frånD. kaki[1]. I denna studie fick vi 27 föreningar, inklusive sextonflavonoider, en jonon, två kumariner, sju triterpenoider och en acetofenon. Av dessa sammansatt1 visade sig vara en ny flflavonoid och förening2 först isolerades frånD. kaki. Dessutom kaempferol-3-O- -200 -feruloylglukosid (3) rapporterades endast som en hydrolyserad produkt av 3-O- -(2-O-feruloyl)-glukosyl-7,40 -di-O- -glukosylkaempferol (3), isolerad frånAllium tuberosum[35]. Förening3 erhölls inte bara direkt från en naturlig källa för första gången utan har inte heller rapporterats iD. kakitidigare. Dessutom kaempferol-3-O- -200 -galloylgalaktosid (11) har tidigare rapporterats i många källor, inklusiveD. kaki, men bara1H NMR och MS har rapporterats på grund av bristen på detaljerad forskning. Därav13C NMR-data rapporterades för första gången här.

Hittills har det gjorts få studier som visat den antioxidativa förmågan hos extrakt eller fraktioner av persimonblad [37,38]. De flesta studier använde snabba analysmetoder som DPPH- eller ABTS-analyser. Särskilt i den tidigare uppsatsen, 200µg/ml flavonoidrik fraktion uppvisade 68,73 procent hämning av DPPH-radikal. Bortsett från detta resultat visade emellertid denna fraktion också superoxidanjonradikal rensning, avlägsnande av hydroxylradikaler och metallkelaterande aktiviteter [38]. Även om vi inte utvärderade dessa analyser, utfördes bioassay-styrd isolering eftersom etanolextraktet och etylacetatfraktionen i föreliggande studie visade jämförbar DPPH-radikalfångande aktivitet. Dessutom, trots tidigare resultat, har endast ett fåtal studier för att identifiera biologiskt aktiva föreningar utförts. Några få secoiridoider och lignaner visade radikala rensningsaktiviteter [39]. När det gäller flavonoider har det förekommit flera rapporter om att quercetin, kaempferol och deras glykosider har antioxidativa egenskaper [40]. Antioxidativa egenskaper hos allokerad kaempferolglykosid och allokerad quercetinglykosid erhållen från andra källor har rapporterats [41]. Hittills har det inte funnits några rapporter om att var och en av dessa föreningarsom härrör från persimonbladen har antioxidativa effekter, förutom att en blandning av dessa föreningar uppvisade en antioxidativ effekt [21]. 

Dessutom, hittills, har den samtidiga bestämningen av endast ett fåtal triterpenoider eller flavonoider utförts för kvantitativ analys av dessa föreningar [42,43]. Den föreliggande studien föreslår dock en metod för samtidig bestämning av de flesta komponenterna i persimmonbladen.

Klicka här för att få mer kunskap om hur Cistanche Anti-Aging

4.1. Växtmaterial

Bladen avDiospyros kakiThunb. (Ebenaceae) köptes på en inhemsk koreanörtmarknad i Yeongcheon i mars 2018. Bladen skördades vid bassängområdet omgivet av berg på en höjd av 800–1200 m i Gyeongsangbuk-do i augusti 2017. Den genomsnittliga årliga nederbörden i detta område var 1050 mm,varav hälften föll mellan juni och augusti. Den genomsnittliga årstemperaturen var ca12.5 ◦C och den genomsnittliga relativa luftfuktigheten var 69 procent. Temperaturen vid skördetid varcirka 37–40◦C. De erhållna bladen torkades vid ungefär 45°C◦C i en växttorktumlare. Ett kupongexemplar (DIKA1-2018) har deponerats i Laboratory of NaturalProduct Medicine, College of Pharmacy, Kyung Hee University, Republiken Korea.

