Nanomjölkprotein-slemkomplex: Karakterisering och anticancereffekt del 2

För mer information kontaktatina.xiang@wecistanche.com

Klicka på länken för att lära dig del 1:https://www.xjcistanche.com/news/nano-milk-protein-mucilage-complexes-characte-55049142.html

3. Material och metoder

3.1. Material

Plantago ovata (delmål) skal och den mogna frukten av Ziziphus Spina-Christi(Nabeq) köptes från Giza, Egypten; mjölkproteinkoncentrat (MP, 81,3 procent protein) köptes från Fonterra company (Auckland, Nya Zeeland). Kasein- och vassleproteinerna i MPC är till stor del i sin ursprungliga och liknande micellära form som de som finns i mjölk. Alla kemikalier som användes var av analytisk renhet.

3.2. Beredning av Isabgol Husk Mucilage (IHM) och Nabeg Mucilage (NabM)

Isabgol-skalslem (IHM) och Nabeq-slem (NabM) framställdes enligt metoden som beskrivs av El-Maksoud et al. [5]. Kortfattat framställdes en suspension av isabgolskal genom att lösa 1,2 g i 100 ml destillerat vatten och renades med acetonlösning. Den resulterande gelén förvarades i kylskåp (4-5 grad) tills den användes.

För NabM tvättades de mogna Nabeq-frukterna noggrant med kranvatten för att avlägsna smuts. De färska frukterna separerades från fröna och blandades med destillerat vatten i ett förhållande av 1:10 (vikt/volym) efter att ha skurits i små bitar. Blandningen blandades med en laboratorieblandare (Toshiba Mixie, Japan) och fick stå i 12 timmar i kylskåp.

Det mucilaginösa extraktet centrifugerades sedan vid 2000 rpm under 30 min och filtrerades genom en muslinduk. Det resulterande viskösa lösliga slemmet fälldes ut med aceton. Det erhållna råslemmet förvarades i kylskåp tills det användes.

För analytiska ändamål torkades slemmet i en luftugn vid 40 grader och maldes med användning av kulkvarn MM400 (Retsch, Tyskland). Den kemiska sammansättningen av psyllium husk mucilage powder (PHMP) och Nabeq mucilage powder (NabMP) har mätts. Innehållet av fukt, protein, fett, aska, råfiber och totala kolhydrater var 8,49, 0,34, 0,21, 2,13, 1,53 och 87,44 procent för PHMP och 9,18,4,72, 2,05, 2,69, 1,70 och 78,26 procent för NabMP. , respektive. Det resulterande pulvret lagrades vid en sval temperatur (4-5 grader) tills vidare analys.

Klicka för att lära dig mer information

3.3. Beredning av mjölkprotein-slemkomplex (MPMC)

Mjölkproteinkomplex (MP) med IHM och NabM framställdes enligt Morr et al. med några modifieringar [44]. Mjölkproteinkoncentrat rekonstituerades i destillerat vatten (10 procent). Den resulterande mjölkproteinkolloiden blandades med IHM och NabM i ett 1:3 (o/o) förhållande. Blandningens pH justerades till 10 och fick stå i 10 minuter. Därefter sänktes pH till 3,5 med användning av 0,1 N HCl och lämnades i ytterligare 10 minuter. pH justerades sedan till pH 4,6 med användning av 0,5 M NaOH för att samla upp MPMC genom filtrering på ett filterpapper: MP, såväl som den resulterande MPMC, torkades genom lyofilisering vid -45 grader C under 24 timmar med användning av Novalyphe-NL500 lyofilisatorn , Savant Instruments, Holbrook, NY, USA.

3.4. Fysikalisk-kemiska och funktionella egenskaper

3.4.1.pH-mätning

De resulterande produkternas pH vid 10 % lösning mättes med användning av en kalibrerad pH-mätare (HANNA, HI 902 m, Tyskland).

3.4.2.Bestämning av bulkdensitet (BD), Tapped Density (TD) och Carr's Index

MPMC-pulver hälldes i en 50 ml mätcylinder upp till 25 ml, motsvarande den outtappade volymen, och tryck sedan 5-10 gånger tills ingen ytterligare förändring av pulvrets volym noterades motsvarande den tappade volymen.

