Apoptotisk effekt av Cistanche-polysackarider på leukemi

Författare:

LI Yan,ZHANG Jin,ZHANG Jing-Nan,et al.

Inre Mongoliet, Kina

För att undersöka den apoptotiska effekten avCistanche polysackarider( CDP) på människaakut leukemicellinje Jurkat-celler.MetoderMTT-analys användes för att detektera effekten av CDP på ​​cellproliferation, Western blotting användes för att detektera aktiveringen av kaspas-9 och kaspas-3, och de apoptotiska signalmolekylerna testades också.ＲresultatT-cellsproliferation hämmades av 1 mg/ml och 2 mg/ml CDP, T-cellsapoptos inducerades av 5 mg/ml CDP, ochuttrycken för pro-kaspas-9 och pro-kaspas-3 reducerades avsevärt. Uttrycken av cellytreceptorerna CD45 och CD71 hämmades signifikant av 5 mg/ml CDP, EＲK-fosforylering inducerades, och JNK-fosforylering hämmades.

Slutsatser

【Nyckelord】Cistanche polysackarider; Apoptos; Ｒreceptor; caspase-9; caspase-3

Akut lymfoblastisk leukemi (ALL) är en malign klonal sjukdom i lymfsystemet med en hög grad av immunfenotypheterogenitet. , lätt att få återfall och så vidare. För närvarande är vanliga behandlingsmetoder bland annat benmärgstransplantation, induktionsterapi, immunterapi, kombinerad kemoterapi, etc. På grund av den begränsade förmågan hos de flesta kemoterapiläkemedel att rikta in sig på och döda tumörer, kan de orsaka allvarliga skador på matsmältningssystemet, blodsystemet, kardiovaskulära och cerebrovaskulära, etc. När den behandlas åtföljs den ofta av allvarliga biverkningar, av vilka några till och med är dödliga. När kemoterapin fortskrider tenderar kroppen att utveckla tolerans mot kemoterapiläkemedel, vilket ökar risken för att sjukdomen ska återkomma.

Därför har sökandet efter mycket effektiv, låg toxicitet och mycket målinriktad leukemiterapi eller adjuvant terapi blivit fokus för aktuell uppmärksamhet.Cistanchekallas Chagangaoya på mongoliska. Den tillhör familjen Ledangaceae och släktet Cistanche. Den är parasitisk på ökenträdens rötter och har ryktet om "ökenginseng".

De huvudsakliga aktiva ingredienserna i Cistanche inkluderar fenyletanoidglykosider, lignaner, betainer, steroler, aminosyror och polysackarider. Antiinflammatoriska, antivirala, antioxidanter, immunreglering och andra effekter.

Studier har funnit detCistanche polysackarid (CDP),som en av dess huvudsakliga aktiva komponenter,har antitumör- och immunmodulerande effekter.Forskarna fann att CDP har en betydande dödande effekt på leukemicellerna K562 och THP-1 och föreslog att CDP har en viss roll iförebyggande eller behandling av leukemi. Dessutom, i den traditionella kinesiska medicinen förening, cistanche, för behandling av akutleukemi, Cistanchespelar också en roll som en av de viktiga komponenterna. Men den specifika verkningsmekanismen förCistancheär inte känt. I denna artikel, isolering och rening avCistanche CDPundersöktes, och den dödande effekten och den relaterade mekanismen för CDP på ​​den humana akuta leukemicellinjen Jurkat undersöktes.

1.1 Huvudreagenser och instrument

Cistanche-pulver köptes från Sichuan WecistancheGroup Co, Ltd., human akut leukemicellinje Jurkat köptes från cellbanken vid Shanghai Institute of Cell Biology, tiazolblått (MTT) och natriumdodecylsulfat (SDS) köptes från Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd., fetalt bovint serum (FBS) köptes från Hangzhou Sijiqing Bioengineering Materials Co., Ltd., cysteininnehållande kaspas-3, kaspas-9, CD71, CD45, Fosforylerat c-Jun aminoterminalt kinas (p -JNK) och fosforylerade extracellulära signalreglerade kinas (p-ERK) antikroppar köptes från Cell Signaling Technology, USA, och aktinantikroppar köptes från Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. Electrochemical Luminescenssubstratet (ECL) köptes från Thermo Scientific Company i USA, och andra reagenser var av inhemsk analytisk kvalitet. Gel-View 6000 plus intelligent bildarbetsstation (produkt från Guangzhou Boluteng Biotechnology Co., Ltd.), Revolve FL upp och ner fluorescensmikroskop (produkt från Echo Laboratories, USA), EPOCH mikroplattläsare (produkt från Beijing Bo Teng Instrument Co., Ltd.).