4.2. Allmänna experimentella förfaranden

silikagel (ODS-A 12 nm S-150µm, YMC, Tokyo, Japan). Flashkromatografi var perbildad med en CombiFlash (Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA) med förpackade patroner,RediSep-kiseldioxid (12 g, 24 g och 40 g) och RediSep-C18 (13 g, 26 g, 43 g och 130 g). Preparativ HPLC utfördes med användning av Gilson reningssystem (Gilson, Middleton, WI,USA) med en YMC Pack ODS-A-kolonn (250× 20.0 mm, 5,0µm, YMC, Tokyo, Japan), en sfärODS-M80 kolumn (250× 20.0 mm, 4,0µm, YMC, Tokyo, Japan) och en Luna C18(2)kolumn (250× 21,2 mm, 10,0µm, Phenomenex, Torrance, CA, USA). HPLC-analys varutförs på ett Youngin YL9100 HPLC-system innefattande en evaporativ ljusspridningdetektor (Youngin, Anyang, Korea) med Luna C18(2) kolumn (150× 4,6 mm, 5,0µm, Phenomenex, Torrance, CA, USA). Online HPLC-ABTS screening utfördes påett Agilent 1200 HPLC-system med en YMC Pack ODS-A-kolonn (150× 4,6 mm, 5,0µm). Alla lösningsmedel som användes för de kromatografiska separationerna destillerades.

4.3. Extraktion och isolering

Det torkade växtmaterialet (15,0 kg) extraherades med 216 L etanol (EtOH) i envattenbad på 60◦C i 4 timmar, och lösningsmedlet avdunstades för att erhålla EtOH-extrakt (1,2 kg,avkastning 8 procent). Extraktet suspenderades i H2O (2,1 1) och fördelades med etylacetat(EtOAc, 4,9 L× 3) för att ge EtOAc- (321,9 g, utbyte 2,15 procent) och H2O-lösliga skikt (748.0 g,avkastning 4,99 procent ), respektive. Det EtOAc-lösliga skiktet (321,9 g) utsattes för en silikagelkolumn (φ 10.5 × 35,0 cm) medn- exan:EtOAc:metanol (MeOH) blandningar (från 8:1,8:0.2till {{0}}:0:1v/v/vför att ge nio fraktioner (El~E9).

Fraktion E5 (14,2 g) kromatograferades över en Diaion HP-20-kolonn (φ 5.0 × 29,0 cm) med aceton: H2O-gradient (7:3 till 1:0) för att ge sju fraktioner (E5-1~E5-7). Bråk E5-1 varutsattes för en silikagelkolonn medn-hexan:EtOAc: MeOH=7:2,7:0.3 till 0:0:1 för att ge 4 fraktioner(E{{0}}~E5-1-4). E5-1-1 (13,2 mg) och E5-1-2 (7,0 mg) kombinerades och renades genom preparativ(prep)-HPLC med användning av en YMC Pack ODS-A-kolonn (H2O: MeOH=27:23,7 ml/min) för att uppnåföreningar19 (8,3 mg, tR 26.0 min) och20 (2,5 mg, tR 24.0 min).

Fraktion E8 (75,19 g) fraktionerades till acetonlöslig (AS) och acetonolöslig(AIS) fraktioner. Fraktion AS (44,07 g) kromatograferades över en Diaion HP-20 kolonn(φ 6.5 × 12,5 cm) med aceton: H2O-blandningar (3:7 till 1:0) för att ge 12 fraktioner (AS1~AS12).Fraktion AS2 (2,5 g) separerades av en Sephadex LH-20-kolonn (φ 4.7 × 51,0 cm) medMeOH för att ge nio fraktioner (AS2-1~AS2-9). Fraktion AS2-2 (196,3 mg) separerades medflashkromatografi (FC) med en RediSep-C18 patron (26 g, acetonitril: H2O, 0:1 till7:1) för att ge förening17 (28,6 mg). Fraktion AS3 (3,1 g) separerades i 11 fraktioneranvänder en Sephadex LH-20 kolumn (φ 4.7 × 51,0 cm) med MeOH (AS3-1~AS3-11).

