Cistanche kan skydda njurischemi-reperfusionsskada

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Jan H. Lindeman1, Leonie G. Wijermars1, Sarantos Kostidis2, Oleg A. Mayboroda2, Amy C. Harms3, & et al.

Fördröjd graftfunktion är denmanifestation av ischemi reperfusionsskadai samband med njurtransplantation. Medan hundratals ingripandenframgångsrikt minska ischemi reperfusionsskadai experimentella modeller har alla kliniska ingrepp misslyckats. Denna explorativa kliniska utvärdering undersökte möjliga metaboliska ursprung för klinisk ischemi-reperfusionsskada genom att kombinera data från 18 vävnadsbiopsier före och efter reperfusion med 36 sekventiella arteriovenösa blodprover över transplantatet i tre studiegrupper. Dessa grupper inkluderade levande och avlidna donatortransplantat med och utan fördröjd transplantatfunktion. Gruppfördelningen baserades på kliniska resultat. Magisk vinkel NMR användes för vävnadsanalys och masspektrometribaserade plattformar användes för plasmaanalys. Alltnjurarfungerade i ett år. Integration av metabolomiska data identifierade en diskriminerande profil för att känna igen framtida fördröjd graftfunktion. Denna profil kännetecknades av post-reperfusion ATP/GTP-katabolism (signifikant försämrad fosfokreatinåtervinning och signifikant ihållande (hypo)xantinproduktion) och betydande pågående vävnadsskada. Misslyckad högenergifosfatåtervinning inträffade trots aktiverad glykolys, fettsyraoxidation, glutaminolys och autofagi, och relaterat till en defekt på nivån av oxoglutaratdehydrogenaskomplexet i Krebs-cykeln. Klinisk fördröjd graftfunktion på grund av ischemi-reperfusionsskada associerad med en metabolisk kollaps efter reperfusion. Således bör ansträngningar att släcka fördröjd transplantatfunktion på grund av ischemi-reperfusionsskada fokusera på att bevara metabolisk kompetens, antingen genom att bevara integriteten hos Krebs-cykeln och/eller genom att rekrytera metaboliska räddningsvägar. Kidney International (2020) 98, 1476–1488; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.07.026

SÖKORD: ATP; fördröjd graftfunktion; glykolys; ischemi reperfusionsskada; ämnesomsättning; oxidativ fosforylering

cistanche effekter: förhindraischemi-reperfusionsskada

ischemi reperfusionsskada (IRI)är fenomenet ökad vävnadsskada efter reperfusion av tidigare ischemisk vävnad.1,2 Det är den främsta bidragsgivaren till organskador efter hjärt- eller hjärninfarkt3 och transplantatskador efter organtransplantation.4 Även om otaliga ingrepp släcker IRI i prekliniska modeller, kvarstår klinisk framgång att uppnå.3,4 Det förefaller alltså en translationell klyfta mellan prekliniska modeller och det kliniska sammanhanget.

Fördröjd graftfunktion (DGF) är manifestationen av IRI i inställningen avnjuretransplantation.5 DGF definieras som behovet av dialys under den första veckan eller veckorna efter transplantationen.6 Även om DGF är extremt sällsynt i samband med transplantat av levande donatorer, påverkar det upp till 90 procent av avlidna donatortransplantationer.6 Föregående arbete visade ett samband mellan incident DGF och post-reperfusion normoxisk glykolys.7 Denna observation antyder att DGF relaterar till en defekt i transplantatenergihomeostas som ett resultat av mitokondriell dysfunktion i reperfusionsfasen.7 På grundval av detta antog vi att klinisk DGF involverar och kan drivas av en metabolisk defekt (eller defekter). Syftet med denna studie var att utföra en djupgående analys av metaboliska svar påischemi-reperfusionmed och utan IRI (DGF). Denna explorativa metaboliska utvärdering är baserad på ett integrerat, tidsbestämt tillvägagångssätt som involverade sekventiell bedömning av arteriovenösa koncentrationsskillnader (AV) över reperfunderade transplantat och parallell profifiing av transplantat (vävnads)biopsier. Tre studiegrupper inkluderades: transplantat från avlidna donatortransplantat med och utan senare IRI och levande donatortransplantat. Grupptilldelning av avlidna donatortransplantat (þDGF respektive –DGF) gjordes retrospektivt på grundval av deras kliniska resultat. Levande donatortransplantat inkluderades som referens eftersom dessa transplantat är associerade med en omedelbar funktionell återhämtning efter reperfusion. För att täcka de primära aspekterna av metabol homeostas låg fokus i denna studie på följande brutto metaboliska kluster: nukleotidtrifosfatmetabolism, fettsyra (b)-oxidation, glykolys/glutaminolys, autofagi, Krebs-cykel (defekter) och cellskador. Uppgifterna presenteras därefter.

(Korrespondens: Jan H. Lindeman, Department of Surgery, Leiden University Medical Center, PO Box 9600, 2300 RC Leiden, Nederländerna. E-post: Lindeman@lumc.nl Mottaget 20 januari 2020; reviderat 8 juni 2020; godkänt 2 juli 2020; publicerad online 8 augusti 2020)

cistanche effekter: förhindraischemi-reperfusionsskada

RESULTAT

Studieurvalet omfattade 53 patienter. Parade vävnadsbiopsier erhölls från 18 patienter och sekventiell AV-provtagning utfördes på 36 patienter. En patient fick båda biopsierna och genomgick AV-prov. Kliniska detaljer för de tre studiegrupperna visas i tilläggstabell S1A (vävnadsbiopsier) och S1B (AV-provtagning). Alla DGF-fall krävde flera dialyser under en tidsperiod på minst 7 dagar, och alla visade adekvat funktionell återhämtning. Ingen av de avlidna donatorerna utan DGF behövde dialys efter transplantation. Ett års transplantatöverlevnad var 100 procent.