Bulkdensiteten, tappad densiteten och Carrs index bestämdes med hjälp av följande ekvationer [45]:

(1)BD=massa/ outnyttjad volym

(2)TD=massa/uttagsvolym

(3)Carrs index ( procent )= (TD-BD)/TD×100

3.4.3. Water Absorption Index (WAI) och Water Solubility Index (WSD)

Vattenlöslighet och vattenabsorptionsindex för MP och MPMC undersöktes enligt den metod som beskrivs av Yagc och Gogus med vissa modifieringar [46]. Proverna (0,5 g) dispergerades i 10 ml destillerat vatten vid 25 grader i ett centrifugrör. Efter att ha stått i 30 minuter, med rörinversion var 5:e minut, centrifugerades proverna vid 3500 rpm under 15 minuter. Filtratet överfördes till en aluminiumplatta och torkades i 3 timmar vid 105 grader. Vikten av den återstående gelén registrerades och WSI och WAI bestämdes enligt följande:

(4)WAI(g/g)= Viktökning av gel/provets torrvikt

(5)WSI procent=Vikt torrt fast material i supernatant ×100/torrvikt av provet

3.4.4. Mjölkprotein smältbarhet

Proteinsmältbarhet bestämdes enligt Abd El-Ghany et al. [47]. Kortfattat dispergerades MP- och MPMC-prover i destillerat vatten vid en koncentration av 6,38 mg/ml och pH justerades till 8.0. En milliliter nyberedd enzymstamlösning (1,6 mg/ml trypsin, 3,1 mg/ml kymotrypsin och 1,3 mg/ml ER-aminopeptidas1

(ERAP1) blandades med proteinsuspension vid 37 grader. pH registrerades efter 10 minuter och enzymaktiviteten bestämdes med användning av kasein som referens. Följande ekvation användes för att beräkna proteinsmältbarhet [47]:

(6) procent smältbarhet=210.46-18.10 (pH)

3.5. Fenolfraktioner av PHM och NabM

Fenoliska föreningar av slemprover med användning av HPLC-analys utfördes enligt protokollet beskrivet av Elsayed et al. [48]. I korthet analyserades slemextraktet med användning av ett Agilent 1260-serie HPLC-system (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA). Separationen genomfördes med användning av C18-kolonnen (100 mm×4,6 mm id,5 um). Den mobila fasen innehöll (A) vatten 0,2 procent H3PO4, (B)metanol och (C) acetonitril med en flödeshastighet av 0,6 ml/min. Gradienteluering var enligt nästa schema: 0-11 min (96 procent A., 2 procent B);11-13 min (50 procent A,25 procent B);13-17min (40 procent A,30 procent B);17-20.5 min (50 procent B,50 procent C); och 20.5-30 min (96 procent A,2 procent B). Detektionsvåglängden (UV) detektor, 284 nm) inställdes på 284 nm. Injektionsstorleken var 20 μL och kolonntemperaturen hölls vid 30 grader. Föreningar var kända genom att jämföra deras retentionstid med de från autentiska standarder. Kalibreringskurvor användes för att utvärdera föreningsmängderna.

3.6.Totalt innehåll av fenoler och flavonoider i MP och MPMC

Polyfenolhalten bestämdes med Folin-Ciocalteu-metoden med vissa modifieringar [5]. I korthet blandades 2,8 ml milli-Qvatten innehållande 10 mg MP eller MPMC med 2 ml 2 procent natriumkarbonat och 0,1 ml 50 procent Folin-Ciocalteau-reagens. Efter 30 minuters inkubation vid rumstemperatur mättes reaktionsblandningens absorbans vid 750 nm mot avjoniserat vatten som ett blankprov med användning av en spektrofotometer (Hitachi, modell 100-20). Gallsyra (GA) användes som en standardfenolförening och en standardkurva med sju punkter (0-200 mg/L) konstruerades. Resultaten uttrycktes som milligram gallussyraekvivalenter per gram protein (GAE/g).

Flavonoiderinnehållet bestämdes med användning av aluminiumkloridmetoden som tidigare beskrivits av Abedelmaksoud et al. med vissa ändringar [5]. I korthet blandades 2,8 ml milli-Q vatten innehållande 10 mg MP eller MPMC med 0,1 ml 10 procent aluminiumkloridhexahydrat och 0,1 ml 1 M kaliumacetat. Efter inkubation vid rumstemperatur under 40 minuter, mättes absorbansen av reaktionsblandningen vid 415 nm mot avjoniserat vatten som ett blankprov. Quercetin användes som standard med hjälp av en standardkurva med sju punkter (0-50 mg/L). Totalt innehåll av flavonoider uttrycktes som milligram quercetinekvivalenter (QE/g).