FraktionAS{{0}} (0,7 g) separerades av FC med RediSep-C18 (130 g, MeOH:H2O, 1:9 till 3:2) att geföreningar4 (51,8 mg),5 (21,7 mg, tR 42,5 min), och6 (20,2 mg, tR 47.0 min). Fraktion AS4 (8,8 g) utsattes för en silikagelkolonn (φ 5.2 × 21,0 cm) med MC:MeOH:H2O-blandningar (från 8:1,8:0.2 till 7:2.7:0.3) för att isolera föreningar7 (5,0 mg),8 (5,1 mg),9 (20,0 mg), 10 (306.6 mg), och12 (20,1 mg). Fraktion AS5 utsattes för en silikagelkolonn (φ 5.2 × 24,5 cm)med CH2Cl2:MeOH:H2O-blandningar (8:1.8:0.2 till 7:2.7:0.3) för att generera sex fraktioner (AS5-1~AS5-6) för att ge föreningar11 (3.0 mg) och13 (7,4 mg). Fraktion ASIO separeradesi sju fraktioner med hjälp av en Sephadex LH-20 kolumn (φ 3.5 × 50,5 cm) med MeOH (AS10-1~AS10-7). Fraktion AS10-4 separerades av FC med en RediSep-C18 (43 g, MeOH:H2O,

0:1 till 3:2) patron för att rena föreningar1 (5,3 mg),2 (21,4 mg),14 (15,9 mg), och15 (40.4 mg). Fraktion AS12 separerades i fem fraktioner med användning av en Sephadex LH-20 kolumn (φ 3.5 × 50,5 cm) med MeOH (AS12-1~AS12-5). Förening16 (20,1 mg) erhölls genomomkristallisation med MeOH från fraktion AS12-5.

Fraktion Als (31,1 g) kromatograferades silikagelkolonn med h hexan EtOAc: MeOH-blandningar (8:1,8:0.2 till 0:0:1) som en mobil fas för att ge 20 fraktioner (AIS1-AIS2{{20}})Fraktion AlS5 utsattes för en silikagelkolonn med n-hexan:EtOAc:MeOH-blandningar (8:1,8: {{30}}.2 till 0:0:1) för att ge förening 23 (224,7 g). Fraktion AIS6 separerades med FC med en RediSep-C18 (43 g, MeOH:HO, 0:1 till 9:1) patron för att ge förening 25 (25,6 mg) Fraktion AIS7 utsattes för en silikagelkolonn med n -hexan:EtOAc: MeOH-blandningar(8:1,8:0.2 till {{60}}:0:1) för att ge föreningar 24 (10 0,0 mg) och 27 (214,1 mg). Fraktion AIS10 utsattes för en silikagelkolonn med n-hexan:EtOAc:MeOH-blandningar (7:2,7:0,3 till 0:0:1) för att isolera föreningarna 18 (5,0 mg) och 23 (16,7 mg). Fraktion AIS11 separerades i 11 subfraktioner (AIS11-1-AIS11-11) av FC med en RediSep-C18 (130 g, MeOH:HO, 1:1 till 4:1) patron. Förening 22 (37,8 mg) erhölls från fraktion AS11-4 genom prep-HPLC med en sfärkolonn. Fraktion AIS12 utsattes för en silikagelkolonn (5,2 x 28,0 cm) med HCl:acetonblandningar (från 4:1 till 3:2) för att ge förening 21 (188,0 mg). Slutligen separerades fraktionAIS16 med användning av en Lichroprep RP-18-kolonn (1,99 g, MeOH:H2O, 3:2 till 13:7) för att erhålla förening 3 (2,3 mg).

4.3.1. kaempferol-3-O- -D-200 -kumaroylgalaktosid (1

) Gulaktigt pulver; smp 244,5◦C; [ ] 22 D -59.1◦ (c 0.1, MeOH); UV (MeOH)λmax(loggaε207 nm (3,98), 315 nm (3,92); IR (ATR)νmax3458, 2922, 1650, 1588, 1364, 1260, 1175, 1076, 834 cm−1 ; 1H och13C NMR-data, se tabell1; HRMS (positivt läge)m/z 595.1447 [M plus H]plus(beräknat för C30H27O13, 595.1452). 

4.3.2. kaempferol-3-O- -D-200 -feruloylglucosid (3) 

Gulaktigt pulver; smp 225,2◦C; [ ] 22 D -119.6◦ (c 0.1, MeOH); UV (MeOH)λmax(loggaε210 nm (4,17), 327 nm (3,94); IR (ATR)νmax3369, 1652, 1599, 1512, 1360, 1264, 1177, 1076, 841 cm−1 ; 1H och13C NMR-data, se tabell1; HRMS (negativt läge)m/z 623.1375 [M − H]− (beräknat för C31H27O14, 623.1401).