Vi undersökte först förmodade skillnader i metaboliska signaturer för de tre givargrupperna (de levande [referens] donatortransplantaten, de –DGF avlidna donatortransplantaten och þDGF [IRI] avlidna donatortransplantaten) genom att kartlägga plasmametabolomen (AV-skillnader) för { {1}} minuter efter reperfusionstidpunkten (Figur 1a) ochvävnadsmetabolom(vävnadsbiopsier) under 40-minuterna efter reperfusionstidpunkten (Figur 1b). Dessa tidpunkter valdes för att undvika interferens från utsköljning av metaboliter som ackumulerades under ischemi eller kylförvaring, eller som var beståndsdelar i konserveringsvätskan (t.ex. histidinuttvättning från levande donatortransplantat; Kompletterande figur S1 visar den selektiva användningen av H [Histidin] TK-konserveringsvätska i dessa transplantat).7 Resultat (z-poäng) för dessa tidpunkter sammanfattas i värmekartorna i figur 1a (AV-skillnader) och 1b (vävnad). Gruppering av data utfördes enligt de 6 klustren som täcker alla metaboliska data: (i) nukleosidtrifosfatkatabolism, (ii) b-oxidation, (iii) glykolys/glutaminolys, (iv) autofagi, (v) Krebs-cykeldefekter, och (vi) cellskada.

Värmekartor för AV-skillnaderna indikerar parallella metaboliska signaturer för den levande donatorn och -DGF-transplantat och en tydligt distinkt signatur för þDGF-transplantat (Figur 1a). Ett liknande, men mindre uttalat, mönstret observerades för vävnadsmetaboliterna (Figur 1b). Exklusiv kartläggning av –DGF- och þDGF-transplantat (utan det levande donatortransplantatet) resulterade i liknande slutsatser (visas ej), vilket tyder på att inkluderingen av data från den levande donatorn (referens) i analysen inte störde analysens slutsatser. Sammantaget ger data en grov metabolisk signatur för renal IRI.

För tydlighetens skull presenteras data för de individuella metaboliterna i termer av de 6 metaboliska klustren. För att undvika störningar från den initiala utspolningen av metaboliter som har ackumulerats under kylförvaring inom de första minuterna av reperfusion, baseras uppskattningar för nettofrisättning eller -upptag efter perfusion på integreringen av AV-skillnader för 10-till {{3 }}minuters tidsintervall efter reperfusion (område mellan kurvorna).

Det första klustret av metaboliter ("nukleosidtrifosfatkatabolism") signalerar enihållande efterreperfusionmetabolisk inkompetens ("power shutdown") i transplantat med senare DGF (þDGF). Denna slutsats är baserad på försämrad återhämtning efter reperfusion av högenergifosfatbuffert fosfokreatin i þDGF-transplantat (P < 0.001;="" figur="" 2a),="" och="" genom="" ihållande="" post="" -reperfusion="" adenosintrifosfat/guanosintrifosfat="" (atp/gtp)="" katabolism.="" det="" senare="" återspeglas="" i="" den="" fortsatta="" frisättningen="" (av-skillnader)="" av="" hypoxantin="" och="" xantin="" (figur="" 2b="" och="" c,="" p="">< 0,0001="" respektive="" 0,02),="" de="" terminala="" nedbrytningsprodukterna="" av="" atp="" och="" gtp="" från="" dessa="" transplantat.="" data="" för="" pre-reperfusionsvävnadsbiopsier="" visade="" graderade="" grader="" av="" inosin-="" och="" hypoxantin-ackumulering="" vid="" slutet="" av="" ischemisk="" lagringsperiod,="" med="" det="" lägsta="" innehållet="" i="" levande="" och="" det="" högsta="" i="" avlidna="" donatortransplantat="" (figur="" 2d="" och="" e).="" post-reperfusion="" (t="" ¼="" 40="" min)="" innehållet="" av="" hypoxantin="" och="" inosinvävnad="" var="" likartat="" och="" lågt="" i="" alla="" 3="" givargrupper="" (figur="" 2d="" och="">

Post-reperfusion ATP-katabolism i þDGF-transplantat inträffade trots en uppenbar post-reperfusion restaurering av fettsyra b-oxidation (kompletterande figur S2), aktiverad glykolys / glutaminolys (figur 3) och autofagi (figur 4). Alla tre transplantattyperna visade enhetlig restaurering av vävnadens b-hydroxibutyratinnehåll (kompletterande figur S2A) och selektiv clearance (upptag) av medelkedjiga fettsyror (C8–C12) från cirkulationen (kompletterande figurer S1 och S2B–E), vilket indikerar enhetlig återinförande av b-oxidation. Vävnadsackumulering av acetylkarnitin i –DGF och þDGF avlidna donatortransplantat (kompletterande figur S2F) och utspolning (AV-skillnader) av acetylkarnitin från þDGF-transplantat (kompletterande figur S2G, P < 0.03)="" innebär="" emellertid="" graderade="" defekter="" i="" omhändertagandet="" av="" acetylgrupper="" som="" bildas="">