1.2 Separation och rening av CDP Ta 500 g avCistanche-extraktpulver, blötlägg den i 95 procent etanol över natten, filtrera den med gasväv, samla upp filterresterna, koka den med varmt vatten på 60 grader i 2 timmar/gång, totalt 3 gånger. Efter slutet kombinerades filtraten tre gånger, koncentrerades under reducerat tryck till 2/3 av den ursprungliga volymen, tillsattes 3 gånger volymen 95 procent etanol och fick stå vid 4 grader över natten. Nästa dag, centrifugera vid 4 000 r/min i 10 minuter, samla upp fällningen, ta bort protein med Sevag-metoden, fäll ut med absolut etanol, frystorka för att erhålla CDP.

1.3 Cellkultur Den humana akuta leukemicellinjen förvarades i flytande kväve i Jurkat-laboratoriet. När de användes, utvanns cellerna snabbt i ett 37 graders vattenbad och odlades i RPMI1640-medium (innehållande 100 U/ml penicillin och 100 U/ml streptomyciner) med 10 % FBS. Cellerna odlades i en 37 graders, 5 procent CO2-cellinkubator, passerade varannan till var tredje dag, och experimenten utfördes när cellerna gick in i den logaritmiska tillväxtfasen.

1.4 MTT-experiment Jurkat-celler i den logaritmiska tillväxtfasen togs, centrifugerades för att erhålla cellpellet och räknades vid 5 x 105 celler/ml. Ta en cellodlingsplatta med 96-brunn, inokulera 100 ul celler i varje brunn och tillsätt sedan 100 ul RP-MI1640 komplett medium som en kontrollgrupp; experimentgruppen delades in i 3 grupper, först med användning av RPMI1640-medium för att framställa olika koncentrationer av CDP, och sedan tillsattes 100 ul RP-MI1640-medium till varje brunn. ul Jurkat-celler och 100 ul CDP-lösning användes för att göra den slutliga koncentrationen av CDP vid 1, 2 respektive 5 mg/ml. Varje grupp sattes upp med 5 dubbla brunnar och inkuberades i en 37 graders cellinkubator under 48 timmar. Efter inkubationen, tillsätt 20 ul MTT (koncentrationen av stamlösningen är 5 mg/ml) i varje brunn, sätt tillbaka den i cellinkubatorn och fortsätt att inkubera i 4 timmar och tillsätt slutligen 100 ul av 20 procent SDS för att lösa formazan vid 37 grader över natten, och använda den nästa dag. Absorbansen vid 570 nm för varje grupp detekterades av en mikroplattläsare, och inhiberingshastigheten för olika koncentrationer av CDP på ​​Jurkat-cellproliferation beräknades med formeln.

1.5 Western blotting Jurkat-celler i den logaritmiska tillväxtfasen togs och såddes i en 6-brunnsplatta med en densitet av 2 × 105 celler/ml, 500 ul/brunn och 500 ul RPMI1640 komplett medium sattes till kontrollen grupp. Sätt upp 3 experimentgrupper, 1, 2 och 5 mg/ml polysackaridbehandlingsgrupper, CDP

Upplöst i RPMI1640 komplett medium i förväg, 500 ul av celler och 500 ul av CDP-lösningar av olika koncentrationer tillsattes till 6-brunnsplattan och inkuberades vid 37 grader i 48 timmar. Efter odlingen samlades cellsuspensionerna från varje grupp, centrifugerades vid 1 500 r/min i 5 minuter för att erhålla cellpellets och tvättades två gånger med förkyld fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Efter tvättning tillsattes 20 ul cellysbuffert till varje grupp och cellerna lyserades på is under 30 min. Totalt protein extraherades och cellkoncentrationen justerades med användning av Bradfords metod. 20 ug protein togs från varje grupp för SDS-polyakrylamidgelelektrofores (PAGE), och proteinet överfördes till polyvinylidenfluorid (PVDF)-membran genom elektroporering. Blockerad med fettfritt mjölkpulver i rumstemperatur i 1 timme, tillsatt anti-humant kaspas-3 från kanin och kaspas-9 antikroppar i ett utspädningsförhållande på 1:1 000, inkuberat i rumstemperatur i 1 h, skölj 3 gånger med en fosfat Tween buffert (PBST) shaker (10 min/tid), tillsätt pepparrotsperoxidas (HRP)-märkt sekundär antikropp (1:1 000), inkubera i 1 timme vid rumstemperatur, skölj 3 gånger med PBST, skölj 1 gång med PBS, tillsätt ECL-substrat och använd Den intelligenta bildarbetsstationen användes för avbildning, och bandförändringarna för varje grupp jämfördes för att studera apoptos av Jurkat-celler inducerad av CDP. För detektering av apoptosväg-relaterade proteiner var cellkulturen och CDP-behandlingsförhållandena desamma som ovan. Efter reaktionen lyserades cellerna för proteinkvantifiering. Proteinet överfördes till PVDF-membran genom SDS-PAGE och elektroporering. Efter blockering med skummjölkspulver i 1 timme tillsattes anti-CD71, CD45, p-JNK och p-ERK antikroppar (1:1 000) och inkuberades vid rumstemperatur i 1 timme. Den HRP-märkta sekundära antikroppen (1:1 000) inkuberades i 1 timme, och slutligen användes den intelligenta avbildningsarbetsstationen för avbildning för att studera de relaterade signalmolekylerna av CDP-inducerad Jurkat-cellapoptos. De resulterande experimentbanden gråskalades med bild J (1.8.0).

