Abstrakt
Bakgrund:Bearbetning av kinesisk materia medica är en framstående och unik farmaceutisk teknik inom traditionell kinesisk medicin (TCM) som används för att minska biverkningar och öka eller till och med ändra den terapeutiska effekten av råa örter. Förändringar i de väsentliga komponenterna som induceras av en optimerad processprocedur är primärt ansvariga för den ökade effekten av medicinalväxter. Den njure-yang uppiggande effekten av risvinsångad Cistancha deserticola (C. deserticola) var starkare än rå C. deserticola (CD).
Metoder:En jämförelseanalys utfördes med hjälp av UPLC-Q-TOF-MSE med UNIFIs informatikplattform för att bestämma påverkan av bearbetning. In vitro-studier utfördes för karakterisering av beståndsdelar såväl som metaboliter in vivo. De kemiska komponenterna bestämdes i CD och dess bearbetade produkter. De multivariata statistiska analyserna utfördes för att utvärdera variationer mellan dem medan OPLS-DA användes för parvis jämförelse.
Resultat:Resultaten av denna studie avslöjade avsevärda variationer i fenyletanoidglykosider (PhGs) och iridoider efter bearbetning. Totalt 97 föreningar upptäcktes i extrakten av CD och dess bearbetade produkt. PhG med 4'-O-kafeoylgruppen i 8-O- -d-glukopyranosyldelen, som akteosid, cistanosid C, campneosid II, osmanthusid minskade efter att ha bearbetats, medan PhG med 6'- O-kafeoylgruppen i 8-O- -d-glukopyranosyldelen, såsom isoacetosid, isocistanosid C, isocampneosid I, isomartynosid ökade, särskilt i CD-NP-gruppen. Intensiteten av echinakosid och cistanosid B vars struktur har 6'-O- -d-glukopyranosyldelen ökade också. I en in vivo-studie upptäcktes 10 prototypkomponenter och 44 metaboliter i råttplasma, avföring och urin. De erhållna resultaten avslöjade att bearbetning leder till avsevärd variation i de kemiska beståndsdelarna i CD och påverkar dispositionen av föreningarna in vivo, och fas II-metaboliska processer är nyckelkaskaderna för varje förening och de flesta av metaboliterna är associerade med echinakosid eller acetonid.
För mer information:
david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
Slutsatser:Detta är den första globala jämförelseforskningen av rå och bearbetad CD. Dessa fynd bidrar till vår förståelse av effekten av CD-bearbetning och ger viktiga data för framtida effektutredningar.
Nyckelord:Cistanche deserticola, Processing, UPLC-Q-TOF-MSE, Kemiska profiler, Metaboliter in vivo
Introduktion
Bearbetning av kinesisk materia medica (CMM) har visat betydande tillämpbarhet i klinisk praxis för traditionell kinesisk medicin (TCM), och det har ansetts vara en hållbar behandling i flera århundraden. Detta är en unik läkemedelsteknologi som har härletts från teorin om TCM. Följande bearbetning, betydande skillnader i utseende, kemiska beståndsdelar, egenskaper och medicinsk betydelse för alla typer av TCM har identifierats, vilket leder till antagandet att bearbetning kan förbättra effektiviteten eller minska TCM:s toxiska effekter.
I hundratals år har Cistanche deserticola (Roucongrong på kinesiska, CD) ofta använts i TCM klinisk praxis för att komplettera njurens funktioner. Det hjälper också till att återfukta tarmen vilket leder till att tarmen slappnar av [1]. Cistanche spelades först in i ShenNongBencaoJing. Det finns vanligtvis i torra och halvtorra livsmiljöer över Eurasien och Nordafrika, inklusive Iran, Kina, Indien och Mongoliet [2]. Bearbetningen av CD har utförts genom ångning med risvin under normalt tryck, vilket är en beredningsmetod dokumenterad i den kinesiska farmakopén (Jiucongrong på kinesiska, nedan kallad "CD-NP"). Och CD-ångning med risvin under högt tryck är en mer effektiv beredningsmetod (nedan kallad "CD-HP") [3, 4]. Flera studier har visat att de farmakologiska effekterna av CD skiljer sig från dess bearbetade produkter [5]. CD kan tonifiera njurens yang och slappna av i tarmen, medan efter att ha ångats med risvin skulle effekten av att fylla på njurens yang förstärkas. I vår tidigare studie har det visat sig att CD-NP kan förbättra sonifieringen av njuren och stödja yang, och lindra effekterna av att fukta tarmarna och avföra avföring [6–8]. I klinisk praxis är bearbetade produkter den vanligaste formen.