Cistanche ört

Kartläggning av glykolys/glutaminolysnätverk (Figur 3) visade lika vävnadsglukosnivåer (Figur 4a) och bekräftade ihållande normoxisk glykolys efter reperfusion som ett exklusivt kännetecken för þDGF-donatortransplantat (dvs. persistent laktat- och pyruvatfrisättning och P3b och P3b)<0.0001 and=""><0.04, respectively)="" and="" release="" of="" the="" transamination="" products="" alanine="" and="" aspartate="" (figure="" 3e="" and="" f,="" p="" <="" 0.02="" and="" <="" 0.0001,="" respectively).="" serine="" (figure="" 4b)="" and="" phosphoserine="" (supplementary="" figure="" 3d)="" released="" from="" þdgf="" grafts="" may="" (partially)="" reflflect="" transamination="" of="" the="" glycolysis="" intermediate="" phosphoglycerate.="" persistent="" post-reperfusion="" glutamate="" release="" (figure="" 3k,="" p="" <="" 0.002),="" selective="" release="" of="" the="" transamination="" products="" alanine="" and="" aspartate="" (figure="" 3e="" and="" f),="" and="" exhaustion="" of="" the="" tissue="" asparagine="" pool="" (figure="" 3j,="" p="" <="" 0.03)="" in="" þdgf="" grafts="" imply="" continued="" post-reperfusion="" glutaminolysis="" (alanine)="" and="" glutamine="" shuttling="" (asparagine="" aspartate)8="" in="" the="" post-reperfusion="" phase="" of="" these="" grafts.="" moreover,="" the="" exclusive="" release="" of="" serine,="" methionine,="" and="" tyrosine="" (figure="" 4a–c,="" all="" ps="" <="" 0.0005),="" along="" with="" disposal="" of="" butyryl="" carnitine="" and="" isovaleryl="" carnitine="" (figure="" 4d="" and="" e,="" p=""><0.006 and=""><0.003, respectively),="" deamination="" products="" of="" the="" branched-chain="" amino="" acids9,10="" from="" þdgf="" grafts,="" but="" not="" from="" the="" other="" graft="" types="" (figure="" 4a–e),="" implies="">efter reperfusionautofagi i dessa transplantat.11.

Figur 1|Klustrade värmekartor för koncentrationsskillnader i arteriell-venmetabolit över donatortransplantatet vid 30 minuter och vävnadsmetabolitinnehåll 40 minuter efter reperfusion. (a) Klustrad värmekarta för de arteriell-venösa metabolitkoncentrationerna vid t ¼ 30 minuter efter reperfusion. Kolumnerna representerar de 3 donatorgrupperna (levande donatortransplantat [referensgrupp, n ¼ 10]; avlidna donatortransplantat utan senare fördröjd transplantatfunktion [DGF {–DGF, n ¼ 10}], och avlidna donatortransplantat med senare DGF [þDGF, n ¼ 16]). Föreningar grupperas enligt de 5 metaboliska klustren och, inom varje kluster, rankas baserat på z-poängen för den levande donatorgruppen. Grönt reflekterar nettoupptaget av transplantatet och rött reflekterar nettofrisättningen från transplantatet. (Fortsatt)

Figur 1 (Fortsättning) (b) Klustrad värmekarta för vävnadsmetaboliter identifierade i den HR magiska vinkeln kärnmagnetisk resonansanalys av transplantatbiopsier tagna 40 minuter efter reperfusion. Kolumnerna representerar de 3 givargrupperna (levande donatorgrupp [referensgrupp, n ¼ 6, avlidna donatortransplantat utan senare DGF [–DGF, n ¼ 6], och avlidna donatortransplantat med senare DGF [þDGF, n ¼ 6]). Rött reflekterar ett vävnadsinnehåll ovanför och grönt reflekterar ett vävnadsinnehåll under det geometriska medelvärdet för de tre grupperna.

Acetylkarnitinackumulering (vävnad) efter reperfusion i –DGF- och þDGF-transplantat (Figur 2f) och initial (levande donator- och –DGF-transplantat) och fortsatt (þDGF-transplantat) acetylkarnitinfrisättning (P < 0).{{10="" }}3)="" indikerar="" en="" övergående="" (–dgf-transplantat)="" eller="" ihållande="" (þdgf-transplantat)="" försämrad="" acetyl-koenzym="" a-avfallshantering="" efter="" reperfusion="" (kompletterande="" figur="" 2g).="" även="" om="" denna="" ackumulering="" kan="" bero="" på="" överdriven="" glykolys="" och="" b-oxidation,="" kan="" det="" också="" indikera="" försämrad="" acetylavfall="" som="" ett="" resultat="" av="" krebs-cykeldefekter.="" för="" þdgf-transplantat="" stöds="" den="" senare="" mekanismen="" av="" den="" selektiva="" och="" ihållande="" frisättningen="" av="" krebs-cykelns="" intermediära="" a-ketoglutarat="" (figur="" 5c,="" p="">< 0,0005)="" som="" en="" exklusiv="" egenskap="" i="" dessa="" transplantat="" och="" av="" en="" försämrad="" återhämtning="" av="" vävnadssuccinat="" i="" þdgf-transplantaten="" (figur="">

Ett sista kluster av diskriminerande metaboliter relaterar till pågående cellskador. Detta kluster inkluderarefter reperfusionfrisättning av uracil, en etablerad markör för cellskada12,13 (kompletterande figur S3A, P < 0.0001)="" och="" av="" aminosyraderivat="" som="" associerar="" med="" hydrolysen="" av="" plasmalogener="" (dvs.="" fosfo-etanolamin,="" etanolamin="" och="" fosfo-serin;="" tilläggsfigur="" s3bd,="" p="">< 0.001;="" kompletterande="" figur="" s1).="" även="" om="" inga="" av-skillnader="" var="" närvarande="" för="" kolin="" i="" þdgf-gruppen="" (p="" ¼="" 0,60),="" står="" denna="" observation="" i="" kontrast="" till="" ett="" nettokolinupptag="" i="" den="" levande="" donatorn="" och="" -dgf-gruppen="" (p="">< 0,0001="" respektive="" 0,02).="" följaktligen,="" i="" þdgf-transplantat,="" kan="" hydrolys="" av="" kolinplasmalogener="" maskeras="" av="" kolinupptag.="" en="" sådan="" mekanism="" stöds="" av="" den="" selektiva="" och="" progressiva="" frisättningen="" av="" betain,="" oxidationsprodukten="" av="" kolin14="" i="" þdgf-gruppen="" (kompletterande="" figurer="" s3g,="" p=""><>