4.3.3. kaempferol-3-0--D-2-galloylgalaktosid (11)

Gult pulver; HNMR (500 MHZ, DMSO-) 6H NMR 8.06 (2H, d,J= 9.0 Hz, H{ {8}}H-6'), 7.02 (2H, S, H-3, H-'), 6,87 (2H, d, I=9 ,5 H, H-, H-5, 6,39 (1H, S, H-8), 6,16(1H s, H-6), 5,78 (1H, d, {{33 }},0 Hz, H-1 procent ),5,27 (1H, t, =9,5 Hz H-2" 13C NMR (125 MHzDMSO-6) {{45 }}.1 (C-4), 165.4 (C-7), 165.4 (C-1), 161.2 (C-5), 160.1 (C{{59} }, 156,3 (C-2),156,3(C-9), 145,5 (C-4"), 145,5 (C-6", 138,4 (C{{74}) }/), 132,5 (C-3), 131,0 (C-2'), 131,0 (C-6), 120,7 (C1), 119,8 (C-2') , 115,2 (C-3'), 115,2 (C-5, 108,9 (C-3), 108,9 (C-7), 103,8 (C-10) , 98,8 (C-6)98,8 (C-1 procent), 93,7 (C-8), 76,0 (C-5), 72,7 (C-3) , 71,1 (C-2 procent), 68,2 (C-4"), 60,1(C-6").

4.4. Oantitativ analys av nio föreningar i persimmonlinserna

HPLC-analys utfördes på ett Waters HPLC-system innefattande 1525 pumpar och 2996 fotodiodmatrisdetektorer (Waters, Milford, MA, USA). UV-våglängden sattes till 260 nm. En PhenomenexLuna C18(2) kolumn (150 x 4,6 mm,5.0 um, Phenomenex, Torrance, USA) användes, och injektionsvolymen var 10 uL. Kolonntemperaturen var inställd på 25 grader. Den mobila fasen bestod av 0,02 procent trifluorättiksyra (TFA, Sigma-AldrichSt. Louis, MO, USA) i vatten (A) och acetonitril (B) med en flödeshastighet av 0,7 ml/min. Gradientförhållandena var följande: 0-30 min, 15-20 procent B; 30-45 min, 20-35 procent B: 45-70 min35-100 procent ; 70-80 min, 100 procent . EtOH-extraktet (10 mg) löstes i 10 ug/ml intern standardlösning (1 ml). Enkel metodvalidering genomfördes för att säkerställa relevansen av den utvecklade metoden och kvalitativa resultat. Fem olika lösningar av varje förening analyserades för att göra varje kalibreringskurva. Intra- och mellandagarnas precision och noggrannhet bekräftades genom tre replikat inom en enda dag och tre på varandra följande dagar. Alla prover filtrerades genom 0,2 um membranfilter.

4.5. DPPH och online HPLC-ABTS-analys

Förmågan hos prover att rensa DPPH-radikaler utvärderades baserat på ett tidigare dokument. Kortfattat blandades DPPH ({{0}},1 mM) i metanol (100 uL) med olika koncentrationer av prover (100 uL) under 1 timme i mörker. Absorbansen registrerades vid 517 nm. Online HPLC-ABTS-analysen utfördes baserat på den tidigare rapporten med modifieringar. En blandad lösning innehållande ABTS (0,08 mM) med kaliumpersulfat (0,12 mM) gjordes till ett ABTS-reagens. Reagenset lagrades vid 4 C i 12 timmar för att stabilisera radikaler. Alla prover analyserades med ett Agilent HPLC-system. Gradientförhållandena var desamma som de som användes för kvantitativ analys. Eluatet skickades till a-funktion och reagerade med ABTS-reagens i en reaktionsspiral vid 40 grader. Kromatogrammet visualiserades vid 254 nm (positiv topp), såväl som vid 734 nm (negativ topp), för att registrera en minskning av aBIS-radikaler

5. Slutsatser Sammanfattningsvis presenterar denna studie en fytokemisk undersökning baserad på bioassay-guided isolering. Som ett resultat, en ny flavonoid, kaempferol-3-0-BD-2"-kumaroylgalaktosid(1), och en ny naturlig förening, kaempferol-3-0--D-2"-feruloylglukosid (2) ), isolerades tillsammans med 25 tidigare kända föreningar, inklusive fjorton flavonoider, en jonon, två kumariner, sju triterpenoider och en acetofenon. Alla föreningar utvärderades antioxidativa effekter, och av dessa visade sig nio flavonoider ha aktiviteter. Samtidig kvantitativ analys utfördes för att bekräfta att persimmonbladen har antioxidativa effekter på grund av dessa föreningar.