Upp till dags dato har flera studier analyserat de kemiska komponenterna i CD, följt av isolering och identifiering av mer än 100 föreningar [9–11], såsom fenyletanoidglykosider (PhGs), iridoider, lignaner och oligosackarider som dess huvudsakliga kemiska beståndsdelar . Det har också rapporterats att det finns många farmakologiska aktiviteter av PhG inklusive immunmodulerande, neuroprotektiva, leverskyddande, antiinflammatoriska, antioxidativa, etc.[12–14]. Iridoider har antiinflammatoriska aktiviteter [15, 16]. Det har också avslöjats av tidigare studier att vissa kemiska komponenter visade variationer under bearbetningen [17–20]. Baserat på dessa rapporter kan man anta att efterbearbetning, variationerna i kemisk sammansättning leder till olika farmakologiska effekter, som behöver utforskas ytterligare.
I den aktuella studien utfördes en känslig och effektiv metod, dvs ultrahögpresterande vätskekromatografi kopplad med TOF-MSE (UPLC-Q-TOF-MSE) för jämförande analys, och in vitro-studier utfördes för att kvalitativt analysera extrakten av CD, CD-NP och CD-HP för att klargöra deras kemiska profiler. Generellt sett betraktades de exogena kemikalierna med hög exponering i målorgan som effektiva komponenter. Därför administrerades CD och dess bearbetade produkter oralt till råttor, följt av deras karakterisering. Den befintliga studien avslöjar en jämförande studie (både in vitro och in vivo) av rå och bearbetad CD för första gången. De erhållna resultaten skulle utöka vår förståelse av effekten av CD-bearbetning, vilket kan vara till hjälp för ytterligare studier.
Material och metoder
Material
Standardföreningar av ajugol (180120) och 2'-aktylacetosid (M0601AS) tillhandahölls av Chendu Pure Chem-Standard Co., Ltd (Chengdu, Kina). Cistanoside F (MUST-17022620), echinacosid (D1105AS), cistanosid A (M0906AS) och isoacteosid (M0106AS) tillhandahölls av Must-företaget (Sichuan Kina); akteosid (O0618AS), salidrosid (J0526AS), catalpol (S0728AS), geniposid (A0407AS) och geniposidsyra (MB6001-S) förvärvades från Dalian Meilun Bio.Co., Ltd (Dalian, Kina). 8-epideoxylogansyra (B31123) erhölls från Shanghai Yuanye Biological Technology Co., Ltd, Kina. Metanol och acetonitril var av MS-kvalitet och erhölls från Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland. Metansyra (CH2O2) av HPLC-kvalitet tillhandahölls av Merck KGaA (Darmstadt, Tyskland). Vattnet, som användes i den befintliga studien, bearbetades via Milli-Q-systemet (18,2 MΩ, Millipore, Ma, USA). Risvin tillhandahölls av Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Kina).
Cistanche deserticola samlades in från Neimenggu wangyedi cistanche Co. Ltd. Proverna identifierades av Prof. Yanjun Zhai (farmaceutskolan, Liaoning University of TCM). Proverna lämnades till Liaoning University of Traditional Chinese Medicine.