3.7. Antioxidantaktivitet hos MP och MPMC

Den totala fria radikalfångningskapaciteten hos MP och MPMC utvärderades med hjälp av tre olika antioxidantanalyser: Stabil 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH), Azino-bis(3-etylbensotiazolin{{5} }}sulfonsyra (ABTS) och Hydroxylradikal (HS) radikaler som tidigare beskrivits av El-Maksoud et al [5].

3.8. Aminosyror Profil för MP och MPMC

Proteinprover syrahydrolyserades med användning av 6 N HCl enligt Peksa et al. [49. En automatiserad aminosyraanalysator (AAA 400, INGOs Ltd.) användes för att bestämma aminosyror.

3.9. Reologiska egenskaper

Prover framställdes såsom beskrivits av Barnes [50] med vissa modifieringar. Viskositeten för 2,5 % (vikt/vikt) lösning vid pH7 bestämdes vid 25±1 grad med användning av en Brookfield viskosimeter (DV-II plus Pro, Rheocalc Software, Tyskland). Spänning (σ) och viskositet (n) plottades som en funktion av skjuvhastighet. Konsistensindex (K) och flödesbeteendeindex (n) för kraftlagsmodellen beräknades:

Värdet på n är lika med 1 för newtonska vätskor och varierar från 0 till 1 för vätskor som är skjuvförtunnande och större än 1 för skjuvförtjockande vätskor [51].

3.10.Differential Scanning Calorimetry (DSC)

De termiska egenskaperna hos MP och MPMC mättes med en differentiell scanningkalorimeter (PerkinElmer, USA). Prover (4-6 mg) placerades i en aluminiumplatta och förseglades. Varje kastrull värmdes sedan till 350 grader med ett flöde av torr kvävgas vid 20 ml min-I vid en uppvärmningshastighet på 10 grader min -1. Från den endotermiska toppen av DSC-termogrammet uppskattades starttemperaturen för denaturering, maximal övergångstemperatur och nedbrytningspunkt [52]. Övergångsentalpivärdet (AH) från området under den endotermiska toppen i DSC-kurvan bestämdes och den tomma aluminiumpannan användes som referens.

3.11. Fourier-transform infraröd spektroskopi (FTIR)

Infraröda spektra mellan 600 och 3500 cm-I mättes vid 25 grader med hjälp av en FTIR-spektrofotometer (QFA Flex, USA) med den försvagade totalreflektionsmetoden med en upplösning på 4 cm-I och 10 skanningar per sekund.

3.12. Transmissionselektronmikroskopi

Mikrostrukturen hos MP och MPMC visualiserades med användning av ett transmissionselektronmikroskop (JEOL, JEM 1400 Flash, Japan) vid 80 kV. Kryostadiet i den negativa färgningsmetoden applicerades [53].

3.13.Biologiska studier om MP och MPMC

3.13.1. Anticanceraktivitet in vitro

Alla cellinjer som användes i detta experiment erhölls från American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Två humana cancercellinjer användes i denna analys: bröstadenokarcinom (MCF{{0}}, ATCCHTB-22TM) och hepatocellulärt karcinom (HepG2, ATCC4 HB-8065TM). Icke-cancerös hudfibroblast BJ-1(ATCC⑧ CRL-2522TM) och epitelial bröst MCF-12F(ATCC CRL-10782TM) cellinjer testades också för jämförelse. Cellinjer odlades i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM/hög glukos, HyCloneTM, USA) kompletterat med 10 procent fetalt bovint serum (FBS, Gibco, Brasilien), 100 U/ml penicillin, 100 ug/ml streptomycin och 25 ng/ ml amfotericin B (Sigma, Oakville, ON, Kanada) och odlade vid 37 grader med 5 procent CO, i en fuktad inkubator. Odlingsmediet ersattes varannan dag med ett färskt medium. När cellerna nådde 70 procent konfluens lossades de med användning av 0,25 procent Trypsin-EDTA(1X) Gibco, Kanada, och överfördes till en ny odlingskolv. Efter den andra passagen trypsiniserades cellerna och ströks ut i en 96-brunnsplatta i en koncentration av 2×10* celler/brunn. Efter 24 timmars inkubation dekanterades mediet och cellerna tvättades två gånger med PBS och behandlades sedan med 200 μL odlingsmedium innehållande olika koncentrationer av proteinprover (1, 5, 10 och 20 ug/ml). Doxorubicin HCl (4 ug/ml) användes som en positiv kontroll, medan celler behandlade med ett icke tillsatt medium togs som en negativ kontroll. Plattorna inkuberades vid 37 grader C under 24 timmar och denanti-canceraktiviteten hos proverna bestämdes med användning av en neutral röd upptagsanalys enligt Repetto et al. [54]. Kortfattat, efter inkubationsperioden ersattes mediet med 150 uL neutralt rött färgämne (100 mg/ml) löst i ett serumfritt medium, och cellerna inkuberades vid 37 grader C under 3 timmar. Därefter sköljdes cellerna med PBS och 150 μL elueringsmedium (EtOH/AcCOOH, 50∶1) tillsattes följt av försiktig skakning i 10 minuter för att säkerställa fullständig upplösning. Absorbansen mättes vid 540 nm med användning av en mikrotiterplattläsare (BioTek, 96 Well Plates, ELX808, USA).