De föregående observationerna associerar incident IRI med persistentefter reperfusionATP-katabolism och pågående cellskador i samband med mitokondriell misslyckande och aktivering av glykolytiska och lipolytiska vägar (Figur 6). Med tanke på ATP:s vitala roll i cellulär homeostas och överlevnad, resonerades det att rekrytering av extra ATP-regenerativa vägar (dvs. oberoende av mitokondriell andning) skulle vara fördelaktigt. I detta sammanhang övervägde vi inosin, en nukleosid som kan generera ATP genom otraditionella vägar. Såsom visas i figur 7 räddade varken förebyggande eller räddande inosintillförsel (i koncentrationer upp till 10 mMol/l) ATP-utmattning efter kemiskt inducerad metabol förlamning.

Figur 3|Post-reperfusion glykolys och glutaminolys. Kurvor för de arteriella venösa skillnaderna (röd kurva är arteriell, den blå kurvan är venös). Vävnadsbiopsier (stapeldiagram): vita staplar representerar biopsier före reperfusion; Grå staplar representerar post-reperfusionsbiopsier (t ¼ 40 min efter reperfusion). *P < 0,05.="" (a)="" vävnadsglukosinnehåll.="" (b–i)="" glykolysintermediärer:="" laktat,="" pyruvat,="" alanin,="" aspartat="" och="" asparagin.="" (k,l).="" glutaminolys="" mellanprodukter="" glutamin="" och="" glutamat.="" vävnadskärnmagnetisk="" resonans="" (nmr;="" n="" ¼="" 6="" per="" grupp):="" (a)="" vävnadsglukosåtervinning="" i="" den="" levande="" donatorn.="" (d,="" f,="" h)="" stabilt="" laktat-,="" alanin-="" och="" aspartatvävnadsinnehåll="" reflekterar="" utspolning="" av="" dessa="" intermediärer="">

Figur 3 (fortsättning) från njuren. (j) Omätbar vävnadsasparagin i þ fördröjd graftfunktion (DFG) post-reperfusionsbiopsier. Arteriell-venösa (AV) koncentrationsskillnader (n ¼ 10, 10 och 16 i de levande, –DGF- respektive þDGF-grupperna): (b,c) ihållande laktat efter reperfusion (P < 0.0001)="" och="" pyruvat="" (p="">< 0,04)="" frigörs="" från="" dessa="" transplantat.="" (e)="" alanin="" (p="">< 0,02),="" (g)="" asparaginsyra="" (p="">< 0,0001)="" och="" (þk)="" glutamatfrisättning="" (fördröjd="" graftfunktion="" (dgf-transplantat="" som="" indikerar="" normoxisk="" glykolys="" i="" p="">< 0,002)="" från="" þdgf-transplantat="" indikerar="" pågående="" glutaminoxidation="" i="" dessa="" transplantat="" inga="" signifikanta="" av-skillnader="" observerades="" för="" glutamin="">

cistanche effekter: förhindranjursjukdomar

DISKUSSION

Från denna studie, utförd i samband med klinisk njurtransplantation, framträder bilden av att IRI (DGF) är en konsekvens av ett nästan omedelbart och ihållande post-reperfusionsfel av oxidativ fosforylering och aktiverad normoxisk glykolys som inte kan upprätthålla energihomeostas. I sin tur töms högenergifosfatpooler gradvis ut, och cellulär integritet kan inte bevaras, vilket resulterar i pågående vävnadsskada.

Denna kliniska studie är baserad på integreringen av metaboliska data från vävnadsbiopsier tagna omedelbart före och 40 minuter efter reperfusion och från sekventiell bedömning av AV-skillnader över det reperfunderade transplantatet. Dessa AV-skillnader ger inte bara en indikation för takten och varaktigheten av metaboliska (mal)anpassningar utan möjliggör också styrande trender som observerats i de parade vävnadsbiopsierna och för uppskattning av metabolitclearance av (t.ex. laktat) eller upptag från (t.ex. medium) -kedjade fettsyror) cirkulationen.15,16 Upplösningen av AV-metoden illustreras tydligt av acylkarnitindata, som inte bara visar selektivt upptag av medelkedjiga fettsyror utan också tyder på att de omättade C14-karnitinarterna tetradecenoyl och tetradekadienylkarnitin beter sig på samma sätt som medelkedjiga fettsyror (Supplementary Data S1) och kanske inte förlitar sig på specifika fettsyratransportörer.17 I själva verket observerades det i processen för dataanalys att enbart beroende av vävnadsbiopsier skulle ha skymt de flesta slutsatserna i denna studie eftersom majoriteten av bildade metaboliter rensas effektivt ut i cirkulationen. Stabila arteriella blodkoncentrationer visar att blodhomeostas upprätthålls, och följaktligen kasseras eller fylls på med metaboliter som frigörs eller absorberas på ett effektivt sätt någon annanstans.15,16 Observerade stabila vävnadsinnehåll, men tydliga AV-skillnader utmanar giltigheten av vävnadsbaserade metabolomiska utvärderingar. Observera att i samband med avlidna donatornjurar och tidsramen för studien är urinclearance inte en störande faktor eftersom alla avlidna donatortransplantat var anuriska under mätintervallet för 40- minuter.