Djur
Sprague-Dawley hanråttor (SPF-kvalitet) med 180–220 g total kroppsvikt tillhandahålls av Liaoning Changsheng biotechnology Co. Ltd. (Laboratory Animal Resource
Center of Liaoning Province, licensnummer: SCXK- 2015–0001). Dessa råttor hölls i ett avelsrum med väl underhållen temperatur och luftfuktighet, dvs 20–26 grader, 50–70 procent under en vecka. Råttorna matades med vanlig labbmat och vatten före experiment. Djuren fastade över natten, dock tillhandahölls vattnet ad libitum före experimentet. Råttorna avrättades med 10 procent kloralhydratbedövningsmedel. Den institutionella djuretiska kommittén vid Liaoning Provincial Hospital of Chinese Medicine godkände alla experimentella protokoll (2019.3.25, 2019015).
Beredning av CD-, CD-NP- och CD-HP-extrakt
CD-NP och CD-HP bearbetades från samma sats av Cistanch deserticola. För att förbereda CD-NP fuktades torra CD-bitar (5 mm tjocka, 100 g) med risvin (30 ml) och ångades vid 100 grader i 16 timmar, följt av torkning vid 55 grader via en torkugn. Medan CD-HP bereddes genom infiltration av torra CD-bitar (5 mm tjocka, 100 g) med risvin (30 ml), följt av ångning vid 1,25 atmosfärstryck i 4 timmar. och torkade sedan i torkugn på 55 grader .
I en 100 ml mätkolv siktades ett gram av pulvret via sikt #4, följt av tillsats av 50 procent metanol (50 ml) och täcktes sedan tätt och blandades. Denna blandning vägdes, följt av halva timmar. urlakning. Efter maceration ultraljudsbehandlades blandningen (effekt 250 W, frekvens 35 kHz) under 40 minuter, följt av kylning och vägning igen. Viktförlusten fylldes på med 50 procent metanol, blandades ordentligt och fick stå, följt av filtrering av supernatanten och sedan användning av det erhållna filtratet som testlösning.
MSE-analys av aktiva komponenter
Beredning av standardsubstanser: tableside-A (3.02 mg), echinacosid (3.00 mg), 2'-acetylacteosid (2,34 mg), acetonid (2,45 mg), isoacteosid (0,61) mg), cistanosid-F (2,14 mg), salidrosid (3,39 mg), geniposid (2,84 mg), ajugol (1,58 mg), katalog (2,39 mg), teniposidsyra (2,56 mg) och 8-epideoxylogansyra (2,34 mg) sattes till en 10 ml mätkolv, tillsattes metanol konstant volym i skala, konfigurerades till en motsvarande koncentrationsreferenslösning. Var och en av de 100 μL konfigurerades till en blandad referenslösning.
MS-analysvillkor: Te-massvärdet korrigerades före experimentet och negativ jonläget användes. Massintervallet var 50–1200 Da, och provet injicerades genom några injektionspumpar. Konhastigheten var 100 L/h, lösningsmedelsflödeshastigheten sattes till 800 L/h. Kapillär- och konspänningarna var fixerade till 2500 och 40 V, i enlighet därmed. Temperaturen på jonkällan och lösningsmedelsgasen var 100 grader respektive 400 grader och signalupptagningsfrekvensen var 0,5 S−1.
UPLC-Q-TOF-MSE-analys av CD-extrakt
Kromatografiska utvärderingar utfördes i ett Waters ACQUITY I-CLASS UPLC-system (Waters Corporation, Milford, MA, USA). Inklusive ACQUITY UPLC® BEH C18 kolumn (50×2,1 mm, 1,7 μm, vatten). Den mobila fasen bestod av vatten med 0,1 procent myrsyra (A) och acetonitril innehållande 0,1 procent myrsyra (B), elueringsvillkoret var följande: 97 procent till 85 procent A (0–5 min), 85 procent till 75 procent A (5–15 min), 75 procent till 65 procent A (15–16 min), 65 procent till 55 procent A (16–18 min) . Flödeshastigheten var 0,3 mL min−1, medan temperaturen i autosamplerrummet och kolonnen var 30 grader och 8 grader separat. Injektionsvolymen var 1,0 μL.