där Ac är absorbansen för kontrollen och As är absorbansen för provet. Procentuell celldöd presenterad som cytotoxicitet (procent) och koncentrationen som dödar 50 procent av cellerna (IC50) beräknades för varje prov.

3.13.2.Bestämning av p53, Bax, Caspase-3 och Bcl-2 proteinnivåer

De cellulära nivåerna av viktiga apoptosproteinmarkörer bestämdes efter 24 timmar efter behandling med ICso för MP och MPMC. Kortfattat, Hep G-2, MCF-7, Bj-1 och MCF-12F-celler såddes vid 5×10* celler/brunn i 6-brunn tallrikar. Efter 24 timmars inkubation med proverna vid 37 grader samlades cellerna och lyserades och centrifugerades sedan vid 10,000rpm i 20 minuter vid 4 grader. Proteinkoncentrationen kvantifierades i supernatanten genom Bradford-analys [55]. Kaspas-3-aktivitet analyserades med ett kolorimetriskt analyskit (Abcam, ab39401) enligt tillverkarens instruktioner [56]. I korthet sattes 10 mg protein till 50 ul Caspase-substrat och den slutliga volymen justerades till 200 μL med hjälp av reaktionsbufferten vid 37 grader, och blandningen inkuberades i 1 timme i mörker följt av mätning av Caspase{{24} } koncentration vid 405 nm.

Nivån av pro-apoptotisk markör p53, associerad X(Bax) och anti-apoptotisk markör B-cellslymfom-2(Bcl-2) bestämdes i cellysat med användning av Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Simple Step ELISA enligt tillverkarens instruktioner (ab207225, ab119506 respektive ab199080; Abcam, USA), [57,58].

3.13.3.DNA-skada orsakad av skydd mot oxidativ stress

DNA-skadeanalys utfördes såsom tidigare beskrivits av Leba et al. [59] med liten modifiering. I korthet blandades 3 μL ribonukleasinhibitorplasmid RNH1（NM_203387）Human Tagged ORF Clone 10 ug/μL med Fentons reagens（5 mM H2O2 och 0,3 mM FeSO4 och 0,6 mM EDTA), och slutvolymen justerades till 25 μL med fosfatbuffert (H2POA, 8,3 mM, pH 7,4). Därefter inkuberades lösningen i 20 minuter vid 37 grader. För att bedöma antioxidantskyddskapaciteten hos MP och MPMC mot DNA-skada inducerad av Fentons reagens, tillsattes 5 ug/mL MP/NabM, MP/IHM och MP före inkubering. RNH1-plasmid-DNA (3 μL, 10 ug/μL) användes som DNA-skyddskontroll.

3.13.4.PCR-baserad genomisk DNA-skadeanalys

Homo sapiens metylentetrahydrofolatreduktas (MTHFR) gen amplifierades med PCR från genomisk blod som tidigare extraherats från friska blodprover med hjälp av ett standard DNA-extraktionskit [60]. DNA inkuberades under 10 minuter med eller utan Fentons reagens kompletterat med MP eller MPMC. Ett 198-bp-fragment amplifierades med hjälp av framåtriktade 5'-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3' och omvända 5'-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3'primrar. Med användning av 50 ng behandlat DNA, utfördes PCR-amplifiering efter nästa termocyklerare (94 grader i 5 minuter, följt av 25 cykler av denaturering, 30-talet vid 94 grader; hybridisering, 30 sekunder vid 60 grader; och förlängning, 30 sekunder vid 72 grader) för 25 cykler och 1 sista förlängningscykel vid 72 grader i 5 min. PCR-reaktionsproverna applicerades för agarosgelelektrofores (2 procent).