Kartläggning av data identifierar ett metaboliskt fotavtryck som är helt diskriminerande för IRI. Närmare bestämt kännetecknas reperfusionsfasen av transplantat med framtida DGF enhetligt och distinkt av kraftigt försämrad oxidativ fosforylering (histotoxisk hypoxi)18 och kompensatorisk normoxisk glykolys som inte kan upprätthålla ATP-regenerering. Den senare slutsatsen är baserad på den ofullständiga återvinningen av högenergifosfatbufferten fosfokreatin19 och på ihållande ATP/GTP-katabolism efter reperfusion som återspeglas av fortsatt (hypo)xantinfrisättning. Faktum är att approximation av adenosinförluster för þDGF-transplantat baserat på hypoxantinfrisättning (AV-skillnader) under 30 minuter efter reperfusion (approximation baserat på rapporterade flödeshastigheter efter reperfusion, 20 i genomsnittnjurvävnadmassa,21 och njur-ATP-innehåll22) tyder på nära utmattning av graft-ATP-poolen 30 minuterefter reperfusion. Kritisk utmattning av ATP-poolen kan resultera i en katabolisk låsning som gör att cellen inte reagerar på återupprättandet av de protonmotoriska krafterna som driver ATP-genereringen, vilket gör att cellen inte svarar på räddningsstrategier.

ATP-underskottet efter reperfusion och histotoxisk hypoxi i þDGF-transplantat kan ligga bakom den selektiva frisättningen av aminosyror associerade med hydrolysen av fosfolipider (plasmalogener) i þDGF-transplantat. Experimentella studier identifierade hydrolys av plasmalogener och fosfolipider som ett tidigt kännetecken för vävnadshypoxi,23 och hydrolys av plasmalogener har beskrivits i samband med ischemisk njurskada.24 Mekanistiskt har detta fenomen kopplats till membrantranslokation och aktivering av en cytosolisk kalcium- oberoende fosfolipas A2 till följd av hypoxidriven komplexbildning mellan fosfolipas och ett fosfofruktokinasregulatoriskt element.25,26 Omkastning av hypoxi eller ATP-behandling dissocierar fosfolipas-fosfofruktokinaskomplexet och tar bort fosfolipasaktivitet. Observera att dynamiken i post-reperfusionsupphörande av (fosfo-) etanolaminfrisättning från levande donator och -DGF-transplantat, såväl som ihållande frisättning i þDGF-transplantat, kan återspegla olika grader och hastigheter av metabolisk återhämtning. Men medan tidigare rapporter antyder en roll av ett cytosoliskt kalciumoberoende fosfolipas A2,25,26, har observerade AV-skillnader för betain och (fosfo-)etanolamin antydt en mer omfattande aktivering av fosfolipaser som också involverar typ C-fosfolipaser (fosfo-etanolamin) och D-fosfolipaser (etanolamin/kolin). På liknande sätt kan utarmning av vävnadsasparagin (Figur 4j) och frisättning av aspartat (Figur 4g) från þDGF-transplantat återspegla försämrad asparaginsyntasaktivitet på grund av ATP-utarmning.

Figur 4|Aktiverad autofagi efter reperfusion i D-transplantat med fördröjd graftfunktion (DGF).. Kurvor för de arteriell-venösa skillnaderna (röd kurva är arteriell, den blå kurvan är venös). Vävnadsbiopsier (stapeldiagram): vita staplar representerar biopsier före reperfusion; Grå staplar representerar biopsier efter reperfusion (t ¼ 4 0 min efter reperfusion). *P < 0,05.="" (a–c)="" frisättning="" efter="" reperfusion="" av="" metionin,="" serin="" och="" tyrosin="">

Figur 5|Post-reperfusion Krebs-cykeldefekt i transplantat med framtida fördröjd transplantatfunktion (DGF). Kurvor för skillnader i arteriell-venös koncentration (AV) (röd kurva är arteriell, blå kurva är venös). Vävnadsbiopsier (stapeldiagram): vita staplar representerar biopsier före reperfusion; Grå staplar representerar post-reperfusionsbiopsier (t ¼ 4 0 min efter reperfusion). *P < {{10}}.05.="" (a–h)="" av-skillnader="" för="" krebs-cykelintermediärerna="" (n="" ¼="" 10,="" 10="" och="" 16="" i="" de="" levande,="" -dgf-="" respektive="" þdgf-grupperna):="" ihållande="" frisättning="" av="" a-ketoglutarat="" (från="" þdgf-transplantat;="" p="">< 0,001)="" .="" (e,g)="" frånvarande="" post-reperfusionsvävnadssuccinatåtervinning="" i="" þdgf-transplantat="" (p=""><>

Post-reperfusion ATP-katabolism i þDGF-transplantat inträffade trots omfattande aktivering av katabola vägar: glykolys, b-oxidation av medelkedjiga fettsyror (likformigt aktiverad i alla transplantattyper), glutaminolys (även tillfälligt aktiverad vid reperfusion i levande donator och –DGF-transplantat ), och aktiverade autofagi. Faktum är att post-reperfusionsfrisättning av isovaleryl- och butyrylkarnitin, deamineringsprodukter av de grenkedjiga aminosyrorna isoleucin och leucin,11 identifierades som diskriminerande biomarkörer för framtida DGF.

Ihållande frisättning av acetylkarnitin och pyruvat från þDGF-transplantat visar att flflöden skapade av de aktiverade katabola vägarna översteg den oxidativa kapaciteten. Frisättning av ketoglutarat efter reperfusion, nettoupptag av dess prekursors citrat och isocitrat från cirkulationen och sviktande återhämtning av vävnadssuccinat innebär att den försämrade oxidativa fosforyleringen innebär en defekt på nivån av oxoglutaratdehydrogenaskomplexet. Specifikt indikerar inte det observerade metaboliska fotavtrycket och tidsramen för de metabola störningarna en roll för omvänd styrbarhet av Krebs-cykeln27,28 vid ihållande metabolisk dysreglering, vilket ger ytterligare bevis för att den observerade mekanismen för IRI hos gnagare28 inte helt översätts till människan. sammanhang.29.