Den masspektrometriska utvärderingen utfördes via Waters XEVO G{{0}}XS QTOF MS (Waters Corporation, Milford, MA, USA), innefattande en ESI-källa. Flödeshastigheten för kvävgas var fixerad till 800 L·hrs−1 med en temp på 400 grader , källtemperaturen var fixerad till 100 grader och kongasen var inställd på 50 L h−1. Spänningen hos konen och kapillären justerades till 40 och 2000 V, i enlighet därmed. Rampens kollisionsenergi användes i intervallet 20–30 V. Centroiddata för alla prover erhölls från 50 till 1200 Da, med en 5-skanningstid på 0,5 s över en analystid på 10 minuter . LockSpray TM användes för validering av massprecision. [M–H]−jonen av leucinenkefalin (200 pg·μL−1 infusionsflödeshastighet 10 μL min−1) vid m/z 554,2615 användes som låsmassa. MassLynx V4.1-mjukvaran (Waters Co., Milford, USA) användes för den exakta massan, sammansättningen av prekursorjonerna och beräkningen av fragmentjonerna.
Dataanalys i Masslynx-plattformen
Dessutom skapades ett internt bibliotek med namnet på föreningen, dess struktur och molekylformeln (i mol) baserat på litteraturen. Alla föreningar noterades i en speciell mall, gjord i Excel. Dessutom sparades mol-filerna (ChemDraw Ultra 8.0, Cambridge soft, USA) och Excel-filerna för alla individuella sammansatta strukturer på den lokala datorn. Du upprättade ett Excel-ark med viktiga data direktimporterade till det vetenskapliga biblioteket i UNIFI.
UNIFI 1.8.2, Waters, Manchester, Storbritannien användes för utvärdering av strukturella egenskaper, särskilt för de karakteristiska fragmenten och MS-fragmentering. En minsta topparea på 500 ställdes in för 2D-toppdetektering. Under avslöjande av 3D-toppar valdes en lågenergitoppintensitet på mer än 300 räkningar och förhöjd energitoppintensitet på mer än 80 räkningar. Massfelet befanns vara upp till ±10 ppm för kända föreningar, och retentionstidstoleransen sattes till intervallet ±0,1 min. Vi valde de negativa addukterna innehållande –H plus HCOOH. Bearbetningen av rådata som erhållits från MS utfördes via strömlinjeformad UNIFI-mjukvara för att snabbt lokalisera de kemiska komponenterna som uppfyllde standarderna med den egenbyggda databasen och det interna biblioteket för traditionell medicin.
Därefter, för att verifiera den kemiska strukturen för varje målförening, särskiljdes isomererna genom sina karakteristiska MS-fragmenteringsmönster som avslöjades i de rapporterade studierna och genom att jämföra retentionstiderna för referensstandarder.
Metabolomisk analys baserad på multivariat statistisk analys
Innan rådata bearbetades ställdes parametrarna in, såsom massa från 150 till 1200 Da, intervall för retentionstid (0 till 20 min), tröskelintensitet ( 2000 räkningar), masstolerans dvs 5 mDa, medan massan och retentionstidsfönstret var 0,20 min respektive 0,05 Da. I den efterföljande listan över databasen var jonernas identifierare RT-m/z-paren avseende deras elueringstider. Samma värden för RT och m/z i olika satser av prover ansågs vara samma förening.
Multivariate statistical analysis was conducted to evaluate effective biomarkers that considerably contributed to variations among different groups. During the analysis, principal component analysis (PCA) was employed to indicate the maximum differences and pattern recognition for obtaining an overview and classification. The OPLS-DA is a modeling tool that provides visualization of the OPLS-DA predictive component loading to assist model evaluation. Variable importance for the projection (VIP) was used for assessing the evaluation of various components, and the metabolites with VIP values>1.0 och P-värde<0.05 were regarded as effective markers. Furthermore, a permutation test was conducted for providing reference distributions for the R2/Q2 values that could show statistical significance.
Djurförsök
Råttorna kategoriserades slumpmässigt i fyra grupper (n=6 för varje grupp), följt av oral administrering av olika extrakt: (1) Blank kontrollgrupp: råttorna gavs normal koksaltlösning (2 ml/100 g); (2) CD-grupp: råttorna gavs CD-extrakt (2 ml/100 g); (3) CD-NP-grupp: råttorna gavs CD-NP-extrakt (2 ml/100 g); (4) CD-HP-grupp: råttorna gavs CD-HP-extrakt (2 ml/100 g). Den ytterligare kategoriseringen av alla grupper genomfördes i tre undergrupper för plasma, urin och avföring. Två timmar senare administrerades varje råtta oralt med samma och lika mängd extrakt.