Klicka här för att veta Cistanche-effekten på anti-tumör och anti-cancereffekt

1.6 Statistisk analys SPSS21.0 programvara användes för t-test och variansanalys

2 resultat av Cistanche-funktionen påleukemi

2.1 Cellproliferationsnivå

CDP isolerades framgångsrikt, med mer än 9{{20}} procent sockerinnehåll och mindre än 5 procent proteininnehåll. Hämningshastigheten för cellproliferation i 1 mg/ml CDP-gruppen var (19,1 ± 2,1) procent, medan den i 2 mg/ml och 5 mg/ml CDP-grupperna var (44,2 ± 5,2) ) ) procent och (47,8 ± 4,4) procent, vilket indikerar att CDP signifikant kan hämma proliferationen av Jurkat-celler på ett dosberoende sätt. 2.2 Jämfört med kontrollgruppen (0.62±0.04, 0.56±{{40}}.{{49 }}7), resulterade nivån av apoptos i Jurkat-celler behandlade med 5 mg/ml CDP i enzymerna kaspas-9 och kaspas{{30}}. Pro-form pro-caspase-9 ( 0. 09 ± 0. 02) och pro-caspase-3 ( {{ 63}}. 12 ± 0. 01) reducerades signifikant och 1 mg/ml och 2 mg/ml CDP-grupperna var signifikant mindre effektiva för pro-kaspas-3 i celler. Kaspas-9 (0,58±0,04, 0,51±0,01) och pro-kaspas-3-innehåll (0,48±0,04, 0,44±0,05) hade ingen signifikant effekt, det vill säga låg. Koncentrationen av CDP inducerade inte apoptos av Jurkat-celler, men hämmade huvudsakligen cellproliferation, som visas i figur 1.

1-4: referensgrupp,

1 mg/ml CDP-grupp, 2 mg/ml CDP-grupp, 5 mg/ml CDP-grupp; samma som följande figur

Figur 1 Effekten av CDP på ​​kaspas-9 och kaspas-3 i Jurkat-celler

Inverkan av Cistanche-polysackarider Effekt på leukemi

2.3 De relativa uttrycksnivåerna av CD71 och CD45 i apoptosreceptorkontrollgruppen var 1.00±0.04, {{10}}.54± 0.{{20}}2. 5 mg/ml CDP-gruppen kunde signifikant hämma CD71 (0.05±0.02). 01) och CD45 ( 0. 13 ± {{40}}. 03); 1 mg/ml och 2 mg/ml CDP-grupper kunde hämma uttrycket av CD71 (0,52 ± 0,06, 0,43 ± 0,07) i viss utsträckning. Det fanns ingen signifikant effekt på uttrycket av CD45 (0,51) ±0,01, 0,48±0,02). Se figur 2.

Figur 2 Effekten av CDP på ​​uttrycket av receptorer på cellmembranytan

2.4 Apoptosrelaterade vägar

De relativa uttrycksnivåerna för p-JNK och p-ERK i referensgruppen var 1,20±0.08 och 0.21±0 .03 respektive. 5 mg/ml CDP-gruppen inducerade apoptos och reducerade signifikant fosforyleringsnivån av JNK. ( 0. 32 ± 0. 04), ökade signifikant fosforyleringsnivån för ERK (1. 13 ± 0. 05); 1 mg/ml, 2 mg/ml CDP ökade fosforyleringsnivån av JNK (1. 12 ± 0. 06, 1. 06 ± 0. 06) hade ingen signifikant effekt, men ökade fortfarande fosforyleringsnivån av ERK (0,54 ± 0,04, 0,63 ± 0,02). Se figur 3.

Figur 3 Effekten av CDP på ​​fosforyleringen av JNK och ERK

3 Diskussion

Under senare år har studier funnit att CDP har en viss hämmande effekt på leukemicellinjer, men den specifika verkningsmekanismen är ännu inte känd.