Tilläggsmaterial:Följande finns online påhttps://www.mdpi.com/article/10 .3390/plants10102032/s1, Figurer S1–S9: 1H-, 13C-, COSY-, HSQC-, HMBC- och ROESY NMR-, UV-, IR- och HRMS-spektra för förening 1, Figurer S10–S18: 1H, 13C, COSY, HSQC, HMBC, ROESY NMR , UV-, IR- och HRMS-spektra för förening 3, figurer S19–S20: 1H- och 13C NMR-spektra för förening 11, Tabell S1: Den kvantitativa analysen av de andra 18 föreningarna.

Författarbidrag:JK och J.-EP lämnade lika bidrag till denna studie; konceptualisering, H.-CK och D.-SJ; metodik och validering, JK, J.-EP, J.-SL, J.-HL och HH; programvara,JK och J.-SL; validering, JK och HH; formell analys, JK och J.-EP; utredning, JK, J.-EP,J.-SL, J.-HL, HH, S.-HJ, H.-CK och D.-SJ; resurser, H.-CK och D.-SJ; datakurering, JK, J.-EP och J.-SL; skrift—original utkast beredning, JK, J.-EP och J.-SL; skrift—granskning och redigering, H.-CK och D.-SJ; visualisering, JK och J.-SL; handledning, H.-CK och D.-SJ; projektadministration, H.-CK och D.-SJ; finansieringsförvärv, S.-HJ, H.-CK och D.-SJ Alla författare harläst och samtyckt till den publicerade versionen av manuskriptet.

Intressekonflikter:Författarna förklarar ingen intressekonflikt.

Referenser

1. Xie, C.; Xie, Z.; Xu, X; Yang, D. Persimmon (Diospyros kakiL.) lämnar: En recension om traditionella användningar, fytokemi och farmakologiska egenskaper.J. Etnopharmacol.2015, 163, 229–240. [CrossRef]

2. Bei, W.; Zang, L.; Guo, J.; Peng, W.; Xu, A.; Bra, DA; Hu, Y.; Wu, W.; Hu, D.; Zhu, X. Neuroprotektiva effekter av ett standardiserat flflavonoidextrakt frånDiospyros kakilöv.J. Etnopharmacol.2009, 126, 134–142. [CrossRef] [PubMed]

3. Sakanaka, S.; Tachibana, Y.; Okada, Y. Beredning och antioxidantegenskaper hos extrakt av japanskt persimmonbladste (kakinoha-cha).Food Chem.2005, 89, 569–575. [CrossRef] 4. Sa, YS; Kim, S.-J.; Choi, H.-S. Den antikoagulerande fraktionen från bladen påDiospyros kakiL. har en antitrombotisk aktivitet.Båge. Pharmacal Res.2005, 28, 667–67

4. [CrossRef] [PubMed] 

5. Zhang, K.; Zhang, Y.; Zhang, M.; Gu, L.; Liu, Z.; Jia, J.; Chen, X. Effekter av fosfolipidkomplex av totala flavonoider från Persimmon (Diospyros kakiL.) blad på experimentella aterosklerosråttor.J. Etnopharmacol.2016, 191, 245–253. [CrossRef] 