Efter administrering utfördes insamlingen av blodprover vid 1.0 h, 2.0 h och 4.0 h i hepariniserade 1,5 ml polyetenrör (från orbitala vener) följt av centrifugering (vid 4500 rpm) av alla prover under 15 minuter.
För urin- och avföringsprover hölls råttorna i metabolismburar, och sedan utfördes insamlingen av urin- och avföringsprover i 24 timmar efter administrering. Centrifugeringen av urinprover utfördes vid 45 00 rpm under 15 minuter, medan avföringsprover torkades i skuggan och maldes till pulver, sedan togs 0,2 g och tillsattes till 0,5 ml koksaltlösning, ultraljud i 5 minuter och centrifugeras vid 12,000 rpm i 15 minuter. Alla bioprover hölls vid -80 grader fram till analys.
Beredning av biologiska prover
Tillsatsen av plasma-, urin- och avföringsprover utfördes med 3 volymer metanol, följt av vortexning i 3 minuter. Därefter utfördes centrifugeringen (vid 12, 000 rpm) av blandningarna under 10 minuter, följt av överföring av supernatant till EP-röret och sedan torkning med kväve vid 37 grader. Dessutom tillsattes 200 μL HCN–H2O (50 procent) lösning. Därefter användes virveln för blandning (1 min), följt av centrifugering (vid 12, 000 rpm) under 5 min. Supernatanten (5 μL) av de behandlade proverna injicerades i UPLC-Q-TOF-MSE-systemet.
Vätskekromatografiskt och masspektrometriskt tillstånd
Analysen för metaboliter utfördes också av Waters UPLC-instrumentet genom ett ESI-gränssnitt. Separationer utfördes med användning av en Acquity UPLC HSS T3-kolonn (100 mm×2,1 mm, 1,8 µm), den mobila fasen var 0,1 procent myrsyra (A): Acetonitril (B), gradientelueringsvillkoret var 0–3 min (99,8 procent →98 procent A), 3–5 min (98 procent →95 procent A), 5–8 min (95 procent →90 procent A), 8 –12 min (90 procent →85 procent A), 12–17 min (85 procent →70 procent A), 17–22 min (70 procent →60 procent A), 22–23 min (60 procent →58 procent A) , 23–25 min (58 procent A), 25–32 min (58 procent →45 procent A) och 32–37 min (45 procent →35 procent A), 0,4 mL min−1 var flödeshastigheten. Temperaturen för kolonnen och provrummet var inställd på 40 grader respektive 8 grader. De ovan nämnda masspektrometribetingelserna användes.
Strategi för systematisk analys av metaboliter i bioprover
UNIFI (1.8.2) programvara användes för databehandling. Funktionen Binary Compare användes för identifiering av effektiva metaboliter. Utvärderade metaboliter fanns inte i det ekvivalenta kontrollprovet eller fanns vid låga jonintensiteter. Den relativa intensitetströskeln sattes till 3 eller 5, och metaboliter som uppfyllde de understrukna kriterierna kunde utvärderas. Vanliga och förutsägbara metaboliter bestämdes sedan med EIC. För att söka efter tvåfasmetaboliter användes NLF-funktionen. Till exempel, i UNIFI-mjukvaran, kan parametrarna ställas in på 176.0321 för att söka efter möjliga glukuronsyrakonjugat. Efterbearbetning kan en neutral förlust ställas in i metoden eller identifieras. MassFragment användes för att bestämma eller karakterisera detekterade metaboliters strukturer, en UNIFI:s spektrala tolkningsfunktion är huvudfunktionen som används för att analysera den sekundära fragmenteringen av moderkomponenter. Denna funktion kan användas för snabb verifiering av fragmenteringsvägen rimligen.
För mer information: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