Nedsatt oxoglutaratdehydrogenasaktivitet kan orsakas av ischemirelaterade skador på komplexet30 men kan också involvera, eller överdrivas av, nedsattefter reperfusionNedsatt oxoglutaratdehydrogenasaktivitet kan orsakas av ischemirelaterade skador på komplexet30 men kan också involvera, eller överdrivas av, försämrad tillgänglighet efter reperfusion av dess kofaktorer acetyl-koenzym A, FADþ och NADþ. 31 För þDGF-transplantat kan sådana brister uppstå på grund av acetyl-koenzym A-utspolning efter reperfusion och en försämrad cellulär redoxstatus (reduktiv stress med försämrad NADþ-tillgänglighet), en uppfattning som stöds av det låga laktat-till-pyruvat-förhållandet i þDGF-transplantat. 32.

Detta metaboliska tillvägagångssätt tillåter inte utvärdering av andningskedjans inblandning. Vi har dock tidigare identifierat ischemi-reperfusionsrelaterade defekter i både andningskomplex I och II.7,29 På basis av data i denna studie och tidigare mitokondriellt arbete framträder en bild av att klinisk renal IRI är en konsekvens av en primär (eller framkallande) förolämpning(er) mot mitokondriella Krebs cykel-redox-skyttel som inträffar före eller inom de första minuterna av reperfusion. Misslyckande med att återställa ATP-nivåer resulterar i ihållande och omfattande aktivering av katabola vägar, vilket vidmakthåller energikrisen genom att successivt uttömma den cellulära NADþ- och FADþ-poolen (reduktiv stress).33 I detta specifika sammanhang med misslyckad mitokondriell andning, kan purininosinet vara fördelaktigt. . Till skillnad från adenosin är 34-inosin stabil i plasma; det har identifierats som en alternativ källa till ATP i obligatoriska glykolytiska celler (dvs. celler som saknar mitokondrier) såsom erytrocyter35 och i hypoxiska njurceller36 och är utmattad efter reperfusion. Tyvärr räddade inte inosintillskott cellulär ATP-utarmning efter en påtvingad metabolisk avstängning, vilket lämnade lite utrymme för metaboliska räddningsstrategier som syftade till att släcka IRI, vilket betonade beroendet av förebyggande strategier för att begränsa IRI.

Tonify njure cistanche

Det finns begränsningar för denna studie. På grund av ett stort antal jämförelser är potentialen för signifikanta fynd på grund av slumpmässiga slumpmässiga slumpmässiga förhållanden hög. Även om våra slutsatser stöds av sunda biologiska samband, kan resultaten förvirras av frågor relaterade till flera jämförelser.

En ytterligare begränsning är att studien baseras på kliniska prover; som sådan var klämmfrysning som krävs för direkt bedömning av ATP och redoxstatus inte möjlig. Eftersom den observerade metabolomen är tydligt skild från den som rapporterats i djurmodeller och den återspeglar ett systemfel, kunde vi inte utföra mer detaljerade utvärderingar i djurmodeller eller ex vivo-system som respirometrisystemet. Resultaten i denna studie är förnjure; sålunda kan slutsatserna för andra organ vara annorlunda. Den relativt höga givaråldern i denna studie är en återspegling av givarpopulationen i Nederländerna. Viktigt är att 10-årstransplantationsresultaten för Nederländerna är minst lika med länder med yngre donatorer, såsom USA.37 Som väntat var majoriteten av þDGF-fallen DCD-transplantat. Vi märkte liknandemetaboliska profilerför DBD- och DCD-transplantat; kraften i denna explorativa studie är uppenbarligen för låg för att upptäcka subtila skillnader mellan dessa 2 donatortyper.

Figur 7|Både förebyggande och räddande inosinbehandling lyckas inte återställa nivåerna av adenosintrifosfat (ATP). PK-1 njurcellinjen transfekterades stabilt med PercevalHR flfluorescerande biosensor av ATP-till-adenosin difosfat (ADP) förhållande.

Kemiskt inducerad metabolisk förlamning inducerades genom tillsats av rotenon/aktinomycin/2-deoxiglukos, och ATP-till-ADP-förhållandet (relativ fluorescens) övervakades. Brun, kontroll; svart, metabolisk förlamningskontroll; grön, förebyggande inosinbehandling (10 mMol/l); röd, inosinräddning vid t ¼ 15 minuter efter induktionen av en metabolisk förlamning.

Sammanfattningsvis visar denna studie att klinisk renal IRI föregås av en nästan momentan metabolisk kollaps och en åtföljande högenergifosfatkris. Detta djupa och ihållande metaboliska underskott och dess omedelbara natur (och därav följande minimala fönster av terapeutiska möjligheter) kommer att störa varje farmaceutisk intervention som är beroende av tillgängligheten av ATP. Detta kan förklara den dåliga översättningsbarheten av prekliniska fynd till den kliniska miljön.2–4 Den observerade metabolomen för klinisk DGF står i skarp kontrast till rapporterade metaboliska svar för råttor, 28 möss, 38 och grisar 39,40 som alla indikerar återupprättande av oxidativ fosforylering inom minuter av reperfusion. Detta kan relatera till grundläggande skillnader i mitokondriell eller metabolisk fysiologi mellan gnagare och större däggdjur (t.ex. sker inte ischemi-inducerad succinatackumulering i mänskliga donatornjurar).29 I detta sammanhang är det viktigt att påpeka att alla transplanterade njurar är exponerade. tillischemi reperfusionoch att endast en undergrupp av grafts de velops IRI (DGF). Grupptilldelning (þDGF eller –DGF) i denna studie utfördes retrospektivt, och därför skiljer den mellan ischemi-reperfusion och IRI. Det kan inte uteslutas att ischemi-reperfusionen i experimentmodeller28,38–40 är otillräcklig för att utlösa IRI.