6. Kotani, M.; Matsumoto, M.; Fujita, A.; Higa, S.; Wang, W.; Suemura, M.; Kishimoto, T.; Tanaka, T. Persimmonbladextrakt och astragalin hämmar utvecklingen av dermatit och IgE-höjning hos NC/Nga-möss.J. Allergy Clin. Immunol.2000, 106, 159–166. [CrossRef] 7. Thuong, PT; Lee, CH; Dao, TT; Nguyen, PH; Kim, WG; Lee, SJ; Åh, WK Triterpenoids från bladen avDiospyros kaki(persimon) och deras hämmande effekter på proteintyrosinfosfatas 1B.J. Nat. Driva.2008, 71, 1775–1778. [CrossRef] 8. Matsuo, T.; Ito, S. Den kemiska strukturen av kaki-tannin från omogen frukt av persimmon (Diospyros kakiL.). Agric. Biol. Chem.1978, 42, 1637–1643. [CrossRef] 9. Bawazeer, S.; Rauf, A. In vivo antiinflammatoriska, smärtstillande och sedativa studier av extraktet och naftokinon isolerade frånDiospyros kaki(persimon).ACS Omega2021, 6, 9852–9856. [CrossRef] 10. Yoshimura, M.; Mochizuki, A.; Amakura, Y. Identifiering av fenoliska beståndsdelar och hämmande aktivitet av persimmon blomkål och shiteito mot tumörcellsproliferation.Chem. Pharm. Tjur.2021, 69, 32–39. [CrossRef] 11. Wang, L.; Xu, ML; Rasmussen, SK; Wang, M.-H. Vomifoliol 9-O- -arabinofuranosyl (1→ 6)- -D-glukopyranosid från bladen påDiospyros Kakistimulerar glukosupptaget i HepG2- och 3T3-L1-celler.kolhydr. Res.2011, 346, 1212–1216. [CrossRef] [PubMed] 12. Hitaka, Y.; Nakano, A.; Tsukigawa, K.; Manabe, H.; Nakamura, H.; Nakano, D.; Kinjo, J.; Nohara, T.; Maeda, H. Karakterisering av karotenoidfettsyraestrar från skalen av persimonDiospyros kaki. Chem. Pharm. Tjur.2013, 61, 666–669. [CrossRef] 13. Simpson, DS; Oliver, PL ROS-generation i mikroglia: Förstå oxidativ stress och inflammation i neurodegenerativ sjukdom.Antioxidanter2020, 9, 743. [CrossRef] [PubMed] 14. Liu, Z.; Ren, Z.; Zhang, J.; Chuang, C.-C.; Kandaswamy, E.; Zhou, T.; Zuo, L. Roll av ROS och näringsmässiga antioxidanter i mänskliga sjukdomar.Främre. Physiol.2018, 9, 477. [CrossRef] [PubMed] 15. Kwon, J.; Hwang, H.; Selvaraj, B.; Lee, JH; Park, W.; Ryu, SM; Lee, D.; Park, J.-S.; Kim, HS; Lee, JW Fenoliska beståndsdelar isolerade frånSenna toragroddar och deras neuroprotektiva effekter mot glutamatinducerad oxidativ stress i HT22- och R28-celler.Bioorganisk Chem.2021, 114, 105112. [CrossRef] [PubMed] 16. Romussi, G.; Bignardi, G.; Pizza, C.; De Tommasi, N. Constituents of cupuliferae, XIII: Nya och reviderade strukturer av acylerade flavonoider frånQuercus SuberL. Båge. Der Pharm.1991, 324, 519–524. [CrossRef] 17. Li, H.-Z.; Song, H.-J.; Li, H.-M.; Pan, Y.-Y.; Li, R.-T. Karakterisering av fenoliska föreningar frånRhododendron alutaceum. Båge. Pharmacal Res.2012, 35, 1887–1893. [CrossRef] [PubMed] 18. Jung, M.; Choi, J.; Chae, H.-S.; Cho, JY; Kim, Y.-D.; Htwe, KM; Lee, W.-S.; Chin, Y.-W.; Kim, J.; Yoon, KD Flavonoider frånSymplocos racemosa. Molekyler2015, 20, 358–365. [CrossRef] 19. Xu, J.; Wang, X.; Yue, J.; Sun, Y.; Zhang, X.; Zhao, Y. Polyfenoler från ekollonblad (Quercus liaotungensis) skydda pankreas betaceller och deras hämmande aktivitet mot -glukosidas och proteintyrosinfosfatas 1B.Molekyler2018, 23, 2167. [CrossRef]