I processen med apoptos är kaspas-9 en av de uppströms signalerande molekylerna i den kaspasberoende apoptosprocessen. Efter signalstimulering hydrolyseras pro-kaspas-9 massivt för att producera en aktiverad form av klyvd-kaspas-9, som fortsätter att överföra apoptotiska signaler nedåt för att främja apoptosprocessen. Kaspas-3 är en kaspasmolekyl av effektortyp och är en nyckelsignalmolekyl i processen för cellulär kaspasberoende apoptos. Det finns också i form av proenzym (pro-kaspas-3) under normala förhållanden. När den väl har aktiverats genom hydrolys, produceras en stor mängd klyvt kaspas. -3 kommer det att lysera en mängd nyckelproteinmolekyler i celler och så småningom inducera apoptos. CDP tillhör de aktiva polysackariderna av biologiska makromolekyler och kan inte fritt komma in i cellerna genom cellmembranet. Därför inducerar CDP apoptos genom att påverka uttrycket och distributionen av receptorer på ytan av Jurkat-cellmembran, och därigenom överföra signaler till det inre av celler och slutligen aktivera kaspasfamiljen. protein, vilket leder till cellapoptos. Denna studie visar att låg koncentration av CDP inte inducerar apoptos av Jurkat-celler, utan huvudsakligen hämmar cellproliferation. CD71, även känd som transferrinreceptor, är en typ II transmembranglykoproteinreceptor involverad i järnabsorption och reglering av celltillväxt och utveckling. CD71 uttrycks i hög grad hos patienter med akut leukemi och är associerat med primär läkemedelsresistens, det vill säga uttrycket av CD71. Ju högre värde, desto sämre effekt av den första kemoterapin. Därför är CD71 en av markörerna för hjälpdiagnos. CD45 uttrycks på ytan av alla typer av leukocyter, även känd som leukocytantigen. Det tillhör typ I transmembranglykoprotein och är nära relaterat till utvecklingen och differentieringen av T-celler. CD45 har olika uttrycksnivåer och allosteriska typer i olika typer av leukemi, så det kan användas som en av markörerna för differentialdiagnos och immunfenotypning av leukemi. CD45 monoklonal antikropp har använts i stor utsträckning vid behandling av leukemi, särskilt läkemedelsresistent leukemi. Friesen et al. fann att radionuklider

Märkt CD45 mAb kan inducera apoptos i läkemedelsresistenta leukemicellinjer genom att aktivera proteiner från kaspasfamiljen (inklusive kaspas-3, kaspas-8 och kaspas-9). CDP inducerar apoptos av Jurkat-celler, först genom att verka på cellmembranets ytreceptorer CD45 och CD71, påverka uttrycket och distributionen av de två, överföra apoptossignaler till cellerna och slutligen aktivera kaspas-9 och kaspas{{8 }}, utlöser apoptos. Men både kaspas-9 och kaspas-3 är belägna nedströms om den apoptotiska vägen, och uppströms signalmolekyler måste utforskas ytterligare. I denna studie inducerade CDP vid en koncentration av 5 mg/ml apoptos av Jurkat-celler samtidigt som uttrycket av CD45 hämmades, vilket liknade det för den monoklonala CD45-antikroppen som beskrivs ovan. Därför, ur perspektivet av apoptosrelaterade receptorer CD45 och CD71,Cistanchehar en viss potential för behandling eller adjuvansbehandling av leukemi.Mitogenaktiverade proteinkinassystem (MAPK) uttrycks i alla eukaryota celler.

Cistanche-tabletter för att förbättra immunsystemet för leukemibehandling

Det är en mycket viktig informationsöverföringsväg som genomför extracellulär stimuleringssignaltransduktion till den intracellulära och består av serin/treoninproteinkinaser, inklusive ERK, JNK och p38MAPK. Dess fosforylering och defosforylering är omkopplare av celllivsaktiviteter och är involverade i Och reglerar processen för celltillväxt, proliferation, differentiering, aktivering och apoptos. Denna studie tyder på att JNK-defosforylering är involverad i CDP-inducerad T-cellapoptos, medan ERK-fosforylering är involverad i de två processerna genom att CDP hämmar cellproliferation och inducerar apoptos.

Sammanfattningsvis,Cistanche CDPhar en cytotoxisk effekt på T-lymfocytisk leukemicellinjen Jurkat, vilket visar att låga koncentrationer (under 2 mg/ml) hämmar cellproliferation, medan höga koncentrationer (5 mg/ml) inducerar apoptos.Cistanche CDPinducerar apoptos i Jurkat-celler huvudsakligen genom att påverka och förändra celler.

Uttrycket av apoptosrelaterade receptorer CD71 och CD45 på membranytan överför signaler till det inre av celler, vilket ytterligare orsakar ERK-fosforylering och JNK-defosforylering, och slutligen aktivering av kaspas-9, vilket i sin tur aktiverar kaspas{{4} } för att inducera apoptos.