Trots den allvarliga skadan, återhämtade sig alla þDGF-transplantat till slut, vilket innebär en anmärkningsvärd återhämtningspotential förutsatt att överbryggande ingrepp (t.ex. dialys) är tillgängliga. Det bör noteras att även om liknande metabolomer för DGF i transplantat härrörande från donatorer som avlidit efter hjärndöd eller hjärtdöd innebär en enhetlig mekanism, finns det en kontrasterande inverkan av DGF på långtidstransplantatöverlevnaden för de två donatortyperna.41 I själva verket, även om DGF tydligt påverkar överlevnaden av transplantat från donatorer som avlidit efter hjärndöd, det gör det inte i sådana transplantat från hjärtdonatorer. Denna kontrast tycks återspegla en överlägsen återhämtningspotential för transplantat från hjärtdödsgivare.41

METODER

Den medicinska etiska kommittén vid Leiden University Medical Center godkände studieprotokollet. Skriftligt informerat samtycke erhölls från varje patient. Denna singelcenterstudie inkluderade 53 patienter som genomgicknjuretransplantation: 37 genomgick en avliden donatortransplantation och 16 en levande donator. På basis av kliniskt utfall (DGF) tilldelades mottagare av avlidna donatortransplantat en þDGF-grupp (n ¼ 16) eller -DGF-grupp (n ¼ 10). DGF definierades av behovet av dialys under den första veckan efter transplantation.6

Studien är baserad på en integrering av metabolomikdata som erhållits från sekventiell arteriovenös (AV) blodprovtagning under första halvtimmen av reperfusion, och från parade vävnadsbiopsier insamlade omedelbart före och 40 minuter efter

reperfusion.

Sekventiell AV-blodprovtagning över transplantatet utfördes hos 36 patienter (kompletterande tabell S1A). Njurvensblodprover togs vid 30 s och 3, 5, 10, 20 och 30 minuter och arteriella prover vid 0, 10 och 30 minuter efter reperfusion.42 Parade njurar före och efter reperfusion biopsier erhölls omedelbart före och 40 minuter efter reperfusion från 6 levande och 12 avlidna donatortransplantat (kompletterande tabell S1B; 1 patient fick både biopsier och AV-prov).

Målinriktade metabolomiska analyser utfördes med hjälp av standardoperationsprocedurer med etablerade masspektrometribaserade plattformar eller magisk vinkel kärnmagnetisk resonans (vävnadsbiopsier).43 Metaboliter som täcks av plattformarna sammanfattas i tilläggstabell S1.

Potentialen hos inosin att rädda det metabola underskottet under en metabol kollaps testades i den proximala tubulicellinjen (LLC PK1) stabilt transfekterad med PercevalHR flfluorescerande ATP adenosindifosfatbiosensor.44.

När det gäller statistik konstruerades värmekartor på basis av z-poäng för varjemetabolit. Inom gruppförändringar i vävnadsmetabolitinnehåll testades med Mann-Whitney-testet och skillnader mellan grupper med Wilcoxon-testet. AV-skillnader uppskattades med hjälp av en linjär blandad modell. Korrigering för flera tester utfördes inte eftersom alla observationer var en del av teoretiska nätverk. Detaljer om patienter och metoder finns i de kompletterande metoderna.

cistancheextrakt

AVSLÖJANDE

Alla författare deklarerade inga konkurrerande intressen.

TACK

Kärnanläggningen för magnetisk resonans finansieras av Medicinska fakulteten vid NTNU Trondheim, Norge. Denna studie finansierades delvis av Dutch Kidney Foundation (Metabolic Salvage Strategies to Improve Transplant Outcome, project17O/11).

EXTRAMATERIAL

Kompletterande fil (PDF)

Kompletterande patienter och metoder.

Tabell S1. Patient- och transplantationsegenskaper för de procedurer där parade vävnadsbiopsier samlades in (A) och där AV-provtagning utfördes (B).

Tabell S2. Plattformar och deras metaboliter används för AV-prover.

Figur S1. Fullständig metabolomisk data.

Figur S2. Återinförande av b-oxidation (medelkedjiga fettsyror) efter reperfusion.

Bild S3. Selektiv och ihållande post-reperfusion tvättning av uracil och fosfolipid (plasmalogen) associerade aminosyror från transplantat med framtida DGF.

Datatillägg 1. Rå AV-data för acetylkarnitin, organiska syror och aminosyraplattformar.

Datatillägg 2. Rå AV-data för purin- och pyrimidinplattformen.

REFERENSER

1. Gutteridge JMC, Halliwell B. Reaktiva arter i sjukdom: vänner eller fiender? I: Halliwell B, Gutteridge JMC, red. Fria radikaler i biologi och medicin. Oxford, Storbritannien: Oxford University Press; 2015:511–638.

2. Davidson SM, Ferdinandy P, Andreou I, et al. Multitarget-strategier för att minska myokardischemi/reperfusionsskada: veckans JACC-översiktsämne. J Am Coll Cardiol. 2019;73:89–99.

3. Lefer DJ, Bolli R. Utveckling av ett NIH-konsortium för preklinisk bedömning av hjärtskyddande terapier (CAESAR): ett paradigmskifte i studier av begränsning av infarktstorlek. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2011;16:332–339.

4. Cavaillé-Coll M, Bala S, Velidedeoglu E, et al. Sammanfattning av FDA-workshop om ischemi-reperfusionsskada vid njurtransplantation. Am J Transplantation. 2013;13:1134–1148.