3.13.5. Genuttrycksprofilering med RT-qPCR

Analyser av genuttryck av nyckelpro- och anti-apoptotiska markörgener utfördes med HepG-2, MCF-7, Bj-1 och MCF-12F-celler exponerade för IC50 erhållna data (tabell 3) för 72 timmar. Kortfattat extraherades totalt RNA med användning av Total RNA Purification Kit (QIAGEN., Thorold, ON, Kanada) enligt tillverkarens instruktioner. cDNA

syntes utfördes såsom tidigare beskrivits av Aboul-Sound et al. [61]. Amplifieringsprogram och PCR-amplikonspecificitet utfördes och utvärderades med användning av en Rotor-Gene O 5-Plex HRM termisk cykler (Qiagen, Tyskland) med Quanti-Tect SYBR-Green PCR Kit (Qiagen, Tyskland) som tidigare dokumenterats följande standardprotokoll [61]. Följande primrar användes: Hs_P53_1 SG QuantiTect Primer Assay (QT00060235); Hs_CASP3_1_SG Quan-tiTect Primer Assay (QT00023947); B-cellslymfom 2 Hs_BCL2_1_SG QuantiTect Primer Assay (QT00025011);Bcl-2-liknande protein Hs_BAX_1_SG QuantiTect Primer Assay ( QT00031192); och 18S rDNA house-keeping (HK) gen Hs_RRN18S_1_SGQuantiTect Primer Assay(QT00199367). PCR termiskt cyklingsprogram och genuttrycksanalys för att bestämma veckförändringen i förhållande till 18S-genen utfördes i huvudsak som tidigare rapporterats [61].

3.14.Statistisk analys

De erhållna resultaten uttrycktes som medel ± standardavvikelse. Statistik erhölls med SPSSsoftware 11.5 (SPSS, Inc.Chicago, IL, USA). Duncans multipelområdestest användes för att bestämma de signifikanta skillnaderna mellan alla prover, och skillnaderna ansågs signifikanta vid p<>

4. Sammanfattningar

Sammanfattningsvis visade denna studie att blanda mjölkprotein medpolysackaridergenom differentiering av lösningens pH är en lämplig teknik för komplexbildning. De resulterande mjölkproteinslemkomplexen (MPMC) har betydligt högre fenol ochflavonoiderinnehåll än mjölkproteinet (MP). DSC-resultat visade att komplexbildningen av MP med polysackarider signifikant ökade den termiska stabiliteten med en förändring i denatureringstemperaturen. FTIR-analyser utfördes för att identifiera de funktionella grupperna och flödesbeteendet hos de preparerade komplexen undersöktes. WSI och WAI för mjölkprotein ökade genom komplexbildning med NabM eller IHM. TEM användes för att visualisera mikrostrukturen hos de beredda komplexen. Å andra sidan förväntas de resulterande mjölkproteinkomplexen med isabgol husk mucilage (HM) eller Nabeq mucilage (NabM) att överträffa de inhemska mjölkproteinerna i antioxidant- och anticancereffekten. Sammanfattningsvis uttryckte MPMC unika anticanceregenskaper mot modellbröstcancer- och leverkarcinomcellinjer (MCF7 respektive HEPG2) vilket bevisats av en neutral röd upptagsanalys.

MPMC förbättrade bådaantioxidantoch anti-spridningsaktivitet. Kaspaser är nyckelregulatorproteiner som är inblandade i apoptosinduktion. Uppreglering av kaspas 3-protein och mRNA-transkript (Figur 9A, B) kontrollerar andra proteiner i vägen för apoptos, vilket kännetecknas av kollapsen av mitokondriella membranet med Bax-inducerad cytokrom c-frisättning och aktivering av kaspas 9, vilket leder till efterföljande engagemang av kaspas 3. Uppreglering av Casp3, p53 och Bax, tillsammans med minskning av Bcl-2-uttryck avslöjade att MPMC-inducerad apoptosinduktion, där uppreglering av p53 kommer att stimulera uttryck av Bax, vilket i sin tur kommer att inducera cytokrom c release, följt av caspase-9 och-3 aktivering. Dessutom är Bcl-2 känt för att hämma frisättning av cytokrom c. I vår studie visades MPMC-inducerad Bcl-2-nedreglering underlätta obestridd Bax-inducerad cytokrom c-frisättning och efterföljande apoptos.

Anticancereffekten av protein-polysackaridkomplex ger ytterligare upplysning om tillämpbarheten av dessa komplex för att användas i utvecklingen av prisvärda och effektiva cancerterapier med minimala biverkningar.