5. Schröppel B, Legendre C. Fördröjd njurtransplantatfunktion: från mekanism till översättning. Kidney Int. 2014;86:251–258.

6. Mallon DH, Summers DM, Bradley JA, et al. Definiera fördröjd graftfunktion efter njurtransplantation: enklast är bäst. Transplantation. 2013;96:885–889.

7. Wijermars LG, Schaapherder AF, de Vries DK, et al. Defekt postreperfusion metabolisk återhämtning associeras direkt med incident fördröjd transplantatfunktion. Kidney Int. 2016;90:181–191.

8. Zhang J, Fan J, Venneti S, et al. Asparagin spelar en avgörande roll för att reglera cellulär anpassning till glutaminutarmning. Mol Cell. 2014;56: 205–218.

9. Holecek M. Relation mellan glutamin, grenkedjiga aminosyror och proteinmetabolism. Näring. 2002;18:130–133.

10. Newgard CB, An J, Bain JR, et al. En grenad aminosyrarelaterad metabolisk signatur som skiljer överviktiga och magra människor och bidrar till insulinresistens. Cell Metab. 2009;9:311–326.

11. Drake KJ, Sidorov VY, McGuinness OP, et al. Aminosyror som metaboliska substrat under hjärtischemi. Exp Biol Med (Maywood). 2012;237: 1369–1378.

12. De Jong JW, Huizer T, Janssen M, et al. Högenergifosfater och deras kataboliter. I: Piper HM, Preusse CJ, red. Ischemi-reperfusion vid hjärtkirurgi. Dordrecht, Nederländerna: Springer; 1993:295–315.

13. van Os S, de Abreu R, Hopman J, et al. Purin- och pyrimidinmetabolism och elektrokortikal hjärnaktivitet under hypoxemi hos lamm på kort sikt. Pediatr Res. 2004;55:1018–1025.

14. Blom HJ, De Vriese AS. Varför ökar homocysteinnivåerna vid njursvikt? Ett metaboliskt tillvägagångssätt. J Lab Clin Med. 2002;139:262–268.

15. Ivanisevic J, Elias D, Deguchi H, et al. Arteriovenös blodmetabolomik: en avläsning av intravävnadsmetabostas. Sci Rep. 2015;5:12757.

16. Jang C, Hui S, Zeng X, et al. Metabolitutbyte mellan däggdjursorgan kvantifierat hos grisar. Cell Metab. 2019;30:594–606.

17. Bremer J. Karnitin-metabolism och funktioner. Physiol Rev. 1983;63: 1420–1466.

18. Siggaard-Andersen O, Fogh-Andersen N, Gøthgen IH, Larsen VH. Syrestatus för arteriellt och blandat venöst blod. Crit Care Med. 1995;23:1284–1293.

19. Stoica SC. Högenergifosfater och det mänskliga donatorhjärtat. J Hjärtlungtransplantation. 2004;23:S244–S246.

20. Lisik W, Gontarczyk G, Kosieradzki M, et al. Intraoperativa blodflödesmätningar i organallotransplantat kan förutsäga postoperativ funktion. Transplantation Proc. 2007;39:371–372.

21. Molina DK, DiMaio VJ. Normal organvikt hos män: del II – hjärnan, lungorna, levern, mjälten och njurarna. Am J Forensic Med Pathol. 2012;33:368–372.

22. Hems DA, Brosnan JT. Effekter av ischemi på innehållet av metaboliter i råttlever och njure in vivo. Biochem J. 1970;120:105-111.

23. De Medio GE, Goracci G, Horrocks LA, et al. Effekten av övergående ischemi på fettsyra- och lipidmetabolismen i gerbilhjärnan. Ital J Biochem. 1980;29:412–432.

24. Rao S, Walters KB, Wilson L, et al. Tidiga lipidförändringar vid akut njurskada med hjälp av SWATH lipidomics i kombination med MALDI-vävnadsavbildning. Am J Physiol Renal Physiol. 2016;310:F1136–F1147.

25. Portilla D, Shah SV, Lehman PA, et al. Roll av cytosoliskt kalciumoberoende plasmalogenselektivt fosfolipas A2 vid hypoxisk skada på kaninproximala tubuli. J Clin Invest. 1994;93:1609-1615.

26. Hazen SL, Wolf MJ, Ford DA, Gross RW. Den snabba och reversibla associationen av fosfofruktokinas med myokardmembran under myokardischemi. FEBS Lett. 1994;339:213–216.

27. Chinopoulos C. Vilken väg vänder citronsyracykeln under hypoxi? Den kritiska rollen för a-ketoglutaratdehydrogenaskomplex. J Neurosci Res. 2013;91:1030–1043.

28. Chouchani ET, Pell VR, Gaude E, et al. Ischemisk ackumulering av succinat kontrollerar reperfusionsskada genom mitokondriell ROS. Natur. 2014;515:431–435.

29. Wijermars LG, Schaapherder AF, Kostidis S, et al. Succinatackumulering och ischemi-reperfusionsskada: av möss men inte män, en studie i njurischemi-reperfusion. Am J Transplantation. 2016;16:2741–2746.

30. Tretter L, Adam-Vizi V. Alfa-ketoglutaratdehydrogenas: ett mål och generator av oxidativ stress. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2005;360: 2335–2345.

31. Heikal AA. Intracellulära coenzymer som naturliga biomarkörer för metaboliska aktiviteter och mitokondriella anomalier. Biomark Med. 2010;4:241–263.

32. Sun F, Dai C, Xie J, et al. Biokemiska problem vid uppskattning av cytosoliskt fritt NAD/NADH-förhållande. PLoS One. 2012;7:e34525.

    ---